הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר רמות הומוגניות של הפטוציטים אנושיים כדי לחקור את הביולוגיה של הכבד האנושי במבחנה. זה מתחיל על ידי הנעת תאי גזע עובריים אנושיים או תאי גזע עובריים אנושיים לאנדודרם סופי באמצעות גירויים פיזיולוגיים הפעילים ב-A ו-WINT שלוש A.As שלב שני אנדודרם סופי מונע ביעילות רבה לאנדודרם הכבד. אנדודרם הכבד הבא שמקורו ב-ESC אנושי מתבגר במבחנה כדי לייצר הפטוציטים אנושיים פונקציונליים.

תוצאות מ-PCR Western Blotting, אימונופלואורסצנטי, אלייזה ומטבוליזם של תרופות מצביעות על כך ששיטה זו מפיקה הפטוציטים מ-ESCs אנושיים ביעילות של כ-90% בטכניקה זו, אנו יכולים, בתיאוריה, לייצר אספקה בלתי נדלית של הפטוציטים אנושיים ראשוניים, המציגים רמות ניכרות של תפקוד כבד אנושי. בעתיד, זה יועיל לחיזוי מדויק של רעילות התרופות ויספק תמיכה בכבד האנושי. החוכמה היא להניע התמיינות סולארית וצפיפות הליבה של תאים אנושיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שצפיפות תאי הליבה חיונית ליצירת אוכלוסיית תאים הומוגנית. הכשרנו למעלה מ-15 אנשים בארבעה אתרים בינלאומיים לבצע טכניקה זו בהצלחה. התחל בתרבית של תאי גזע עובריים אנושיים והתפשט על צלחות מצופות מטריג'ל עם פיברובלסטים עובריים של עכברים מדיה מותנית ORM cm בתוספת FGF בסיסי.

חשוב לאפיין בקפידה את ה-ESCs האנושיים שנשמרו לפני התמיינות הכבד. לדוגמה, תאים אלה מציגים מורפולוגיה של ESC אנושי. הם גם מבטאים את סמני תאי הגזע הפלוריפוטנטיים, OCT ארבע וננו ברמות דומות לקו ה-ESC האנושי של הבקרה החיובית H 7.

בנוסף, ה-ESCs האנושיים חיוביים ל-SS EEA ארבעה. כאשר ESCs E אנושיים מגיעים לשטף של 30 עד 60%, החלף את ה-ME CM במדיום התמיינות טרי שהוכן מראש. כדי ליזום התמיינות בכבד, יש להחליף את המדיום כל 24 שעות למשך שלושה ימים.

לאחר שלושה ימים, התאים מקבלים מראה משולש כשהם מתחילים להתמיין לכיוון פנוטיפ אנדודרמלי. העבר את המדיום לבידול SR DMSO. תרבות בינונית למשך ארבעה עד חמישה ימים.

החלפת המדיום כל 48 שעות. לאחר תקופה זו של חמישה ימים, התאים יתחילו לקבל מראה מצולע האופייני לתאי הכבד. התמיינות של ESC אנושי לאנדודרם הכבד באה לידי ביטוי בסדרה של שינויים מורפולוגיים עמוקים עד היום התשיעי.

יתר על כן, הביטוי של אוקטה ארבע במהלך תשעת הימים יורד בהדרגה. לעומת זאת, תעתיקי כבד של FP ואלבומין גדלים מהיום השביעי ואילך. המשך על ידי הבשלת התאים ושמירה על פנוטיפ הכבד במדיום הסופי למשך תשעה ימים עם מדיום טרי כל 48 שעות.

לבסוף, עקוב אחר התאים המתורבתים על ידי מיקרוסקופ ניגוד פאזה לשינויים מורפולוגיים הדרגתיים מצורה משולשת קוצנית למורפולוגיה אופיינית של כבד המציגה מראה מצולע כדי להעריך כמותית את בדיקת תפקוד האנדודרם בכבד. עבור ציטוכרום P ארבע 50 פעילות אנזימטית, במיוחד SIP שלוש A ארבע או SIP אחד A שתיים. יום הדגירה הראשון 17.

תאי אנדודרם בכבד שמקורם ב-ESC אנושי עם המצע הספציפי המבצע תגובות בטריפליקטים. זכור להשתמש באמצעי תרבית רקמות כדגירה שלילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. אסוף את הסופרנטנטים ומדוד את הרמות היחסיות של הפעילות האנזימטית הבסיסית כמפורט בהוראות היצרן.

כעת, עבור כל דגימה, חשב את הפעילות האנזימטית למיליגרם חלבון כפי שנקבע על ידי A-B-C-A-S. צביעה חיסונית של תרביות טיפוסיות שמקורן בשיטה זו של התבגרות חוץ גופית של אנדודרם בכבד. להדגים ביטוי הומוגני של שלושה סמני כבד אנושיים, אלבומין FP ו-ein.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להבדיל ביעילות בין תאי גזע אנושיים ותאי גזע לומדים להפטוציטים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על בסיס יומי עם התחייבות של כשתי דקות וחצי למיליון תאים. חשוב מאוד לבדוק שינויים מורפולוגיים על בסיס יומי במהלך תהליך ההתמיינות.