שימוש בתפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור ביופילמים של פלאק דנטלי המייצגים הרכבה של מינים מרובים. לצורך ניתוח במקביל, הדבר מושג תחילה על ידי יצירת מצע ואינוקולום מייצגים. לאחר דגירה של לילה, האינוקולום מוחדר לשבב המיקרופלואידי, ובתוכו נוצר ביופילם בערוץ המיקרו.

לבסוף, שוטפים את הביופילם וצובעים אותו לצורך מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת (CLSM) או מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית (epi-fluorescence microscopy) in situ. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה (flow cells), הוא שמדובר במערכת בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת ביצוע של מספר ניסויים במקביל, תוך שימוש בחומרים מועטים יותר וללא צורך במצעי מעבדה מלאכותיים. כדי להתחיל, אספו דגימות רוק מקבוצה של חמישה מתנדבים או יותר לתוך מבחנות פלסטיק אינדיבידואליות בנפח 50 milliliter.

העבירו את דגימות הרוק לכלי קיבול פלסטי יחיד המונח על קרח. הימנעו משימוש בכלי זכוכית בהגדרות אלו, כיוון שביופולימרים של רוק נוטים להיצמד למשטחי זכוכית. לאחר מכן, הוסיפו dithiothreitol לדגימה עד שריכוזו הסופי יהיה 2.5 millimolar.

ערבב את התערובת במשך 10 דקות על קרח. העבר את כל התוכן למספר מבחנות פלסטיק. בצע ספינטרד (spin down) במהירות גבוהה למשך 30 דקות בצנטריפוגה מקוררת ל-4 °C כדי להפריד חלקיקים מהדגימה.

העבירו את עליית הרוק למכל סטרילי וחדש והשליכו את פלקציית המשקע כדי להכין מצע גידול נטול חיידקים מהדגימה. ראשית, דללו את הדגימה הנקייה משאריות תאים בשלושה נפחים של מים דה-יוניים. לאחר מכן, השתמשו במסנן ממбраנה עם נשירה נמוכה של חלבונים בנקבים של 0.22 micro.

סטריליזו את הרוק תוך שמירה על הפракציה המסוננת בקירור על קרח. העבירו את התמיסה הסטרילית לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. אספו דגימות רוק מקבוצה של חמישה מתנדבים או יותר לתוך מבחנות פלסטיק סטריליות בנפח 50 מיליליטר.

העבירו את דגימות הרוק לכלי בקרה מפלסטיק שעבר עיקור מראש בטמפרטורת החדר, או למבחנה בנפח 50 milliliter. הוסיפו גליצרול שעבר עיקור עד להשגת תערובת של 25%glycerol ו-75%saliva.

בניגוד לפרוטוקול של מצע הגידול שבו מזהמים הוסרו באמצעות שלב סינון, טכניקה סטרילית היא חשובה כאן כדי למנוע זיהום מחיידקים או פטריות שאינם ספציפיים לחלל הפה. ערבבו את תמיסת הרוק והגליצרין. חלקו את תערובת הרוק והגליצרין למנות שוות ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C עד למועד תחילת השימוש.

רכשו או ייצרו שבב מיקרופלואידי עם מיקרוערוץ בדומה לאלו המוצגים כאן, לפניe הזכרת דגימות לתוך השבב עבור מצע גידול נטול חיידקים ועבור תמיסת חידוע חיובית לחיידקים על השולחן בטמפרטורת החדר. ערבבו כל מבחנה באמצעות וורטקס למשך חמש שניות לפני ההמשך לניסוי הראשי; התחילו בהוספת 100 µL של מצע הגידול למאגר היציאה של השבבים המיקרופלואידיים. באמצעות משאבה בבקרת מחשב, התחילו זרימת גזירה של המצע דרך המיקרוערוץ למשך שתי דקות.

בטמפרטורת החדר, בצעו בדיקה ויזואלית של כל תעלה כדי לוודא מילוי תקין של הנוזל. דגרו את השבב המיקרופלואיד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. פעולה זו תצפה את דפנות התעלה המיקרוסקופית בפיגום של ביופולימר, אליו יעגן הביופילם במהלך הצמיחה.

לאחר מכן, שאבו ידנית את המדיום שנותר ממאגר היציאה והעבירו פראקציה זו, שתשמש כעת כעומס איזון הידרודינמי, למאגר הכניסה. לאחר השקעת פיגום הביופולימר, הוסיפו 100 µL של אינוקולום חיובי של חיידקים למאגר היציאה. הניחו את המיקרוצ'יפ על פלטה חמה בטמפרטורה של 37 °C והתחילו זרימה חוזרת עם גזירה בינונית.

העבר את הנוזל מהיציאה למאגר הכניסה במשך שש שניות בדיוק. לאחר מכן, כבה את המשאבה והדגר את השב בתנאים סטטיים ב-37 °C למשך 40 דקות כדי להקל על היצמדות החיידקים או הפטריות לדפנות הערוץ המיקרופלואידי. לאחר מכן, הסר והשלך את כל האינוקולום ממאגר היציאה באמצעות פיפטה, ומלא מחדש את אותו המאגר על ידי הוספת 1 mL של מצע גידול נקי מחיידקים.

דגרו את השבב המיקרופלואידי בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-20 שעות תחת זרימה בעלת מאמץ גזירה נמוך כדי לעודד צמיחת ביופילם בתוך התעלה במהלך גידול לילה. שאבו החוצה את כל התמיסות both מהמאגרי הכניסה והיציאה. הוסיפו 100 µL של PBS למאגר הכניסה ושטפו את המיקרו-תעלה למשך 20 דקות.

תחת זרימה קדימה בעוצמה נמוכה מהכניסה אל היציאה, הביופילם מוכן כעת לצביעת חי-מת. רגע לפני צביעת הביופילם, הכין 100 µL מתערובת צביעת החיוניות, כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסט, עבור כל תעלה שתיצבע. הגן על תמיסה זו מחשיפה לאור עד למועד הצביעה של הביופילם; שאב את כל הנוזל שנותר מהכניסה ומלא מחדש את אותו מאגר ב-100 µL מתערובת צביעת החיוניות.

לאחר מכן, דחפו את תמיסת הצביעה דרך המיקרו-ערוץ למשך 45 דקות. תחת זרימה נמוכה של כوى גזירה בטמפרטורת החדר, הקפידו להגן על השבב מפני חשיפה לאור. שאבו את כל הנוזל שנותר ממאגר הכניסה ומלאו אותו מחדש ב-100 µL של PBS.

שטפו את המיקרו-תעלה במשך 20 דקות תחת זרימה בעלת מאמץ גזירה נמוך בטמפרטורת החדר כדי להסיר צבעים לא קשורים עודפים. הביופילם הצבוע מוכן כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך בחינת הארכיטקטורה התלת-ממדית של הביופילמים. ניתן להשתמש בשחזורים דיגיטליים המבוססים על סריקות אופקיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצפות במבנה הכללי של הפילם מכל זווית אלכסונית.

יתרה מכך, ניתן להחיל ניתוח צביעת חי-מת על אותה מערך נתונים כדי לחקור את התלות המרחבית של חיוניות התאים בתוך הביופילם כפונקציה של טיפולים כימיים שונים. לאחר שבוצע דימות של הביופילם, ניתן להפיק תאים מערוצים שאינם צבועים. באמצעות שימוש במים מזוקקים בזרימה בעלת גזירה גבוהה, ניתן לאחר מכן לזהות את פלורת הביופילם מה-genomic DNA באמצעות ריצוף 4 5 4 pyro.

לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הוספת מינים או תרכובות שונות, כדי לענות על שאלות שונות, למשל מה קורה לביופילמים רב-מיניים תחת תנאים משתנים.