ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייעל משטחים מצופים פולימרים כדי לשמר את התרבות היציבה לטווח ארוך של הפטוציטים אנושיים שמקורם בתאי גזע. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של פוליאוריטן 1 3 4 או PU 1 3 4. השלב השני הוא בחירת הממס הנכון להמסת PU 1 34.

לאחר מכן, תהליך ציפוי הסיבוב עם ה-PU 1 3 4 על החלקת כיסוי הזכוכית מותאם. השלב האחרון הוא אופטימיזציה של הליך העיקור של הפולימר P 1 34 החלקות כיסוי זכוכית מצופות ובסופו של דבר מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי ומטבוליזם של תרופות. מבחנים משמשים כדי להראות את ההשפעה של ציפוי פולימרי PU 1 34 על תפקודם של הפטוציטים שמקורם בתאי גזע.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש ב-al Metrices בתרבית בשמירה על תאי גזע חזקים של URI המכילים הפטוציטים, הוא שניתן לכוונן את החומרים הסינתטיים הללו למטרה ולהתאים אותם לסטנדרטים מובטחים של איכות. בנוסף, הם מציגים עקביות של אצווה שנייה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות כבד מכיוון שהיא מייצגת דוגמה לאופן שבו ניתן לייעל את פני השטח של פולימר סינתטי כדי לשמר את הפנוטיפ של התא.

שידגים את ההליך יהיה ד"ר ג'פרי וולטון, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי לפני תחילת הליך זה. החל טיפול בחום על חוגת שש הקסאן של המונו די אתילן גליקול וניאו PenTile גליקול ב-40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בתנור ואקום. כדי להסיר שאריות מים, הוסף 22 מילימול מכל מונומר ו-55 מילימול של חומצה dpic לבקבוק תחתון עגול בעל שני צווארים המחובר למנגנון דין סטארק ומצויד במוט ערבוב מגנטי.

לאחר מכן, הניחו את כל המכלול תחת ואקום וחממו בעדינות את כלי הזכוכית בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך שש שעות על מנת למנוע ספיגת לחות במהלך הוספת הכימיקל לבקבוק. לאחר הוצאת המכלול מהתנור והנחת המערכת מתחת לחנקן, הוסף 0.0055 שומות של הזרז טיטניום ארבע, אך תחמוצת טיפה על ידי מזרק לבקבוק. מערבבים את תערובת התגובה בחום של 180 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, אוספים שאריות מים במלכודת דין סטארק.

הניחו למוצר להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן מערבבים 3.2 מילימול, או שווה ערך אחד של הפוליאול P-H-N-G-A-G עם 6.4 מילי-מול או שתי שומות שוות ערך של ארבעה ארבעה מתיל וביספנול איזוציאנט. ב-12 מיליליטר של DML נטול מים לבקבוק תחתון עגול בעל שני צווארים המחובר למנגנון דין סטארק ומצויד במוט כוכב מגנטי.

מערבבים את תערובת התגובה בחום של 70 מעלות צלזיוס מתחת לאטמוספירת חנקן. לאחר מכן הוסף את הזרז טיטניום ארבע תחמוצת טיפה דרך המזרק לריכוז סופי של 0.8%לאחר שעה, הוסף שווה ערך אחד למאריך השרשרת חוגה אחת ארבע בוטאן כדי לתת תוצר קופולימר. העלו את הטמפרטורה ל-90 מעלות צלזיוס ורעבו במשך 24 שעות תחת אטמוספירת חנקן.

לאחר שתערובת התגובה קראה לטמפרטורת החדר אתר דאל טיפה לתערובת התגובה עד שנצפה משקעים של תוצר הפוליאוריטן. לאחר העברת תערובת התגובה לצנטריפוגה של צינור צנטריפוגה התמיסה ב 5, 300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הסילוק, הספינאט מתייבש בטמפרטורת החדר עד שהממס מתאדה.

הפעולות הבאות שוקלות 200 מיליגרם של PU 1 34 לבקבוק זכוכית. לדלל את הדגימה לריכוז סופי של 2% בכלורופורם או כלורופורם וטולואן ביחס של אחד לאחד או טטרה רורן או שילוב של טטרה רורן אנטי כלורו מתאן. ביחס של אחד לאחד, יש לנער את התמיסה במרץ במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות שייקר במהירות של 200 תנועות לדקה עד שהתמיסה הופכת הומוגנית ולא נצפה משקעים.

בסיום, הנח כ-15 מילימטר מרובע כיסוי זכוכית על מעטפת הסיבוב. מרחו 50 מיקרוליטר של תמיסת ה-PU אחת עד ארבע על החלקת הכיסוי באמצעות סיבוב פיפטה כל החלקה של הכיסוי למשך שבע שניות ב-23 פעמים G.לאחר מכן יבשו את החלקת הכיסוי באוויר בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפחות לפני העיקור. בשלב זה, גמא מקרינה כל החלקת כיסוי מצופה פולימר על ידי מריחת מינון של 10 אפורים באמצעות רדיאטור מעבדה למשך 12 דקות.

לחלופין, UV מקרין כל החלקת כיסוי מצופה פולימר באמצעות נורת UV של 30 וואט למשך 16 דקות מכל צד. בסיום, הנח את החלקת הכיסוי המצופה פולימר בצלחת תרבית רקמה מתאימה בהתאם לגודל החלקת הכיסוי. לאחר תרבית והתמיינות קו תאי הגזע העובריים האנושיים, ניתקו תאים באמצעות מגיב דיסוציאציה והפעילו אותם מחדש על החלקות הכיסוי המצופות PU 1 34 ביום התשיעי של תהליך ההתמיינות בנוכחות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מדיום חופשי בסרום.

תמונות של חיפויי כיסוי הזכוכית המצופים השונים מראות כי הציפוי עם טולואן או כלורופורם לא היה הומוגני, מה שמדגים ציפוי לא אחיד עם משקעים PE 1 34. לעומת זאת, טטרהדרן איפשר ציפוי ספין של משטח הרבה יותר אחיד. בנוסף, ניתוח מיקרוסקופ כוח אטומי של ציפויי הפולימר השונים מראה הפחתה של 40% בחספוס של P 1 34 מסיס בטטרה הידרו פורין בהשוואה לממיסים אחרים המדגימים ציפוי PU 1 34 אחיד יותר יישום ביולוגי של התמיינות אנדודרם בכבד הושרה וביום התשיעי ניכרו תאים דמויי הפטו כאשר רוב התאים מבטאים ציטוקרטין 19 חלבון אלפא פטה וגורם גרעיני הפטוציטים עבור אלפא ו רמות נמוכות של אלבומין כמדד לתפקוד מטבולי.

תפקוד ציטוכרום P 4 50 הוערך ארבעה ימים לאחר הציפוי מחדש על משטחים מצופים פולימרים שונים. נצפתה עלייה כפולה בפעילות המטבולית בתאים שצופו מחדש על משטחים מצופים טטרה הידרו 1 3 4. תוצאות אלה מדגימות כי הפעילות המטבולית של הפטוציטים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים משופרת עם ציפוי פנים P 1 34 אחיד יותר הדמיית ניגודיות לא הראתה הבדלים גסים לאחר קרינת UV או גמא, מה שאושר עוד יותר על ידי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הפטוציטים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים שצופו מחדש על החלקות כיסוי זכוכית מצופות PU 1 34 מוקרנות גמא הראו עלייה של פי שלושה בפעילות CYP 3 A על פני תאים שצופו מחדש על החלקות כיסוי זכוכית מצופות PU 1 34 מוקרנות UV. תצפיות אלו מוכיחות שקרינת גמא היא טכניקת העיקור האופטימלית. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את ההומוגניות של הציפוי בין CLOs שונים של ציפוי ספין, ואל תשכח שעבודה עם מכשור ממסים כימיים עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לנקוט תמיד ביישומים כגון הרכבת משקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.