ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

המטרה הכללית של הליך זה היא להבטיח משטחים מצופים פולימר באופן אופטימלי כדי לשמר תרבית יציבה לאורך זמן של הפטוציטים אנושיים המופקים מתאי גזע. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של polyurethane 1 3 4 או PU 1 3 4. השלב השני הוא בחירת הממס המתאים להמסת PU 1 34.

בשלב הבא, תהליך הציפוי בסבב (spin coating) של PU 1 3 4 על זכוכית כיסוי יעבור אופטימיזציה. השלב הסופי הוא אופטימיזציה של הליך הסטריליזציה של זכוכית כיסוי מצופה בפולימר P 1 34, ובסיום ביצוע מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת, מיקרוסקופיית כוח אטומי ובדיקות מטבוליזם של תרופות. בדיקות אלו משמשות להצגת השפעת ציפוי הפולימר PU 1 3 4 על תפקודן של הפטוציטים המופקים מתאי גזע.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש במטריצות של אלומניום בתרבית לשמירה על תאי גזע פוטנטיים של URI המכילים הפטוציטים, הוא שניתן להתאים את החומרים סינתטיים אלה באופן מדויק למטרה מסוימת ובקנה מידה העומד בתקני בקרת איכות. בנוסף, הם מציגים עקביות בין סדרות ייצור. ההשלכות של טכניקה זו חורגות לטיפול במחלות כבד, שכן היא מהווה דוגמה לאופן שבו ניתן לאופטימיזציה של פני השטח של פולימר סינתטי כדי לשמר את הפנוטיפ התאי.

את הפרוצדורה ידגים ד"ר ג'פרי וולטון, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. לפני תחילת הפרוצדורה, יש להפעיל טיפול תרמי על המונומרים 1,6-hexane diol, diethylene glycol ו-neopentyl glycol בטמפרטורה של 40 °C למשך 48 שעות בתנורי ואקום. כדי להסיר שאריות מים, יש להוסיף 22 millimoles מכל מונומר ו-55 millimoles של dipic acid לבקבוק עם שני צווארים בעגול (round bottom flask) המחובר למכשיר Dean-Stark ומצויד במגנט שקלול.

לאחר מכן, הניחו את כל המערכה תחת ואקום וחממו בעדינות את כלי הזכוכית בטמפרטורה של 40 °C למשך שש שעות, כדי למנוע ספיגת לחות בעת הוספת הכימיקל לבקראך. לאחר הוצאת המערכה מהתנור והצבת המערכת תחת חנקן, הוסיפו לבקראך 0.0055 moles של קטליזטור titanium four, but oxide בטפטוף באמצעות מזרק. ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 180 °C למשך 24 שעות, תוך איסוף מים שיריים במלכודת dean stark.

יש להמתין לקירור המוצר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו 3.2 millimole, או שווה ערך אחד של הפוליול P-H-N-G-A-G, עם 6.4 millimole או שני שווי ערך של four four methyl and a bisphenol isocyanate, ב-12 milliliters של DML ללא מים, בתוך בקבוק תחתית עגולה בעל שני צוואריים המחובר למערכת Dean-Stark ומצויד במגנט לבקיעה.

ערבב את תערובת התגובה בטמפרטורה של 70 °C תחת אטמוספרת חנקן. לאחר מכן, הוסף טיפה אחר טיפה את הקטליזטור titanium four oxide באמצעות מזרק עד לריכוז סופי של 0.8%. לאחר שעה, הוסף שווה אחד של מאריך השראות one four butane dial כדי לקבל את מוצר הקו-פולימר. העלה את הטמפרטורה ל-90 °C והשאר לתגובה למשך 24 שעות תחת אטמוספרת חנקן.

לאחר שתערובת התגובה התקררה לטמפרטורת החדר, הוסיפו את האתר בטיפות לתערובת התגובה עד להשקעת מוצר הפוליאוריתן. לאחר העברת תערובת התגובה למבחנה לצנטריפוגה, סובבו את התמיסה ב-5,300 ×g למשך חמש דקות. לאחר שפיכת הנוזל העליון, ייבשו את המשקע בטמפרטורת החדר עד להתאיידות הממס.

בשלב הבא, שקלו 200 milligrams של PU 1 34 לתוך בקבוק זכוכית. דללו את הדגימה עד לריכוז סופי של 2% בכלורופורם, או בתערובת של כלורופורם וטולואן ביחס של אחד לאחד, או בטטראהידרופירן, או בשילוב של טטראהידרופירן וכלורומתאן ביחס של אחד לאחד. נערה את התמיסה בעוצמה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מנער במהירות של 200 motions per minute, עד שהתמיסה תהפוך להומוגנית ולא ייראה משקע.

עם הסיום, מקמו כיסוי זכוכית ריבועי בגודל של כ-15 מילימטר על גבי ה-spin coater. גרפו 50 µL של תמיסת ה-PU one through four על כיסוי הזכוכית באמצעות פיפטה, וסובבו כל כיסוי למשך שבע שניות ב-23 ×g. לאחר מכן, ייבשו את כיסוי הזכוכית באוויר בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפחות לפני הסטריליזציה. בשלב זה, בצעו הקרנה של גמא לכל כיסוי זכוכית מצופה פולימר על ידי החלת מנה של 10 grays באמצעות רדיאטור מעבדה למשך 12 דקות.

לחלופין, ניתן להקרין ב-UV כל לבישת זכוכית (cover slip) מצופה פולימר באמצעות נורה UV של 30 watt למשך 16 דקות מכל צד. עם הסיום, מקמים את לבישת הזכוכית המצופה פולימר בתוך פלטת תרבית רקמה מתאימה בהתאם לגודל הלבישה. לאחר גידול והבידוע של קו תאי הגזע העובריים האנושיים, מפרידים את התאים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה וזורעים אותם מחדש על לבישות הזכוכית המצופות PU 1 34 ביום התשיעי של תהליך הבידוע בנוכחות מצע ללא סרום עבור מיקרוסקופיית סריקה אלקטרונית (scanning electron microscopy).

תמונות של כיסורי זכוכית מצופים שונים מראות כי הציפוי באמצעות toluene או chloroform לא היה הומוגני, מה שמעיד על ציפוי לא אחיד עם שקיעה של PE 1 34. לעומת זאת, tetrahedran אפשר ציפוי ספין (spin coating) של פני שטח אחידים הרבה יותר. בנוסף, ניתוח באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) של ציפויי פולימר שונים מראה הפחתה של 40% בחספוס של P 1 34 המומס ב-tetra hydro furin בהשוואה לממסים אחרים, מה שמעיד על ציפוי PU 1 34 אחיד יותר. עבור יישום ביולוגי, השרה בידול של אנדודרם כבדי, וביום התשעי נראו תאים דמויי הפטובלסטים, כאשר רוב התאים ביטאו cytokeratin 19, alpha feta protein ו-hepatocyte nuclear factor for alpha, ורמות נמוכות של albumin כמדד לתפקוד מטבולי.

פעילות Cytochrome P450 הוערכה ארבעה ימים לאחר הזריעה מחדש על משטחים שונים מצופים פולימר. נצפתה עלייה של פי שניים בפעילות המטבולית בתאים שנזרעו מחדש על משטחים מצופים ב-tetrahydrofuran 1,3,4. תוצאות אלו מדגימות כי הפעילות המטבולית של הפטוציטים המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים משתפרת עם ציפוי P1,34 אחיד יותר. דימות בניגוד (Contrast imaging) לא הראה הבדלים גסים לאחר הקרנת UV או גמא, דבר שאושר בהמשך על ידי ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הפטוציטים המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים, אשר נזרעו מחדש על לוחות כיסוי מזכוכית מצופים ב-PU 1 34 שהוקרנו בגמא, הראו עלייה פי שלושה בפעילות CYP three a בהשוואה לתאים שנזרעו מחדש על לוחות כיסוי מזכוכית מצופים ב-PU 1 34 שהוקרנו ב-UV. תצפיות אלו מוכיחות כי הקרנת גמא היא טכניקת הסטריליזציה האופטימלית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבדוק את הומוגניות הציפוי בין לוחות כיסוי שונים שעברו ציפוי בסבב (spin coating), ואל תשכחו כי עבודה עם ממסים כימיים ומכשור מעבדתי עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש להשתמש במיגון מתאים, כגון הרכבת משקפי מגן, בעת ביצוע פרוצדורה זו.