מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

פרוטוקול זה מספק מערכת התמיינות כבד שמקורה בתאי גזע המציעה כלי הניתן לשחזור לחקר ביולוגיה של הכבד למחקר בסיסי וקליני כאחד. על ידי שילוב פרוטוקול סטנדרטי וקל למעקב עם ריאגנטים לתרבית מדף, מערכת זו מאפשרת ייצור של אבות כבד ותאים דמויי הפטוציטים בקנה מידה גדול. שמור על תאים פלוריפוטנטיים אנושיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בצלחת של 10 סנטימטר על למינין-531, והאכלתם מדי יום ב-10 מיליליטר של מדיום תחזוקת תאי גזע למנה.

להכנת צלחות למינין 521, יש לדלל למינין 521 מופשר ב-DPBS קר כקרח עם סידן ומגנזיום לריכוז סופי של שמונה מיקרוגרם למיליליטר. הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת הלמינין לכל באר של צלחת 24 באר או 50 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 96 בארות. נדנדו בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי לצפות את הבארות באופן שווה, ואז אטמו את הצלחות בסרט גמיש שקוף למחצה ואחסנו אותן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

ביום זריעת התאים, יש לחמם את הצלחות המצופות מראש בחממת תרבית תאים למשך 30 עד 60 דקות. שאפו את תמיסת הלמינין 521 והוסיפו מדיום תחזוקת תאי גזע בתוספת מעכב ROCK מיקרו-מולרי לכל באר, ולאחר מכן החזירו את הצלחת לאינקובטור. כאשר שטף ספירת התאים מגיע ל -70 עד 80% שאפו את המדיום המושקע מכלי התרבות ושטפו כל צלחת תרבית בחמישה מיליליטר DPBS ללא סידן או מגנזיום בטמפרטורת החדר.

שאפו את שטיפת ה-DPBS מכלי התרבית, ואז הוסיפו חמישה מיליליטר של מגיב דיסוציאציה נטול אנזימים לתבשיל ודגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 10 דקות עד שהתאים מתנתקים באופן גלוי מהצלחת. נתק בעדינות את התאים מצלחת התרבית בעזרת מגרד תאים, ולאחר מכן פיפטה את התוכן של כל באר למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי להפיק תרחיף תא בודד. עבור כל קו תאים, אסוף תאים מכל בארות התחזוקה לצינור סטרילי של 50 מיליליטר.

שטפו כל צלחת תרבית מרוקנת עם חמישה מיליליטר של מדיום תחזוקת תאי גזע אלה והוסיפו את השטיפות לצינור המתאים עם התאים המאוגדים. בצע שלוש ספירות תאים ברות קיימא על כל דגימה במאגר. צנטריפוגה את הדגימות המאוגדות ב-250 x גרם למשך חמש דקות.

לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בטמפרטורת חדר של 1 עד 3 מיליליטר כמדיום תחזוקת תאי גזע בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי Y27632. לאחר חישוב מספר התאים הנדרש להשגת צפיפות הזריעה הרצויה, השעו מחדש את התאים לריכוז המתאים והוציאו אותם לצלחות המצופות מראש. הנפח הכולל לבאר צריך להיות מיליליטר אחד לצלחת של 24 בארות ו-0.1 מיליליטר לצלחת של 96 בארות.

נדנד בעדינות את הצלחות מצד לצד וקדימה ואחורה כדי להבטיח פיזור תאים אחיד והנח את הצלחות הזרעות לתוך החממה, נדנד אותן קדימה ואחורה ומצד לצד. הכן מדיה לאינדוקציה סופית של האנדודרם ולהתמיינות מפרט תאי האב של הכבד שלאחר מכן כמתואר בכתב היד הטקסטואלי. ביום הראשון של ההבחנה, הסר את המדיום המושקע מהבארות והחלף אותו במדיום שלב ראשון.

בימים השני, השלישי והרביעי, הסר את המדיום המושקע והאכיל כל אחד היטב בשלב הראשון בינוני שתיים. ביום החמישי, תקן את הבארות המיועדות לניתוח התמיינות אנדודרם סופי. עבור הבארות הנותרות, הסר את המדיום המושקע והאכיל כל באר במדיום אב כבד שונה של גזע.

ביום 10, קצרו תאים לניתוח התמיינות אב בכבד או המשיכו בהתמיינות תאים דמויי הפטוציטים. כדי לאפיין את תרביות ההתמיינות של אב הכבד, השתמש בצביעה חיסונית כדי לזהות ביטוי של סמנים ספציפיים לאנדודרם סופי ביום החמישי וסמנים ספציפיים לאב הכבד ביום ה-10 ולכמת את אחוז התאים החיוביים לאלפא HNF4. ביום העשירי, מדדו גם הפרשת אלפא עוברי ואלבומין באמצעות ELISA.

פרוטוקול זה שימש כדי להבדיל בין תאי אב בכבד הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. ביום החמישי של פרוטוקול ההתמיינות הוערך מפרט האנדודרם הסופי באמצעות ביטוי Sox 17. בשני קווי התאים, Sox 17 התבטא מאוד עם 80 ו-87.8% מהתאים החיוביים של Sox 17 עבור H9 ו-P106, בהתאמה.

ביום העשירי, אבות הכבד הפגינו מורפולוגיה דמוית אבן. בנוסף, מפרט אב הכבד הוערך עבור ביטוי HNF4 אלפא, AFP, אלבומין וציטוקרטין 19. שתי תרביות האב הכבדיות ביטאו סמני כבד עובריים, כגון HNF4 alpha, AFP ו-CK 19.

הפרשת חלבון עוברי אלפא זוהתה ביום ה-10 בשני קווי התאים, בעוד שהפרשת אלבומין לא זוהתה עם ELISA. שונות מספר התאים ויעילות התמיינות אבות הכבד הוערכו על ידי כימות ביטוי אלפא HNF4. ביום העשירי, אבות הכבד לא הראו שונות משמעותית בין שורות עם למעלה מ-95 ו-97% מתאי אלפא חיוביים HNF4 לבאר עבור H9 ו-P106, בהתאמה.

פיזור תאים אחיד לפני תחילת ההתמיינות הוא המפתח להבטחת אוכלוסייה הומוגנית של תאי אב בכבד. כדי להשיג זאת, נדנד בעדינות את הלוחות מצד לצד וקדימה ואחורה כדי להבטיח פיזור תאים אחיד. תאי אב בכבד המיוצרים על ידי פרוטוקול זה יכולים להתמיין עוד יותר לתאים דמויי הפטוציטים עבור בדיקות אחרות, ומציעים כלי ניתן לשחזור וסטנדרטי למידול מחלות או סינון תרופות.