כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת ולאפיין את פרופיל הגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות חישש פולס התנגדותי הניתן לכיוונון. הגישה הסטנדרטית היא להשוות מדידות של חסימת זרם שנלקחו משלפוחיות חוץ-תאיות מופרדות לאלו שנלקחו מסטנדרטים של חרוזי פוליסטירן. גישה שנייה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות היא הוספת חרוזי פוליסטירן לדגימה, שיטה המשמשת בעבודה עם דגימות מורכבות כגון שלפוחיות חוץ-תאיות שאינן מופרדות.

בתווך גידול תאים, הנתונים המתקבלים מאפיינים את הגודל ואת מספר השקיקים החוץ-תאיים, בין אם הם מופקים וטהורים ובין אם אינם כאלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון western blotting או ציטומטריה של זרימה של שקיקים חוץ-תאיים הקשורים לחרוזי לטקס, הוא ששיטה זו מאפיינת חלקיקים ישירות בנוזלים ביולוגיים ללא צורך בבידוד פיזי או בסימון.

בעת ניסיון לזהות שלפוחיות קטנות יותר, שלפוחיות גדולות יותר עלולות לסתום את הננו-נקב. הוספנו לפרוטוקול מספר טיפים וטריקים מעשיים כדי לחזור במהירות לתנאי עבודה תקינים. ניסינו להפחית את ייצור השלפוחיות החוץ-תאיות והסייגנו שיטות לכמות ריכוז השלפוחיות בתרבית תאים.Snet.

בחיפוש אחר שיטות לאפיון ננו-חלקיקים, נחשפנו ל-TRPS והתאמנו את הפרוטוקולים שלו כדי שיהיו מתאימים יותר לאפיון של sles ותרביות תאים, תעלילי-על (supernatants) ונוזלים ביולוגיים אחרים. התחילו בחיבור מכשיר ה-TRPS למחשב שמותקנת עליו תוכנת ה-eyes on control suite. הקפידו לצמצם הפרעות חשמליות כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב.

כעת, בחרו את גודל הננו-נקב (Nanopore). NP 100 הוא הבחירה הטובה ביותר עבור וסיקולות בגודל 70 עד 200 ננומטר, בעוד שניתן להשתמש ב-NP 150 עבור וסיקולות בגודל 85 עד 300 ננומטר. NP 200 מתאים יותר למדידת וסיקולות בגודל 100 עד 400 ננומטר.

לאחר מכן, בחרו את חלקיקי כיול הפוליסטירן המשלימים עבור ה-NP 100 וה-NP 150; בחרו חלקיקי כיול CPC 100 עבור ה-NP 200. השתמשו בחלקיקי כיול CPC 200. ערבבו את חלקיקי הכיול ב-Vortex למשך 30 שניות.

אם הם עדיין מצומצמים, השתמשו בסוניקציה ולאחר מכן דללו את חלקיקי הכיול ב-PBS לריכוז המטרה. בהתבסס על גודל הננו-נקב, הנפח הסופי חייב להיות לפחות 40 µl. כעת הרטיבו את תא הנוזלים התחתון של המכשיר על ידי הוספת 78 µl של PBS והסרה מיידית שלו.

פעולה זו מפחיתה את הסיכון להיווצרות בועות מתחת לננופור (nanopore). לאחר מכן, מקמו את הננופור בין זרועות המכשיר. מדדו את המרחק בין שתי הזרועות הנגדיות באמצעות קליבר דיגיטלי.

הזינו ערך זה לתוכנה בשדה שנקרא stretch, ולאחר ההזנה, לחצו על calibrate stretch באמצעות הגלגל הצדדי השולט במרחק בין הזרועות הנגדיות. מתחו את הננופור ל-47 millimeters. לאחר המתיחה לגודל הרצוי, הוסיפו שוב 78 µL של PBS לתא הנוזלים התחתון.

התחילו את תהליך הכיול על ידי הנחת תא הנוזלים העליון על הננופור וחיבור כלוב המיגון. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של חלקיקי כיול מדוללים אל תא הנוזלים העליון. כעת, הפעילו לחץ חיובי של לפחות 0.8 kPa.

באמצעות מודול הלחץ המשתנה (VPM), בחרו במתח חיובי ולחצו על "הפעלה" (turn on). לאחר מכן, הפחיתו באיטיות את המתיחה תוך כדי ניתוח החסימה. אירועים הנגרמים על ידי חלקיקי כיול.

ככל שהמתיחה פוחתת, גובה החסימה יעלה בהדרגה וביחס אות לרעש ישתפר. הגדלת המתח יכולה גם היא להגדיל את גובה החסימה, אך היא עלולה גם לייצר יותר רעש RMS. הפסיקו להפחית את המתיחה כאשר החסימות שנצפו עולות באופן הולם על רמות הרקע, כפי שניתן לראות בפנל עקב האות.

שנית, יש לבחון את קצב החלקיקים. עם זאת, עבור פרמטר זה קיים סף פחות קשיח. באופן אידיאלי, קצב החלקיקים צריך להיות לפחות 100 לדקה.

עם זאת, אם קצב החלקיקים גבוה מ-2000 לדקה, יש לדלל את הדגימה ולכייל מחדש את המכשיר. קצב גבוה זה עלול להוביל למדידות לא מדויקות בהדגמה זו. בשלב זה יאפיינו וזיקולות חוץ-תאיות שטוהרו בעבר מקו תאי של גידול מוחי.

התחל בהטענת חלקיקי הכיול לתוך תא הנוזלים העליון של המכבש. הפעל את המכשיר ולאחר מכן הפעל לחץ באמצעות ה-VPM והקלט נתונים של לפחות 500 חלקיקים כאן. מופעל לחץ של 0.8 kilopascal.

במידת הצורך, ניתן לבצע גם מדידה בריבוי לחצים על מנת לעשות זאת; הגבירו את הלחץ המופעל והקליטו קובץ כיול שני. על עליות הלחץ להיות לפחות 0.2 kilopascals כעת, הוציאו את הדגימה מהתא העליון ושטפו את התא שלוש פעמים עם 100 µL של PBS לכל שטיפה. לאחר השטיפות, נגבו את תא הנוזלים העליון בעזרת נייר נקי מסבים.

הוסף כעת את הדגימה הניסיונית. זרם הבסיס חייב להיות בטווח של 3% מהזרם שנצפה בעת מדידת חלקיקי הכיול. אם לא, הקש או סובב את מכסה המיגון, הפעל את הבוכנה או הסר לחלוטין את הננופור ושטוף אותו ב-di water.

אם הזרם שנצפה תקין, הפעילו את אותם הלחצים בדיוק שהופעלו על חלקיקי הכיול. לאחר מכן, רשמו לפחות 500 חלקיקים ושמרו את קובץ הנתונים. אם חלה הפסקה פתאומית בגילוי חלקיקים, ירידה בזרם הבסיס (baseline current) או עלייה פתאומית ברעש RMS, השביחו את ההקלטה ונסו לשחרר חסימה מהננופור.

כפי שנעשה קודם לכן, שאבו את הדגימה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה. הקישו או סובבו את מכסה ההגנה, הפעילו את הבוכנה או הוציאו לחלוטין את הננו-נקב (nanopore) ושטפו אותו עם DI water. אסטרטגיה נוספת היא להגדיל את מתיחת הננו-נקב עד ל-47 millimeters ולהביא למקסימום את הלחץ מה-VPM למשך כחמש דקות.

ניתן גם לבצע ניתוק (UNC unplug) של ה-NPO בתוכנה. עברו ללשונית ניתוח הנתונים (analyze data) והתחילו בעיבוד הנתונים על ידי לחיצה ימנית על אפשרות הקבצים שלא עובדו (unprocessed files) ובחירה באפשרות עיבוד קבצים (process files). לאחר מכן, כדי לקשר בין קבצי הדגימה לקבצי הכיול, סמנו את תיבת הסימון לצד הדגימה.

בעמודה המכוילת, בחרו את הקבצים המתאימים ואשרו. הבחירות. התוכנה תציג מאפייני דגימה שונים כגון גודל, התפלגות, משכי קו בסיס, רוחב חצי ערך מקסימלי (FWHM) ואנליטיקות של ריכוז.

הגישה הבאה מיועדת לדגימות כגון נוזלים ביולוגים הגורמים לסתימה מוגברת בעת שימוש בשיטה הסטנדרטית להכנה: סובב במרכזפוגה לפחות 50 µL של תרבית תאים, כאשר supernatant המכיל את השקיקים החוץ-תאיים יסובב למשך שבע דקות ב-300 Gs. הכן באופן דומה בקרת מדיה בלבד עבור הדגימה והבקרת. העבר 20 µL מה-supernatant למבחנות חדשות והוסף 20 µL של PBS ו-10 µL של תמיסת מקור מדוללת של חלקיקי פוליסטירן בננומטר 335 בריכוז של 10 million beads per milliliter.

כעת הגדירו את המכשיר כפי שבוצע קודם לכן, תוך שימוש ב-NP 200 Nanopore, ומדדו את דגימת הביקורת המכילה חרוצים בלבד בתווך. ראשית, למען הדיוק, יש למזער את גילוי הרקע של חלקיקים קטנים שאינם חרוצים לפחות מ-10% מגילויי החרוצים. כעת, מדדו כל דגימה פעם אחת לפני רישום החזרות.

פעולה זו תפזר את התנאים המשתנים של הננופור בין הדגימות. יש למדוד כל דגימה שלוש פעמים בסך הכל, על ידי מדידה חוזרת של דגימת חרוזי הכיול בלבד לבסוף. בשלב מאוחר יותר, במהלך ניתוח הנתונים, השתמש בתוכנת גיליונות נתונים לביצוע חישובי ריכוז.

דוגמה לחישוב כלולה בפרוטוקול הכתוב. וסיקולות חוץ-תאיותK purified מנוזל העל של תרבית תאי U 87 M-G-E-G-F-R-V באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, ולאחר מכן נמדדו לפי הפרוטוקול המתואר באמצעות חרוזי כיול של 115 nanometer. התקבל פיזור גדלים עבור הוסיקולות החוץ-תאיות.

כימות של שלפוחיות חוץ-תאיות בוצע גם באופן ישיר מנוזל העל של תרבית תאי גליובלסטומה, באמצעות גישה חלופית של הוספת סטנדרט לדגימה. נצפו שתי אוכלוסיות של ננו-חלקיקים. השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות יותר והסטנדרט הגדול יותר הידוע; הערכת הגודל של שתי האוכלוסיות בהתבסס על הסטנדרט הידוע זיהתה את אוכלוסיית השלפוחיות כגדולה מ-140 nanometers.

ניתן היה לזהות וזיקולות חוץ-תאיות קטנות יותר באמצעות פתח ננו-נקבובי קטן יותר, אך הדבר היה גורם לסתימות מרובות יותר. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה תוך שעה עד ארבע שעות, תלוי במספר הדגימות המנותחות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי דגימות עשויות לדרוש התאמות של המחיצה (septal adjustments) לפרוטוקול.

לדוגמה, דגימות המכילות שלפוחיות גדולות יותר עשויות להצריך שימוש בננו-נקבים גדולים יותר במתיחה גדולה יחסית; כמו כן, ניתן להקל על המדידות על ידי סינון או סנטריפוגציה של הדגימות להסרת שיירים תאיים, שעלולים לחסום את הננו-נקב. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות TRPS. בהתאם לדגימה של השלפוחיות החוץ-תאיות שלכם, תוכלו להחיל את הפרוטוקול הסטנדרטי או להשתמש בשיטת ה-spike-in המותאמת.