פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים
20 באוגוסט 2014
נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים היווצרות של זרמי חיידקים במכשיר מיקרופלואידי, עם מיקרו עמודים. זה מושג על ידי ייצור תחילה של השבב המיקרופלואידי. השלב השני של ההליך הוא תרבית החיידקים שנבדקו, במקרה זה פלואורסצנציה פסאודומונס.
השלבים האחרונים הם להרכיב את מערך הניסוי, להזריק את החיידקים לשבב המיקרופלואידי ולאסוף נתונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות התפתחות זמן של סטרימרים באמצעות תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שפעת. הדגמה חזותית של מתכת זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השלבים השונים.
בגלל האופי הבין-תחומי של הניסוי, הליך זה דורש פרוסות סיליקון עם תחריט יונים תגובתי עמוק. יש לשטוף את הפוטו-רזיסט על הוופלים. התחל עם שקט תבנית המאסטר.
מוסיפים שתיים או שלוש טיפות של טריכלורואתילן לבקבוקון ומניחים אותו בחומר ייבוש יחד עם עיצוב התבנית כלפי מעלה לידו. בעוד שעתיים-שלוש התבנית תהיה מבודדת. במהלך הסילואיזציה, הכינו את בסיס הסיליקון לתערובת PDMS סיגר 1 8 4 עם חומר ריפוי ביחס של 10 לאחד.
לאחר מכן הסר את ה-PDMS תחת ואקום למשך כשעתיים. כעת העבירו רקיק מבודד למחזיק ושפכו עליו את ה- PDMS, וודאו שלא ייווצרו בועות. אפשר ל-PDMS להתרפא על הוופל ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
זה מייצר חותמת A-P-D-M-S מתבנית הסיליקון הגדולה. בסיום הריפוי, קלף את ה-PDMS stamp בעזרת חותך. לאחר מכן חותכים את החותמת לשבב מיקרופלואידי, בעזרת החותך.
כעת, בעזרת ליבת חיתוך קדחו חורים בעמדות הכניסה והאריכו חיים על החותמת. השלב הבא הוא להצמיד את החותמת לזכוכית. חשוף פתק כיסוי של 24 מילימטר ואת חותמת ה-PDMS לפלזמת חמצן למשך 30 שניות.
לאחר החשיפה, חבר את פתק הכיסוי לצד התחתון של חותמת ה-PDMS וייווצר קשר. מכניסים את המכלול לתנור של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי להשלים את התהליך לפרוטוקול זה, הכינו צלחות LB העשויות ממים טהורים במיוחד במינון של 50 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין בתוספת של 50 עד 55 מעלות צלזיוס.
כששופכים את הצלחות, ניתן לפוצץ בועות על ידי הבערתן. יש לתארך את הלוחות המקוררים והמוצקים ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס בניילון כסף. הכנתי גם מרק LB העשוי ממים טהורים במיוחד במינון של 50 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין.
אחסן את המרק בארבע מעלות צלזיוס וגם עטוף בנייר כסף. כעת מלאי תרבית של פסאודומונס פלואורסצנטי המאוחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס על לוחות LB, מפספסים את הלוחות בתבנית זיגזג ודוגרים אותם למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, קוטפים מושבה מהצלחת ומחסנים בקבוק של S טרי שהודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור של 150 סל"ד.
מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות לאחר הדגירה. לאחר מכן הכינו את הפתרון S two. הוסף חמישה מיליליטר של LB לשפופרת פלסטיק, ולאחר מכן הוסף מספיק מתמיסת S one עבור OD ב-600 ננומטר של 0.1, האופייני לניסוי ביופילם.
ראשית, הגדר את הניסוי באמצעות פינצטה חבר צינורות פלסטיק בקוטר פנימי של 0.20 אינץ 'לכניסות ויציאות של השבב המוכן. הצינורות חייבים להיות גמישים וארוכים מספיק. כאן הם בערך 20 אינץ'.
לאחר מכן מלאו את המזרקים בתמיסת S two. חבר מחטים קהות בגודל 30 והסר בועות. מניעת כניסת בועות אוויר לתעלה היא צעד קריטי, במיוחד בשל משך הקו של הניסוי.
בועות עלולות לפגוע במבנים הרכים שנוצרו על ידי החיידקים. לאחר מכן חבר את המזרקים לצינורות הכניסה וחבר את צינורות היציאה למיכלי פסולת. כעת מקם את המזרקים במשאבת מזרק והגדר את המשאבה לקצב הזרימה הרצוי, כגון שמונה מיקרוליטר לשעה במיקרוסקופ המצויד בתא תא המוגדר לטמפרטורת הדגירה.
השתמש במטרה של פי 40 אולי כדי לראות את השבב המיקרופלואידי. עכשיו, הפעל את המשאבה. כאשר החיידקים מוכנסים לתא, נוצרת גם היווצרות ביופילם.
הביופילם ייווצר ויתבגר במשך שעות, ימים, יצלם תמונות כדי לעקוב אחר התקדמותו. באמצעות SEMA צולם שבב מיקרופלואידי. הכניסה דמוית המזלג נוצרת כדי להשוות את ראש הלחץ על פני המכשיר.
ניתן לראות גם שקירות העמודים כמעט אנכיים. כדי לבחון את היווצרות הביופילם, הוזרקו למכשיר פלואורסצנטיות במהירות של שמונה מיקרוליטר לשעה. היווצרות הביופילם החלה לאחר מספר דקות של עירוי של תרבית החיידקים המדוללת.
עם זאת, לאחר מספר שעות נצפה מראה של מבנים חוטיים המשתרעים בין עמודי מיקרו ליד החלק האמצעי. האליפסה המקווקו תוחמת זרם יוצר זרמים שנוצרו קשורים בקצה אחד לאזור הקוטב של אחד מעמודי המיקרו. זרמים נראו גם לאורך האלכסון בין שני עמודי מיקרו.
עובי הסטרימרים גדל עם הזמן עקב חלוקת תאים, כמו גם שילוב של חיידקים פלנקטוניים. הם גם התרבו עם סטרימרים שתפסו נפח גדול במכשיר והובילו להיווצרות ביופילם בוגר, שעלול לסתום את המכשיר. סימולציה מכנית של זרימה דרך המכשיר מראה שסטרימרים מכוונים את עצמם בתחילה לאורך קווי ייעול נוזלים.
יתר על כן, בשלב הראשוני, הסטרימרים מקורם במקומות בעלי מהירות הזרימה הגבוהה ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד סטרימרים של ביופילם נוצרים ומתפתחים בסביבה מיקרופלואידית. אל תשכח שעבודה עם חיידקים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון פרוטוקולי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בפרוטוקולים לבדיקת היווצרות ביופילם באמצעות מכשיר מיקרופלואידי שנועד לחקות מצעים נקבוביים. הדגש הוא על חקירת היווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens בתוך מכשיר זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- היווצרות ביופילם
- התנהגות חיידקית
רקע
- התקני מיקרופלואידיקה יכולים לשחזר סביבות מורכבות.
- Pseudomonas fluorescens הוא אורגניזם מודל למחקרים על ביופילם.
- הבנת התהליך של היווצרות ביופילם היא קריטית ליישומים שונים.
- ויזואליזציה של זרמי חיידקים (streamers) משפרת את ההבנה של דינמיקת הביופילם.
מטרת המחקר
- להדגמת היווצרות זרמי חיידקים (bacterial streamers) במערך מיקרופלואידי.
- לחקירת התנהגותם של Pseudomonas fluorescens בסביבה מבוקרת.
- לספק ייצוג חזותי של התפתחות ביופילם.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור של שבב מיקרופלואידי עם מיקרו-עמודים.
- גידול של Pseudomonas fluorescens לצורך ניסוי.
- הרכבת מערך הניסוי לצפייה בביופילם.
- הזרקת חיידקים למכשיר המיקרופלואידי ואיסוף נתונים.
תוצאות עיקריות
- ההתפתחות של זרמי חיידקים (bacterial streamers) לאורך זמן נלכדה בהצלחה.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סיפקה תמונות ברורות של היווצרות ביופילם.
- התוצאות הדגימו את הדינמיקה של התפתחות הביופילם.
- עזרים חזותיים שיפרו את ההבנה של התהליך הניסיוני.
מסקנות
- המכשיר המיקרופלואידי מדמה ביעילות מדיה נקבובית למחקרי ביופילם.
- Pseudomonas fluorescens משמש כמודל בעל ערך למחקרי ביופילם.
- הדגמות חזותיות הן חיוניות להבנת פרוצדורות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פרוטוקול זה מאפשר את חקרם של זרמי ביופילם חיידקיים (biofilm streamers) בסביבה מיקרופלואידית המדמה מדיה נקבובית, ומספק מערכת מבוקרת לבדיקת דינמיקת הידבקות והתנחלות מיקרוביאלית הרלוונטית להצטברות לכלוך (fouling) תעשייתי ולתהליכים סביבתיים. באמצעות ויזואליזציה של היווצרות ביופילם פילמנטרי תחת זרימה, חוקרים יכולים להעריך מנגנוני פיתוח של ביופילם בשלבים מוקדמים, המהווים בסיס לאסטרטגיות למניעת הצטברות לכלוך ולאופטימיזציה של ביו-תהליכים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכנית (mechanistic de-risking) בתהליך תיקוף המטרה עבור התערבויות אנטי-מיקרוביאליות או כאלו המשבשות ביופילם, על ידי אספקת תצפיות כמותיות וניתנות לשחזור של תחילת היווצרות והבשלת הזרמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של היצמדות חיידקים ויצירת מטריצה חוץ-תאית בתנאי זרימה מבוקרים, כדי לתקף מטרות המעורבות בתחילת היווצרות של ביופילם.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה מיקרופלואידית הניתנת לשחזור לסריקה של מודולטורים גנטיים או כימיים של היווצרות "סטרימרים" (streamers) ב-Pseudomonas fluorescens.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כמותיים ובעלי רזולוציית זמן של עובי וכיסוי הסטרימרים (streamers) לצורך ניתוח תגובה למינון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי היווצרות הביופילם באמצעות בקרת קצב זרימה מדויקת וגאומטריית השבב, ובכך משפר את הדירות של הבדיקה לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהערכה של תרכובות המשבשות ביופילם במערכת רלוונטית למחלה המדמה קולוניזציה מיקרוביאלית בנישות תעשייתיות או סביבתיות.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף פרה-קליני על ידי קישור תצפיות מיקרופלואידיות לתוצאות ביופילם מאקרוסקופיות, כגון סתימת מכשירים וחסימת זרימה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נשארת בתוך רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לאופטימיזציה של מועמדים מובילים, ובמיוחד עבור תוכניות המתמקדות בחומרים אנטי-זיהומיים או אנטי-פאולינג שבהם היווצרות ביופילם מהווה חיסרון מרכזי.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של האופן שבו הפרעות גנטיות או כימיות משפיעות על תחילת היווצרותם וההתארכות של streamer-ים בין מיקרו-עמודים.
- סריקה: מספקת פלטי דימוג כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה של היווצרות ביופילם בין תנאים ניסיוניים שונים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של עובי ה-streamer, כיוונו וכיסוי פני השטח לאורך זמן כדי להעריך את יעילות התרכובת.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תצפיות מיקרופלואידיות לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי מידול התפתחות ביופילם בסביבות מובנות הדומות למשטחים רפואיים או תעשייתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה מיקרופלואידית מודולרית הניתנת להתאמה לזנים חיידקיים אחרים או לתנאי זרימה שונים עבור יישומים רחבים של מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהיווצרות ביופילם על ידי בידוד השפעת הזרימה והטופולוגיה של הפני השטח על התפתחות סטרימרים (streamers).
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ייצור בליתוגרפיה רכה ופרוטוקולי חיסון חיידקי מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go בתוכניות אנטי-מיקרוביאליות על ידי אספקת ביטחון ניבוי מוקדם ביעילות עיכוב הביופילם.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מועמדים מותאם סיכון על בסיס יכולתם למנוע הבשלה של ביופילם המתווכת על ידי סטרימרים והצטברות לכלוך במערכת (fouling).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מיקרופלואידי, טיפול סטרילי בחיידקים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לציוד חדר נקי לצורך יצירת תבניות PDMS והדבקה באמצעות פלזמה של חמצן.
- מחייב סטנדרטיזציה של קצבי זרימה, אינוקולום חיידקי וזמני דגירה בין משתמשים ואתרים שונים.
- התאמה למCיני חיידקים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי התרבית ותאימות פני השטח.
- מגבלות מעשיות כוללות סתימה פוטנציאלית של התעלים בשלבים מתקדמים של הביופילם, מה שמחייב קביעת תזמון נקודת סיום לדימוג.
