פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים היווצרות של זרמי חיידקים במכשיר מיקרופלואידי, עם מיקרו עמודים. זה מושג על ידי ייצור תחילה של השבב המיקרופלואידי. השלב השני של ההליך הוא תרבית החיידקים שנבדקו, במקרה זה פלואורסצנציה פסאודומונס.

השלבים האחרונים הם להרכיב את מערך הניסוי, להזריק את החיידקים לשבב המיקרופלואידי ולאסוף נתונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות התפתחות זמן של סטרימרים באמצעות תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שפעת. הדגמה חזותית של מתכת זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השלבים השונים.

בגלל האופי הבין-תחומי של הניסוי, הליך זה דורש פרוסות סיליקון עם תחריט יונים תגובתי עמוק. יש לשטוף את הפוטו-רזיסט על הוופלים. התחל עם שקט תבנית המאסטר.

מוסיפים שתיים או שלוש טיפות של טריכלורואתילן לבקבוקון ומניחים אותו בחומר ייבוש יחד עם עיצוב התבנית כלפי מעלה לידו. בעוד שעתיים-שלוש התבנית תהיה מבודדת. במהלך הסילואיזציה, הכינו את בסיס הסיליקון לתערובת PDMS סיגר 1 8 4 עם חומר ריפוי ביחס של 10 לאחד.

לאחר מכן הסר את ה-PDMS תחת ואקום למשך כשעתיים. כעת העבירו רקיק מבודד למחזיק ושפכו עליו את ה- PDMS, וודאו שלא ייווצרו בועות. אפשר ל-PDMS להתרפא על הוופל ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

זה מייצר חותמת A-P-D-M-S מתבנית הסיליקון הגדולה. בסיום הריפוי, קלף את ה-PDMS stamp בעזרת חותך. לאחר מכן חותכים את החותמת לשבב מיקרופלואידי, בעזרת החותך.

כעת, בעזרת ליבת חיתוך קדחו חורים בעמדות הכניסה והאריכו חיים על החותמת. השלב הבא הוא להצמיד את החותמת לזכוכית. חשוף פתק כיסוי של 24 מילימטר ואת חותמת ה-PDMS לפלזמת חמצן למשך 30 שניות.

לאחר החשיפה, חבר את פתק הכיסוי לצד התחתון של חותמת ה-PDMS וייווצר קשר. מכניסים את המכלול לתנור של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי להשלים את התהליך לפרוטוקול זה, הכינו צלחות LB העשויות ממים טהורים במיוחד במינון של 50 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין בתוספת של 50 עד 55 מעלות צלזיוס.

כששופכים את הצלחות, ניתן לפוצץ בועות על ידי הבערתן. יש לתארך את הלוחות המקוררים והמוצקים ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס בניילון כסף. הכנתי גם מרק LB העשוי ממים טהורים במיוחד במינון של 50 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין.

אחסן את המרק בארבע מעלות צלזיוס וגם עטוף בנייר כסף. כעת מלאי תרבית של פסאודומונס פלואורסצנטי המאוחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס על לוחות LB, מפספסים את הלוחות בתבנית זיגזג ודוגרים אותם למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, קוטפים מושבה מהצלחת ומחסנים בקבוק של S טרי שהודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור של 150 סל"ד.

מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות לאחר הדגירה. לאחר מכן הכינו את הפתרון S two. הוסף חמישה מיליליטר של LB לשפופרת פלסטיק, ולאחר מכן הוסף מספיק מתמיסת S one עבור OD ב-600 ננומטר של 0.1, האופייני לניסוי ביופילם.

ראשית, הגדר את הניסוי באמצעות פינצטה חבר צינורות פלסטיק בקוטר פנימי של 0.20 אינץ 'לכניסות ויציאות של השבב המוכן. הצינורות חייבים להיות גמישים וארוכים מספיק. כאן הם בערך 20 אינץ'.

לאחר מכן מלאו את המזרקים בתמיסת S two. חבר מחטים קהות בגודל 30 והסר בועות. מניעת כניסת בועות אוויר לתעלה היא צעד קריטי, במיוחד בשל משך הקו של הניסוי.

בועות עלולות לפגוע במבנים הרכים שנוצרו על ידי החיידקים. לאחר מכן חבר את המזרקים לצינורות הכניסה וחבר את צינורות היציאה למיכלי פסולת. כעת מקם את המזרקים במשאבת מזרק והגדר את המשאבה לקצב הזרימה הרצוי, כגון שמונה מיקרוליטר לשעה במיקרוסקופ המצויד בתא תא המוגדר לטמפרטורת הדגירה.

השתמש במטרה של פי 40 אולי כדי לראות את השבב המיקרופלואידי. עכשיו, הפעל את המשאבה. כאשר החיידקים מוכנסים לתא, נוצרת גם היווצרות ביופילם.

הביופילם ייווצר ויתבגר במשך שעות, ימים, יצלם תמונות כדי לעקוב אחר התקדמותו. באמצעות SEMA צולם שבב מיקרופלואידי. הכניסה דמוית המזלג נוצרת כדי להשוות את ראש הלחץ על פני המכשיר.

ניתן לראות גם שקירות העמודים כמעט אנכיים. כדי לבחון את היווצרות הביופילם, הוזרקו למכשיר פלואורסצנטיות במהירות של שמונה מיקרוליטר לשעה. היווצרות הביופילם החלה לאחר מספר דקות של עירוי של תרבית החיידקים המדוללת.

עם זאת, לאחר מספר שעות נצפה מראה של מבנים חוטיים המשתרעים בין עמודי מיקרו ליד החלק האמצעי. האליפסה המקווקו תוחמת זרם יוצר זרמים שנוצרו קשורים בקצה אחד לאזור הקוטב של אחד מעמודי המיקרו. זרמים נראו גם לאורך האלכסון בין שני עמודי מיקרו.

עובי הסטרימרים גדל עם הזמן עקב חלוקת תאים, כמו גם שילוב של חיידקים פלנקטוניים. הם גם התרבו עם סטרימרים שתפסו נפח גדול במכשיר והובילו להיווצרות ביופילם בוגר, שעלול לסתום את המכשיר. סימולציה מכנית של זרימה דרך המכשיר מראה שסטרימרים מכוונים את עצמם בתחילה לאורך קווי ייעול נוזלים.

יתר על כן, בשלב הראשוני, הסטרימרים מקורם במקומות בעלי מהירות הזרימה הגבוהה ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד סטרימרים של ביופילם נוצרים ומתפתחים בסביבה מיקרופלואידית. אל תשכח שעבודה עם חיידקים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון פרוטוקולי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע הליך זה.