כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי
19 באוקטובר 2014
שלפוחית תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית תאית מבודדת ולא מבודדת בנוזלים שונים תוך שימוש בחישת דופק resistive מתכונן.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת ולהתאים פרופיל שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות חישת דופק התנגדות מתכווננת. הגישה הסטנדרטית היא להשוות את מדידות החסימה הנוכחיות שנלקחו משלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות לאלו שנלקחו מתקני חרוזי פוליסטירן. גישה שנייה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות היא להקפיץ את הדגימה בחרוזי פוליסטירן, המשמשים בעבודה עם דגימות מורכבות כגון שלפוחיות חוץ-תאיות לא מטוהרות.
במדיום תרבית תאים, הנתונים המתקבלים מאפיינים את גודל ומספר השלפוחיות החוץ-תאיות, בין אם הן מטוהרות או לא מטוהרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כתמים מערביים או ציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לשעבר הקשורות לחרוזי לטקס, הוא ששיטה זו מאפיינת חלקיקים ישירות בנוזלים ביולוגיים ללא צורך בבידוד פיזי או תיוג. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה יתקשו מכיוון שהשלפוחיות החוץ-תאיות הטרוגניות בגודלן.
כאשר מנסים לזהות את השלפוחיות הקטנות יותר, שלפוחיות גדולות יותר עלולות לסתום את הננו-נקבוביות. הוספנו כמה טיפים וטריקים מעשיים לפרוטוקול כדי לחזור במהירות לתנאים מעשיים. ניסינו להפחית את ייצור השלפוחיות החוץ-תאיות ונזקקנו לשיטה לכימות ריכוז השלפוחיות בתרבית תאים. סנאט.
בחיפוש אחר שיטות לאפיון חלקיקי ננו, נתקלנו ב-TRPS ושינינו את הפרוטוקולים שלו כך שיתאימו יותר לאפיון של חללים ותרביות תאים. S supernatants, ונוזלים ביולוגיים אחרים התחל בחיבור מכשיר ה-TRPS למחשב עם תוכנת חבילת הבקרה המותקנת עליו. הקפד למזער הפרעות חשמליות כפי שנדון בפרוטוקול הטקסט.
כעת, בחר את גודל ננופור. NP 100 הוא הבחירה הטובה ביותר עבור שלפוחיות של 70 עד 200 ננומטר, בעוד ש-NP 150 יכול לשמש עבור שלפוחיות בגודל 85 עד 300 ננומטר. NP 200 מתאים יותר למדידת שלפוחיות של 100 עד 400 ננומטר.
לאחר מכן בחר את חלקיקי כיול הפוליסטירן המשלימים עבור NP 100 ו- NP 150 בחר חלקיקי כיול CPC 100 עבור NP 200. השתמש בחלקיקי כיול CPC 200. מערבולת את חלקיקי הכיול למשך 30 שניות.
אם הם עדיין מצטברים, השתמש בסוניקציה ואז דלל את חלקיקי הכיול ב-PBS לריכוז היעד. בהתבסס על גודל הננו-נקבוביות, הנפח הסופי חייב להיות לפחות 40 מיקרוליטר. כעת הרטיבו את תא הנוזל התחתון של המכשיר על ידי מריחת 78 מיקרוליטר PBS והסרתו מיד.
זה מפחית את הסיכון להיווצרות בועות מתחת לננו-נקבוביות. לאחר מכן, הנח את הננופור בזרועות הכלי. מדוד את המרחק בין שתי הזרועות המנוגדות באמצעות מחוגה דיגיטלית.
הזן ערך זה לתוכנה תחת השדה הנקרא מתיחה ולאחר הזנתו, לחץ על כיול מתיחה באמצעות גלגל הצד השולט במרחק בין הזרועות היריבות. מתחו את הננו-נקבוביות ל-47 מילימטרים. לאחר מתיחה לגודל, יש למרוח מחדש 78 מיקרוליטר PBS על תא הנוזל התחתון.
התחל את תהליך הכיול על ידי הנחת תא הנוזל העליון על הננו-נקבוביות והצמדת כלוב המיגון. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של חלקיקי כיול מדוללים לתא הנוזל העליון. כעת הפעל לפחות 0.8 קילופסקל של לחץ חיובי.
באמצעות מודול הלחץ המשתנה או ה-VPM, בחר מתח חיובי ולחץ על הפעל. לאחר מכן צמצם לאט את המתיחה תוך ניתוח החסימה. אירועים הנגרמים על ידי חלקיקי הכיול.
ככל שהמתיחה יורדת, גובה החסימה יגדל בהדרגה ויחס האות לרעש ישתפר. הגדלת המתח יכולה גם להגדיל את גובה החסימה, אך יכולה גם לייצר יותר רעש RMS. הפסק להפחית את המתיחה כאשר החסימות שנצפו עולות כראוי על רמות הרקע כפי שצוין מלוח מעקב האותות.
שנית, שימו לב לקצב החלקיקים. עם זאת, יש לכך חתך פחות מחמיר. קצב החלקיקים צריך להיות באופן אידיאלי לפחות 100 לדקה.
עם זאת, אם קצב החלקיקים גדול מ-2000 לדקה, יש לדלל את הדגימה ולכייל מחדש את המכשיר. קצב כה גבוה יכול להוביל למדידות לא מדויקות עבור הדגמה זו. מאופיינות שלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות בעבר מקו תאי גידול במוח.
התחל בהעמסת חלקיקי הכיול למכבש תאי הנוזל העליון. הפעל ואז הפעל לחץ באמצעות ה- VPM ורשום כאן לפחות 500 חלקיקי נתונים. מופעל לחץ של 0.8 קילופסקל.
לחלופין, ניתן לבצע מדידת לחץ מרובה כדי לעשות זאת, להגביר את הלחץ המופעל ולהקליט קובץ כיול שני. תוספות הלחץ חייבות להיות לפחות 0.2 קילופסקל כעת, הסר את הדגימה מהתא העליון ושטוף את התא שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר PBS לכל שטיפה. לאחר השטיפות, נגב את תא הנוזל העליון בנייר נטול מוך.
הוסף את הדגימה הניסיונית לאחר מכן. זרם הבסיס חייב להיות בטווח של 3% מהזרם שנצפה בעת מדידת חלקיקי הכיול. אם לא, הקש או סובב את מכסה המיגון, החל את הבוכנה או הסר לחלוטין את הננו-נקבוביות ושטוף אותה במים.
אם הזרם הנצפה טוב, הפעל בדיוק את אותם לחצים המופעלים על חלקיקי הכיול. לאחר מכן רשום לפחות 500 חלקיקים ושמור את קובץ הנתונים. אם יש הפרעה פתאומית בזיהוי חלקיקים, ירידה בזרם הבסיס או עלייה פתאומית ברעש RMS, השהה את ההקלטה ונסה לפתוח את סתימת הננו-נקבוביות.
כמו קודם, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה. הקש או סובב את מכסה המיגון, החל את הבוכנה או הסר לחלוטין את הננו-נקבוביות ושטוף אותה במי DI. אסטרטגיה נוספת היא להגדיל את מתיחת הננו-נקבוביות עד 47 מילימטרים ולמקסם את הלחץ מה-VPM למשך כחמש דקות.
מכיוון שזה יכול גם UNC לנתק את ה-NPO בתוכנה. עבור לכרטיסייה ניתוח נתונים והתחל לעבד את הנתונים על ידי לחיצה ימנית על אפשרות הקבצים הלא מעובדים ובחר באפשרות עיבוד קבצים. לאחר מכן, כדי לשייך את קבצי הדגימה והכיול, לחץ על תיבת הסימון לצד הדוגמה.
בעמודה המכוילת, בחר את הקבצים המתאימים ואישור. הבחירות. התוכנה תציג מאפייני מדגם שונים כמו גודל, התפלגות, משכי בסיס, רוחב מלא, חצי מקסימום וניתוח ריכוז.
הגישה הבאה משמשת לדגימות כגון נוזלים ביולוגיים המובילים לסתימת יתר בשיטה הסטנדרטית בהכנה, צנטריפוגה לפחות 50 מיקרוליטר של תרבית תאים. סופרנטנט המכיל את השלפוחיות החוץ-תאיות למשך שבע דקות ב-300 Gs.הכן גם בקרה לבד מדיה באותו אופן הן לדגימה והן לבקרה. העבירו 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינורות חדשים והוסיפו 20 מיקרוליטר של PBS ו-10 מיקרוליטר של מלאי חרוזי פוליסטירן מדולל של 335 ננומטר ב-10 מיליון חרוזים למיליליטר.
כעת הגדר את המכשיר כמו קודם, באמצעות NP 200 Nanopore ומדוד את דגימת הבקרה של חרוזים בלבד במדיה. ראשית, למען הדיוק, יש למזער את זיהוי הרקע של חלקיקים קטנים שאינם חרוזים לפחות מ-10% מזיהויי החרוזים. כעת, מדוד כל דגימה פעם אחת לפני רישום שכפולים.
זה יפיץ את תנאי הננו-נקבוביות המשתנים על פני הדגימות. יש למדוד כל דגימה שלוש פעמים בכל הגימור על ידי מדידה מחדש של דגימת חרוז הכיול בלבד. מאוחר יותר. במהלך ניתוח נתונים, השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לבצע חישובי ריכוז.
חישוב לדוגמה כלול בפרוטוקול הכתוב. שלפוחיות חוץ-תאיות טוהרו מתרבית תלת-תאית U 87 M-G-E-G-F-R-V, סופרנטנט על ידי אולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן נמדדו באמצעות הפרוטוקול המתואר באמצעות חרוזי כיול של 115 ננומטר. התקבלה התפלגות גודל לשלפוחיות החוץ-תאיות.
שלפוחיות חוץ-תאיות כומתו גם ישירות מתרבית תאי גליובלסטומה, תוך שימוש בגישה האלטרנטיבית שמזנקת את הדגימה עם תקן. נצפו שתי אוכלוסיות ננו-חלקיקים. השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות יותר והתקן הידוע הגדול יותר, הערכת הגודל של שתי האוכלוסיות על סמך התקן הידוע, זיהו את אוכלוסיית השלפוחית כגדולה מ-140 ננומטר.
ייתכן ששלפוחיות חוץ-תאיות קטנות יותר זוהו באמצעות פתח ננו-נקבוביות קטן יותר, אך הייתה סתימה רבה יותר ברגע ששולטים בהן. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד ארבע שעות, תלוי במספר הדגימות שנותחו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שדגימות עשויות לדרוש התאמות מחיצה לפרוטוקול.
לדוגמה, דגימות המורכבות משלפוחיות גדולות יותר עשויות לדרוש שימוש בננו-נקבוביות גדולות יותר במתיחה גדולה יחסית, וגם ניתן להקל על מדידות על ידי סינון הצנטריפוגה שלנו של דגימות כדי להסיר פסולת תאית, שיכולה לשעון את הננו-נקבוביות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות TRPS. בהתאם לדגימת השלפוחית החוץ-תאית שלך, אתה יכול להחיל את הפרוטוקול הסטנדרטי או להשתמש בשיטת הספייק המותאם.
סקירה
פרוטוקול זה מפרט שיטות לכימות ואופיון גודל של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) באמצעות חישה פולסים עמידות ניתנת לכוונון (TRPS). הטכניקה מאפשרת ניתוח בנוזלים ביולוגיים ללא צורך בבידוד או סימון, מה שהופך אותה למתאימה יותר משיטות מסורתיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- שלפוחיות חוץ-תאיות מעורבות בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.
- הן יכולות לשמש כסמנים ביולוגיים או כסוכנים טיפוליים.
- שיטות עכשוויות לניתוח EV לעיתים קרובות דורשות בידוד או סימון, מה שעלול לשנות את תכונותיהן.
- TRPS מציע גישה למדידה ישירה בדגימות ביולוגיות מורכבות.
מטרת המחקר
- לכמת ולקבוע את הפרופיל הגודלי של EVs בנוזלים ביולוגיים שונים.
- לספק פרוטוקול שממזער את הצורך בהכנת דגימות.
- לשפר את הדיוק של אופיון EV במחקר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש בחישה פולסים עמידות ניתנת לכוונון (TRPS) למדידה ישירה.
- השוואה של מדידות חסימה נוכחיות מ-EVs עם תקני חרוזי פוליאסטר.
- כיול של מכשיר ה-TRPS עם גדלי ננו-נקבוביים ספציפיים וחרוזי פוליאסטר.
- איסוף נתונים וניתוח של גודל החלקיקים והריכוז בדגימות.
תוצאות עיקריות
- אופיון מוצלח של EVs מטוהרים ובלתי מטוהרים במדיום תרבית תאים.
- זיהוי גדלי ננו-נקבוביים אופטימליים לטווחי גודל EV שונים.
- הוכחת יעילות השיטה במדידת EVs ללא בידוד מוקדם.
- מתן טיפים לפתרון בעיות נפוצות שנתקלים בהן במהלך המדידות.
מסקנות
- TRPS היא כלי חשוב לאופיון של שלפוחיות חוץ-תאיות.
- השיטה משפרת את ההבנה של EVs בהקשרים ביולוגיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול פיתוח טיפולי ומעקב אחר מחלות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate quantification and size profiling of extracellular vesicles (EVs) in complex biological fluids is critical for target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. Tunable resistive pulse sensing (tRPS) enables direct measurement without isolation or labeling, preserving native EV properties and reducing pre-analytical variability. This supports predictive confidence in early discovery by providing reproducible, quantitative data for go/no-go decisions in therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying EV concentration and size distribution in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, direct measurement in complex matrices like cell culture supernatant.
- Predictive Value: Provides quantitative outputs that aid in portfolio triage by correlating EV phenotypes with pathological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering size and concentration analytics without purification steps.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through real-time calibration with polystyrene bead spikes in challenging samples.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by maintaining measurement integrity in high-throughput settings.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery to preclinical validation by enabling consistent EV characterization across sample types.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing concentration and size data that inform mechanistic de-risking.
- Disease-Relevant System: Applicable to glioblastoma and other cancer models where EVs play roles in immune response and coagulation.
Pipeline & Workflow Integration
tRPS fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, offering quantitative particle analytics that support target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by sizing and counting EVs in biological fluids without isolation.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible size distribution and concentration measurements enabled by nanopore calibration.
- Analytics: Provides particle rate, blockade height, and size distribution outputs that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling EV profiling in disease models such as U87-MG glioblastoma supernatant.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for EV analysis across projects, reducing reliance on isolation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, label-free EV quantification in native conditions.
- Operational Value: Standardization and scalability via tunable nanopore stretch and pressure controls for consistent measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in EV-based biomarker studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative size and concentration data that inform therapeutic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore instrumentation and fluidic system setup to minimize electrical interference and bubble formation.
- Depends on access to qNano system with variable pressure module and appropriate nanopore sizes (NP 100, NP 150, NP 200) matched to EV size ranges.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols, including polystyrene bead preparation and dilution in PBS.
- Involves adaptation considerations for sample types, such as using larger nanopores for larger vesicles or pre-filtration to reduce debris-induced clogging.
- Includes practical limitations like nanopore clogging by larger vesicles and the need for pressure and stretch adjustments based on sample complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Preparations
3:54
Calibrating the Settings
5:20
Measuring the Calibration and Sample Particles
7:32
Data Analysis
8:15
Alternative Approach to Measuring Non-purified Extracellular Vesicles
9:58
Results: U87-MG/EGERvIII Extracellular Vesicle Characterization
11:03
Conclusion
