Name: פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: חקור את תהליך יצירת הזרמים הבקטריאליים בזרימה מיקרופלואידית עם מיקרו עמודים באמצעות Pseudomonas fluorescens. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על דינמיקת התפתחות הביופילם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפרופסור הווארד סרי מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת קלגרי על אספקת זני חיידקים. A. Kumar מודה על תמיכתה של NSERC. T. Thundat מודה על התמיכה הכספית מתוכנית הקתדרה למחקר מצוינות בקנדה (CERC). המחברים מבקשים גם להודות לעזרתה של גב' זהרה ניקכתארי על עזרתה בצילום וידאו.

בצע את פרוטוקולי הניסוי כאן לפי הסדר המתואר להלן. פרוטוקולי microfabrication ליצירת פלטפורמת microfluidic נדונים בשלב 1 שלב 2 מתאר את פרוטוקול תרבית החיידקים (איור 2), ושלב 3 נוגע להרכבה של ההתקנה הניסיונית (איור 3). לבסוף, הצעד הניסיוני בפועל מתואר בשלב 4. .1 נוהל ייצור שבבים הערה: נהלי בטיחות נאותה חייבים להיות במעקב במשך התהליכים שתוארו להלן. התייעץ עם קצין הבטיחות המוסדי לקבלת פרטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את המסכה עם תוכנה מתאימה (למשל, L-Edit). עיצוב הערוץ מורכב ממייקרו ערוץ עיקרי של 625 רוחב מיקרומטר. האזור של הערוץ המרכזי מכיל מערך של מיקרו הודעות 50 מיקרומטר בקוטר, במרווחי 25 מיקרומטר זה מזה (ראה משלים קבצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדפיס את העיצוב הזה על זכוכית &quot;x 5&quot; סיד כוס סודה (5), שבה יש עובי של 0.09 &quot;, והוא מצופה בכ 70 שכבה עבה ננומטר של כרום (Cr), באמצעות מיסוך על מנת להכין מסכת תמונה. מפתח השתמש AZ400K דקות 1. אז, לחרוט שכבת Cr באמצעות etchant Cr כ 1 דקות השתמשו אצטון להתפשט להתנגד ולנקות אותו עם פתרון פיראניה קר. (H 2 SO 4 וH 2 O 2 ביחס של 3: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photolithography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה פרוסות סיליקון 4 &quot;סטנדרטית כימי עם פתרון פיראניה עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקיק עם מים די ולייבש אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הרקיק על פלטה חשמלית (200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל פרוסות סיליקון עם photoresist. כאן, AZ4620 photoresist החיובי ספין מצופה על פרוסות סיליקון ב2,000 סל&quot;ד 25 שניות כדי לקבל שכבה עבה 12.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הממס על ידי אפייה רכה של הרקיק על פלטה חשמלית על ידי צף הרקיק ל90 שניות על זרימת חנקן ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשמור אותו בואקום ב tהוא אותה טמפרטורה ל60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות בתיבה כהה ל24 שעות להתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הרקיק לאור UV כדי להעביר את הדפוס שנועד photoresist. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את פרוסות בפתרון מפתח photoresist (AZ400K) ל240 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקיק עם אלכוהול איזופרופיל ולייבש אותו על ידי הצבת בזרם של גז חנקן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך - ICP-DRIE (ריאקטיבי העמוק יון תחריט פלזמה מצמידים אינדוקטיבי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תחריט DRIE. בחר את העומק לחרוט המתאים בהתאם לעומק סופי הנדרש למכשיר (50 מיקרומטר בחקירה זו). Photoresist פועל כשכבת מיסוך במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את photoresist שנותר עם אצטון ולנקות את הרקיק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS יציקה (polydimethylsiloxane) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש trichloromethylsilane (TCMS) לsilanizing עובש אב סיליקון. יוצקים 2 או 3 טיפות של trichloromethylsilane בבקבוקון ולמקם אותו בתא ייבוש לידעובש אב סיליקון. לאפשר 2-3 שעות לתהליך silanizing כדי להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכל נפרד, מערבב את בסיס סיליקון Sylgard 184 עם סוכן ריפוי על ידי יחס בין משקל 10: 1 להכין PDMS. דגה PDMS על ידי הכפפתו לואקום תנאים (כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עובש אב סיליקון בבעל. , ואז לשפוך את PDMS על עובש אב סיליקון כדי ליצור את חותמת PDMS. ודא שבועות לא יוצרות בPDMS במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את PDMS לשעה 2 ב 80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלפתי את חותמת PDMS מתבנית האב. לאחר מכן, חותך את PDMS להחתים לתוך שבבים נפרדים. לבסוף, להשתמש בליבת חיתוך לקדוח חורים לכניסה (ים) ושקע (ים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מליטה של ​​PDMS לזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את תלוש לכסות וחותמת PDMS לפלזמת חמצן ל30 שניות. חותמת בונד PDMS ללהחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג אטימה ראויה בין חותמת PDMS ולהחליק את המכסה, לחשל את המכשיר על ידי לשים אותו בתנור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li&gt; </ol></li></ol> .2 בקטריאלי תרבות הערה: פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים נכון חייבת להיות במעקב במשך השלבים 2-4. התייעץ עם קצין הבטיחות המוסדי לקבלת פרטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות LB אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגר 20 גרם לוריא-Bertani (LB) אבקות (מילר) ו500 מ&quot;ל מים ultrapure בבקבוק 1 ליטר. מערבבים להמסת האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ידי מעוקר ב 15 psi, 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הבקבוק להתקרר ל50-55 ° C על ספסל או באמבט מים במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את טטרציקלין האנטיביוטיקה כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מערבבים היטב על ידי מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך צלחות. ממלא כל צלחת עד 1/2 - מלא 2/3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר להבת בועות בקצרה כדי פופ אותם אם הם יוצרים. בועות אוויר הקרושה קשות כדי להפיץ את תרבות חיידקים על פני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצלחות להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם מגניבים,לשים צלחות בחזרה לשרוול שלהם, לאטום את השקית, תווית (אנטיביוטיקה ותאריך), ולאחסן ב 4 ° C.. הערה: כסה את המלאי של צלחות עם נייר אלומיניום, כמו אור מנטרל אנטיביוטיקה רבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB מרק הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מרק אבקות גרם לוריא-Bertani (LB) (מילר) ו1 ליטר של מים ultrapure לבקבוק. מערבבים להמסת האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ידי מעוקר ב 15 psi, 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר בקבוק להתקרר ל50-55 ° C על ספסל או באמבט מים במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את טטרציקלין האנטיביוטיקה כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מערבבים היטב על ידי מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קריר, למקם את הבקבוק שכותרתו ב 4 ° C.. הערה: כסה את הבקבוק עם נייר אלומיניום, כמו אור מנטרל אנטיביוטיקה רבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים תרבות על צלחת LB אגר (פרוטוקול זה משתמש Pseudomonas fluorescens) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מניית החיידקים מהמקפיא (-80 °; C) ולמקם אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את -80 ° C מניית החיידקים וצלחת אגר LB בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak זן החיידקים על גבי צלחת אגר LB בדגם זגזג. מכסה את הצלחת אגר ודגירה אותו ב30 ºC לילה. לבסוף, לאחסן את הצלחת במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון בקטריאלי (S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מ&quot;ל תקשורת מרק LB לבקבוק autoclaved. ביצוע פעולה זו בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מושבת חיידקים אחת מהצלחת אגר LB לבקבוק. גם פעולה זו צריכה להתבצע בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הבקבוק בחממה שייקר ב30 מעלות צלזיוס ו150 סל&quot;ד מספיק זמן (4 שעות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדולל בקטריאלי הפתרון (S2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 5 מ&quot;ל תקשורת מרק LB לתוך צינור פלסטיק מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל S1 על ידי ערבוב עם תקשורת מרק LB. ואז, מערבולת הפתרון. לדלל את הפתרון להשיג אופטי הרצוייםצפיפות אל (OD נמדד ב 600 ננומטר = 0.1). הערה: ניסויי Biofilm בדרך כלל להעסיק ערכי OD בסביבה זו. </li></ol></li></ol> .3 הכן את הגדרת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינצטה באמצעות חיבור צינורות גמישים מפלסטיק (0.20 &quot;ID) לכניסה (ים) ושקע (ים) של השבבים. פתחי הכניסה ושקעים שנקדחו בעבר לחלק PDMS של השבב האלקטרוני (צעד 1.5.5). בחקירה זו , השבב האלקטרוני מורכב משני פתחי הכניסה ויציאה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק (ים) עם פתרון חיידקים (פתרון S2) ולהסיר את כל הבועות במזרק (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה מזרק (ים) (30 0.5 &quot;מחט קהה G) לתוך צינור יניקה (ים). ואז, לחבר את הצינור לשקע (ים) לבזבז מיכל. </li></ol> .4 הפעל את הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המזרק (ים) ועד לקצה המזרק (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ומזרק תיקון (ים) על משאבת המזרק. לאחר מכן למקם את השבב תחת מיקרוסקופ אופטי עם עדשות אובייקטיביות של דסירהגדלת ed (למשל, 40X). כסה השבב האלקטרוני עם מכשיר קאמרי תא חי כדי לשמור על סביבת טמפרטורה קבועה להתפתחות חיידקים (C ° 30 לפ fluorescens). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה לרמת קצב זרימה הרצויה (למשל 10 μl / hr) וליזום שאיבת נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחיידקים הם הציגו לתוך התא, היווצרות biofilm גם יזם. היווצרות biofilm והתבגרות מתרחשות בדרך כלל על פני תקופה של כמה שעות או אפילו ימים. להתבונן ולקחת תמונות של צמיחת biofilm מבעד למיקרוסקופ. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנחנו הפגנו מכשיר microfluidic פשוט המחקה תווך נקבובי ללימוד פיתוח biofilm בבתי גידול מורכב. יש כמה שלבים קריטיים המכתיבים את תוצאות הניסויים. הם כוללים גיאומטריה מכשיר. בעוד בהודעה הגיאומטריה יכולה להשתנות, נקבובי המרחב מספיק לסרטים כדי ליצור יש צורך. יתר על כן, Valiei et al. 1 הוכיח כי היווצרות נחלים מתרחשת רק בטווח קצב זרימה מסוים. בספיקות נמוכות מערך סף, עיוות של biofilms לסרטים לא יכולה להיות שנצפתה. עם זאת, מעל ערך קצב זרימת סף אחר מסוים, שבר biofilm יכול...

לאחרונה, הפגנו דינמיקת היווצרות biofilm חיידקים במכשיר microfluidic המחקה תווך נקבובי 1. biofilms חיידקים הם למעשה מושבות של חיידקי משטח מצטבר שנארזות על ידי חומרים תאיים פולימרים (EPS) 2-4. סרטים דקים אלה של חיידקים יכולים להיווצר כמעט בכל נישה אפשרית, החל ממשטחים חלקים לגידול הרבה יותר מורכב של תווך נקבובי. Valiei et al. 1 משמש מכשיר microfluidic עם מערך של מיקרו עמודים כדי לדמות מבנה תווך נקבובי ולמד היווצרות biofilm במכשיר זה כפונקציה של קצב זרימת נוזל. הם מצאו כי בזרימה משטר מסוים, biofilms הסיבי הידוע בסרטים החל לצוץ בין עמודים שונים. יכולים להיות קשורים סרטים באחד או בשני קצוות למשטחים מוצקים, אבל שאר המבנה מושעה בנוזל. היווצרות Streamer בדרך כלל מתחילה לאחר שכבה ראשונית של biofilm יצרה והפורמט שלהיון יכול להכתיב את ההתפתחות ארוכת הטווח של biofilm בבתי גידול מורכב כאלה. לאחרונה, מספר חוקרים חקרו את הדינמיקה של היווצרות נחלים. יזדי et al. 5 הראה כי הסרטים יכולים להיווצר בתזרים טרנדו שמקורם בבועת נדנוד. בניסוי אחר, רוסקוני et al. 6 חקר את ההשפעה של עקמומיות ערוץ וגיאומטריה ערוץ על ההיווצרות של סרטים. הם מצאו כי הסרטים יכולים ליצור בסעיפים מעוגלים של microchannels, ומורפולוגיה נחלים קשורה לתנועתיות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי סרטים יכולים להיות לו השלכות רחבות בתרחישים טבעיים ומלאכותיים שונים כפי שהם יכולים לפעול כמבשרים להיווצרות של מבנים בוגרים בממשקים נקבוביים, יובילו להתפשטות biofilm מהירה והרה אסון במערכות ביו, וגם לגרום לflow- המשמעותי אינטראקציות מבנה, וכו &#39;1,7-9. לעתים קרובות סרטי biofilm טופס Iבתי גידול n מורכבים כגון תווך נקבובי. צמיחת biofilm הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית היא רלוונטית למספר תהליכים סביבתיים ותעשייתיים כגון טיפול ביולוגי בשפכים 10, שמירה גם נשא שלמות במצבים כגון CO 2 ללכוד 11 וחיבור של הנקבוביות באדמה 12. התבוננות היווצרות biofilm בבתי גידול מורכב כזה יכול לעתים קרובות להיות מאתגרת בשל האטימות של תווך נקבובי. במצבים כאלה, פלטפורמות תווך נקבוביות מיקרופלואידיקה מבוססת יכולות להוכיח יתרון מאוד מאחר שהם מאפשרים בזמן אמת ובניטור באתר. יתרון נוסף של מיקרופלואידיקה הוא היכולת לבנות bioreactors מרובה בפלטפורמה יו-microfluidic אחת ובו זמנית לאפשר לניטור ו / או שילוב של חיישנים מקוונים. הגמישות ליישם ניסויי מעבדה מרובים במכשיר אחד ואת היכולת לאסוף נתונים רלוונטיים משמעותיים לניתוח סטטיסטי מדויק היא עו&quot;ד חשובantage של מערכות microfluidic 13,14. בהקשר של הדיון לעיל, דינמיקת היווצרות נחלים הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית תהיה מועילה למספר יישומים. במחקר זה, אנו מפתחים פרוטוקול לחקירת היווצרות נחלים במכשיר שתווך נקבובי מחקה. ייצור של פלטפורמת microfluidic, צעדים דרושים לתרבית תאים וניסויים מתוארים. בניסויים שלנו, זן חיידקים מהסוג בר של fluorescens Pseudomonas הועסק. פ fluorescens, נמצא באופן טבעי באדמה, ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על האקולוגיה קרקע 15. זן החיידקים המועסקים היה מהונדס גנטי כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) constitutively.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>פישר</td><td>BP1425-500</td><td>להשעות 40 גרם ב -1 ליטר מים מטוהרים</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>פישר</td><td>BP1427-500</td><td>להשעות 20 גרם ב -1 ליטר מים מטוהרים</td></tr><tr><td>קולט אדים בטיחות ביולוגית</td><td>תאגיד</td><td></td><td></td>Microzone</tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר</td><td>875712</td><td>סטרילית 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן</td></tr><tr><td>שייקר חממה</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td></td><td>Excella E24 סדרת שייקר חממה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה מעוקר</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td>פוליפרופילן RNase - / DNase</td></tr><tr><td>ללא טטרציקלין בסיס</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 & #956; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 סיליקון</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>בסיס אלסטומר וחומר ריפוי</td></tr><tr><td>פוזיטיב פוטו-רזיסט (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור פלסטיק</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול ליצירת biofilm streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

כמה מינים של חיידקים בעלי היכולת לצרף למשטחים וליישב אותם בצורה של סרטים דקים שמכסים. Biofilms שגדלים בתווך נקבובי רלוונטי לכמה תהליכים תעשייתיים וסביבתיים כגון טיפול בשפכים וCO 2 קיבוע. אנחנו השתמשנו Pseudomonas fluorescens, חיידק אירובי גראם שלילית, לחקור היווצרות biofilm במכשיר microfluidic שמחק תווך נקבובי. מכשיר microfluidic מורכב ממערך של מיקרו הודעות, שהיו מפוברקים באמצעות רכה ליתוגרפיה. בהמשך לכך, היווצרות biofilm במכשירים אלה עם זרימה נחקרה ואנחנו מדגימים את היווצרות biofilms הסיבי הידוע בסרטים במכשיר שלנו. הפרוטוקולים מפורטים לייצור והרכבה של מכשיר microfluidic מסופקים כאן יחד עם פרוטוקולי תרבות החיידקים. נהלים מפורטים לניסויים עם מכשיר microfluidic גם מוצגים יחד עם נציגתוצאות.

באמצעות פרוטוקול microfabrication שהוזכר לעיל, מכשיר microfluidic מבוסס PDMS נבנה. איור 1 מציג את מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק (SEM) תמונות של PDMS מכשיר. איור 1 א מציג את סעיף הכניסה של המכשיר. כניסה כמו מזלג נוצרה כדי להשוות ראש בלחץ על פני המכשיר. הדמיה SEM נוספת הראתה גם כי קירות העמוד כמעט אנכיים (איור 1b). הפתרון התרבותי חיידקים (איור 2) היה מדולל והצפיפות האופטית שלה הותאמה לערך של 0.1. בדקנו היווצרות biofilm...

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את היווצרותם של זרמי חיידקים (bacterial streamers) במכשיר מיקרופלואידי עם מיקרו-עמודים. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור השבב המיקרופלואידי. השלב השני של ההליך הוא גידול החיידקים הנבדקים, ובמקרה זה *Pseudomonas fluorescence*.השלבים האחרונים הם הרכבת המערך הניסיוני, הזרקת החיידקים לתוך השבב המיקרופלואידי ואיסוף הנתונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את התפתחותם של הזרמים (streamers) לאורך זמן באמצעות תמונות מיקרוסקופיה פלוורסצנטית. הדגמה חזותית של שלב זה היא קריטית, שכן השלבים השונים קשים ללמידה.בשל האופי הבין-תחומי של הניסוי, הליך זה דורש פרוסות סיליקון שעברו תהליך של תסריג יונים ריאקטיבי עמוק (deep reactive ion etching). יש לשטוף את הפוטורזיסט מהפרוסות. התחילו בשטיפת התבנית הראשית (master mold).הוסיפו שתי או שלוש טיפות של טריכלורואתילן לבקבוקון והניחו אותו במייבש יחד עם התבנית כאשר חלקו העליון פונה כלפי מעלה לצידו. תוך שעתיים או שלוש, התבנית תעבור סילוזיציה. במהלך הסילוזיציה, הכינו את תערובת ה-PDMS על ידי ערבוב בסיס סיליקון עם סוכן הקשחה ביחס של 10 ל-1.לאחר מכן, בצעו דגזציה ל-PDMS תחת ואקום למשך כשעתיים. כעת, העבירו פרוסת סיליקון (wafer) שעברה סילוזציה למחזיק ומזגו עליה את ה-PDMS, תוך הבטחה שלא ייווצרו בועות. הניחו ל-PDMS להתבשות על הפרוסה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים.שלב זה כולל ייצור של חותמת A-P-D-M-S מהתבנית הסיליקונית בממדים הרלוונטיים. עם השלמת תהליך הפילם (curing), קלפו את חותמת ה-PDMS בעזרת סכיר. לאחר מכן, חיתכו את החותמת לצורת שבב מיקרופלואידי באמצעות הסכיר.כעת, השתמשו במקדח ליבה כדי לקדוח חורים במיקומי הכניסה והיציאה בחותם. השלב הבא הוא הדבקת החותם לזכוכית. חשפו לוח כיסוי של 24 מילימטר ואת חותם ה-PDMS לפלסמה של חמצן למשך 30 שניות.לאחר החשיפה, הצמידו את זכוכית הכיסוי לצדו התחתון של חותמת ה-PDMS כדי שיווצר חיבור. הניחו את המכלול בתנור בטמפרטורה של 70 °C למשך 10 דקות. להשלמת התהליך עבור פרוטוקול זה, הכינו מצעי LB שהוכרו במיאולטרה-טהור והוסיפו להם Tetracycline בריכוז של 50 µg/mL בטמפרטורה של 50 עד 55 °C.בעת יציקת המצעים, ניתן לפוצץ בועות על ידי שריפה קלה עם מבער. יש לתאריך את המצעים לאחר שהתקררו והתגבשו, ולאחסנם בטמפרטורה של 4 °C בעטיפת נייר אלומיניום. כמו כן, יש להכין מראש מצע LB broth המורכב ממים מזוקקים (ultra pure water) ובתוספת 50 µg/mL של tetracycline.יש לשמור את המצע הנוזלי בטמפרטורה של 4 °C וכמו כן לעטוף אותו בנייר גבינה. כעת, יש להעביר מלקטוני cultivos של *Pseudomonas fluorescence* השמורים בטמפרטורה של 80- °C על פלטות LB, לקריע את הפלטות בתבנית זיגזג ולהדגיר אותן למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C בחושך. למחרת, יש לבחור מושבה מהפלטה ולהחדיר אותה לבקבוק של מצע S1 שהוכן טרי, ולהדגיר למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור של 150 RPM.מדדו את הצפיפות האופטית של התרבית לאחר הדגירה. לאחר מכן, הכינו את תמיסת S two. הוסיפו חמישה מיליליטרים של LB לשפורור פלסטיק, ולאחר מכן הוסיפו כמות מספקת של תמיסת S one כדי להגיע ל-OD ב-600 nanometers של 0.1, ערך האופייני לניסוי בביופילם.ראשית, הכינו את הניסוי באמצעות פינצטה. חברו צינורות פלסטיק בעלי קוטר פנימי של 0.20 inches לכניסות וליציאות של השבב שהוכן. על הצינורות להיות גמישים וארוכים מספיק. במקרה זה, אורכם כ-20 inches.לאחר מכן, מלאו את המזרקים בתמיסת S two. חברו מחטים קהות במידה 30 והסִירו בועות אוויר. מניעת חדירת בועות אוויר לתעלה היא שלב קריטי, במיוחד בשל משך הזמן של הניסוי.בועות עלולות לפגוע במבנים הרכים שנוצרו על ידי החיידקים. לאחר מכן, חברו את המזרקים לצינורות הכניסה ואת צינורות היציאה למכלי פסולת. כעת מקמו את המזרקים במשאבת מזרקים והגדירו את קצב הזרימה הרצוי, למשל 8 µL לשעה, על מיקרוסקופ המצויד בתא תאים המוגדר לטמפרטורת דגירה.השתמשו בעדשה עם הגדלה של 40x כדי לצפות בשבב המיקרופלואידי. כעת, הפעילו את המשאבה. כאשר החיידקים מוכנסים לתא, מתחיל גם תהליך היווצרות הביופילם.הביופילים יתגבש ויבשיל במשך שעות או ימים, ויתבצעו צילומים למעקב אחר התקדמותו. נעשה שימוש בשבב מיקרופלואידי שיוצר בשיטת SEMA לצורך הצילום. פתח דמוי מזלג נועד להשוות את לחץ ההזנה לאורך המכשיר.ניתן לראות גם כי דפנות העמודים הן כמעט אנכיות. כדי לבחון את היווצרות הביופילם, הוזרקו חומרי פלואורסצנציה למכשיר בקצב של eight microliters per hour. היווצרות הביופילם החלה לאחר מספר דקות של עירוי של תרבית החיידקים המדוללת.עם זאת, לאחר מספר שעות, נצפו מבנים סיביים הנשכים בין מיקרו-עמודים באזור מרכז הדגימה. האליפסה המקווקווקת מסמנת streamer שנוצר, כאשר streamers נוצרו כשהם קשורים בקצם אחד לאזור הקוטב של אחד המיקרו-עמודים. streamers נצפו גם לאורך האלכסון שבין שני מיקרו-עמודים.עובי הסטרימרים (streamers) גדל עם הזמן עקב חלוקת תאים, כמו גם שילוב של חיידקים פלנקטוניים. הם גם proliferated עם הזמן, והסטרימרים שתפסו נפח גדול במכשיר הובילו להיווצרות של ביופילם בוגר, שעלול היה לסתום את המכשיר. סימולציה מכנית של זרימה דרך המכשיר מראה כי הסטרימרים מכוונים את עצמם בתחילה לאורך קווי הזרימה של הנוזל.יתרה מכך, בשלב הראשוני, הסטרימרים (streamers) נוצרים במיקומים שבהם מהירות הזרימה היא הגבוהה ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו סטרימרים של ביופילם נוצרים ומתפתחים בסביבה מיקרופלואידית. אל תשכחו כי עבודה עם חיידקים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון פרוטוקולי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע הליך זה.

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

מקור: קורץ, ד. ל. ואחרים. פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סגימה ביולוגית במדיה נקבובית. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לחקר יצירת ביופילם. השעיה חיידקית מוכנסת לתעלה המיקרו, ואחריה אינקובציה לאפשר התפתחות ביופילם. לאחר מכן מתחדשת הזרימה, וניטור לחץ יחד עם הדמיה משמש לזיהוי היווצרות ביופילם וחסימת נקבוביות לאורך זמן.

מכשיר מיקרופלואידי להדמיה בזמן אמת ומעקב לחץ במהלך יצירת ביופילם

מוצג הליך ליצירה והדמיה של גשרים נימיים בגיאומטריה של חריץ-נקבוביות. יצירת גשרים נימיים מסתמכת על היווצרות עמודים כדי לספק הטרוגניות פיזית וכימית כיוונית להצמיד את הנוזל.  גשרים נימיים נוצרים ומתומרנים באמצעות מיקרו-במה ומדמיינים באמצעות מצלמת CCD.

ייצור והדמיה של גשרים נימיים בגיאומטריית חריץ נקבוביות

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

אנו מציגים טכנולוגיה המשתמשת בהרכבה בסיוע נימי בפלטפורמה מיקרופלואידית כדי לעצב עצמים בגודל מיקרו המושעים בנוזל, כגון חיידקים וקוליואידים, למערכים שנקבעו על מצע פולידימתילסילוקסן.

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית כמו-דו-ממדית על ידי שילוב של דימות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה עם מדידות הפרשי לחצים בו זמנית. הפלטפורמה מכמתת את ההשפעה של גודל הנקבוביות וקצב זרימת הנוזלים במדיה נקבובית על סתימה ביולוגית.

פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סתימה ביולוגית במדיה נקבובית

חקור את תהליך יצירת הזרמים הבקטריאליים בזרימה מיקרופלואידית עם מיקרו עמודים באמצעות Pseudomonas fluorescens. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על דינמיקת התפתחות הביופילם.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

גלה סרטונים נוספים