הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד
4 באוגוסט 2015
אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד בו-זמנית קשירה דמוית רצפטור ולצפות באיתות סידן המושרה על ידי הקשירה בתא בודד. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד ביוטין והתאמת האוסמולריות של תאי דם אדומים אנושיים, או RBCs, כדי להשתמש בהם כממיר כוח רגיש במיוחד. השלב השני הוא פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית במיקרו-קנה מידה, הכוללת ניקוי, הרחבה וציפוי בליגנד.
בשלב הבא, תאי T מבודלים ומודגרים עם צבע הסידן Fluo-2 למשך זמן קצוב, מה שמאפשר מעקב אחר ריכוז יוני הסידן התוך-תאיים. השלב האחרון הוא הכנת המיקרו-פיפטות בתא הניסוי, הדרושות במיוחד להגדרת מערך הניסוי. לבסוף, נעשה שימוש בטכניקת גשש כוח ביו-ממברנתי פלואורסצנטי (BFP) כדי להדגים את ההיצמדות של תא לחרוסיק מצופה בליגנד, למדוד את קינטיקת הקשירה של הרצפטור לליגנד, ובמקביל לנטר את רמת הסידן התוך-תאית.
טכניקה זו מועילה להבנת האופן שבו כוח מכני מזוהה על ידי תאי T באמצעות זיהוי אנדרוגן. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא ש-FBIP יכול למדוד בו-זמנית קינטיקה של קישור ליגנד לרצפטור ואותיות תוך-תאיות. החלקים המאתגרים בפרוטוקול זה כוללים ייצור ידני של נתיבי מיקרו-פפ (micro pep paths) בקטרים הנכונים, איסוף תאים ודבורים באמצעות מיקרו-פפים והרכבת גשש הכוח, שעלולה להיכשל בפעם הראשונה, למרות שהוא לא יכול היה להיות כאן לצורך הדגמת סרטון זה.
השותף לכתיבה Arnold G, שהשלים לאחרונה את תואר הדוקטורט במעבדתי, תרם משמעותית לתיקוף הראשוני של יישום פרוטוקול ה-FBAP. השג 8 עד 10 µL דם מדקירה באצבע והוסף אותם ל-1 mL של carbonate bicarbonate buffer; ערבב את התערובת באמצעות vortex או פיפטה, וסבב במערך צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-900 G. השלך את הסופרנאט לפני ביצוע השטיפה עם ה-carbonate bicarbonate buffer. שטוף פעם נוספת.
לאחר מכן, ערבבו 10 µL מתרכיז ה-RBC שהתקבל, 171 µL של בופר carbonate bicarbonate, ו-1049 µL של תמיסת biotin PEG NHS linker, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תוך שימוש באותם נהלי שטיפה קודמים, שטפו את תערובת ה-RBC שהתקבלה פעם אחת עם בופר carbonate bicarbonate, ולאחר מכן פעמיים עם בופר 5% N two.
בשלב הבא, דללו Nystatin לתוך N two 5%buffer. כדי להגיע לריכוז סופי של 40 microliters per milliliter, ערבבו five microliters של RBC ביוטיניליים עם 71.4 microliters של תמיסת Nystatin והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של zero degrees Celsius. לבסוף, שטפו את הדגימות פעמיים עם N two 5%buffer ואחסנו את ה-RBC הביוטיניליים עם N two 5%buffer בתוספת 0.5%BSA במקרר; הרכיבו פיפטה מיקרו אחת בגודל three inch על גבי מושך פיפטות המיקרו.
לחצו על כפתור המשיכה (pull button) כך שהמרכז של הנימי יחומם על ידי המכונה והנימי יימשך משני קצותיו כדי ליצור שני נימים בעלי קצוות חדים, המהווים את הפיפטים הגולמיים. לאחר מכן, הרכיבו פיפט גולמי על תומך הפיפטים של מכשיר עיצוב הפיפטים (micro pipette Forge), וחממו כדי להמיס את כדור הזכוכית בforge. הכניסו את קצה הפיפט הגולמי לתוך כדור הזכוכית.
קררו את הכדור הזכוכית ומשכו את הפ pipette הגולמית כדי לשבור אותה מהחוץ, כך שקצבה יישאר בתוך הכדור. חזרו על הליך זה עד להשגת פתח הקצה הרצוי. כדי לבנות את תא התא, חתכו תחילה זכוכית כיסוי בגודל 40 millimeter על 22 millimeter על 0.2 millimeter באמצעות חותך זכוכית לשתי חתיכות בגודל 40 millimeter על 11 millimeter על 0.2 millimeter. תא התא נבנה על בסיס של מחזיק תאים תו ပြה, המורכב משני ריבועי מתכת ומ ידית המחברת ביניהם.
הדביקו באמצעות דבק גريس לבישה אחת לצדו התחתון של מחזיק התא באופן שיגשר בין שני הריבועים המתכתיים. באופן דומה, הדביקו את הלבישה השנייה לצד העליון, כדי ליצור תא של לבישות מקבילות. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להזריק 200 µL של בופר ניסויי בין שתי הלבישות.
וודאו שהבופר נצמד לשתי לוחות הכיסוי. סובבו ונערה בעדינות את התא כדי לאפשר לבופר לגעת בשני קצותיו. לאחר מכן, הזריקו בזהירות שמן מינרלי לשני צדי התא, משני צידי אזור הבופר הניסויי, ובכך אטמו את הבופר מהאוויר הפתוח.
הזריק תרחיפים של חרוזי prob, חרוזי bcs ומטרות לאזורים העליון, האמצעי והתחתון של אזור הבאפר, בהתאמה. כדי להתחיל בניסוי ה-BFP, הדלק את המיקרוסקופ ואת מקור האור.
הנח את התא על משטח המיקרוסקופ הראשי. השלב הבא הוא להתקין את שלוש המיקרו-פיפטות של ה-BFP. הפרובה השמאלית משמשת לתפיסת RBC אחד.
המטרה מימין היא לתפוס את התא, והעוזר בפינה השמאלית התחתונה משמש לתפיסת חרוז להתקנה; השתמשו במזרק מיקרו (micro injector) כדי למלא לאחור פיפטת מיקרו עם בופר ניסיוני. הוציאו את פיפטת המיקרו מתושבת הפיפטה והחזיקו אותה במיקום נמוך יותר כדי לאפשר לנוזל לטפטף מהקצה. הכניסו במהירות את פיפטת המיקרו לקצה התושבת, תוך כדי וידוא שבועת אוויר לא חודרת אל פיפטת המיקרו.
במהלך ההכנסה, הדק את בורג המחזיק, ולאחר מכן רכב כל מחזיק פיפטה על המיקרו-מניפולטור המתאים לו. דחף את המיקרו-פיפטה לכיוון התא כך שהחודים שלה יכנסו לאזור הבאפר של התא. כוונן את מיקום המיקרו-פיפטה ואתר אותן תחת שדה הראייה של המיקרוסקופ.
הזיזו את במה של מחזיק התא כדי למצוא את המושבות של שלושת האלמנטים. כווננו, אחד אחד, את מיקום המיקרו-פיפט המתאים על ידי סיבוב כפתורי המניפולטורים כדי לאפשר לקצה המיקרו-פיפט להתקרב לתא או לחרוץ אחד, ושאבו את התא או החרוץ. באמצעות כוונון הלחץ בתוך המיקרו-פיפטים המתאימים, כל שלושת המיקרו-פיפטים ילכדו את האלמנטים התואמים להם.
הזיזו את במת מחזיק התא כדי למצוא שטח פתוח הרחוק מהמושבות של האלמנטים המוזרקים, שבו יבוצע הניסוי. העבירו את מצב התצוגה של המיקרוסקופ כך שהתמונה תוצג בתוכנת המחשב. העבירו את שלושת האלמנטים שעל קצות הפיפט לשדה הראייה של התוכנה.
בשלב הבא, יישרו את חרוז הגישוש (probe bead) ואת כדורית הדם האדומה (RBC), ותמנועו בזהירות את חרוז הגישוש אל שיא ה-RBC. כעת, הצמידו לזמן קצר את החרוז אל ה-RBC ונסיגו אותו בעדינות; כווןנו את הלחץ של המיקרופיפט העזר כדי לנשוף בעדינות את החרוז הרחק, כך שיישאר דבוק לשיא ה-RBC. הרחיקו את פיפט העזר ויישרו את המטרה ואת חרוז הגישוש באמצעות התוכנית.
בחלון שדה הראייה, השתמש בכלי התוכנה כדי למדוד את הרדיוסים המתאימים של מיקרו-פיפטת הגשש, של ה-RBC ושל שטח המגע המעגלי בין ה-RBC לחרוז הגשש. ערכים אלו מאפשרים להעריך את קבוע הקפיץ של ה-RBC באמצעות המשוואה המפורטת בפרוטוקול הטקסט. לאחר הזנת קבוע הקפיץ הרצוי של ה-RBC לתוכנה, שרטט קו אופקי לרוחב שיאו של ה-RBC, פעולה שתפיק עקומה בחלון הסמוך המציינת את בהירותו של כל פיקסל.
לאורך קו זה, גררו את קו הסף כך שיהיה בערך במחצית מעומק העקום. לאחר מכן, בחרו את מצב הניסוי הרצוי: thermal fluctuation assay, adhesion frequency assay, או force clamp assay. הגדירו את הפרמטרים לפי הרצון.
לחצו על start, מה שמאפשר לתוכנה להזיז את הפ pipette של המטרה ולהניע את המטרה פנימה והחוצה ממגע עם ה-probe; איסוף הנתונים יבוצע במקביל, תוך רישום מיקום ה-pro bead בזמן אמת. הפסיקו את התוכנית על ידי לחיצה על הכפתור stop experiment, שבשלב זה יקפוץ חלון. כדי לאפשר שמירה של הנתונים שנרכשו, השתמשו בפונקציית הפלואורסצנציה של מערכת ה-BFP, הפעילו את מקור אור העירור ואת מצלמת הפלואורסצנציה, הנשלטים על ידי תוכנה נפרדת.
לאחר מכן, בחרו את הפרמטרים לדימוי הפלואורסצנציה, כולל חשיפת הגבר (gain exposure) וערוצי עירור. בצעו את כל ההכנות המפורטות בפרוטוקול הניסוי של BFP, כולל יישור הגשש והמטרה כדי לאפשר ויזואליזציה של תמונת פלואורסצנציה חיה של תא המטרה, המעורר על ידי אור עירור של 340 nanometer או 380 nanometer. השתמשו בכלי החיתוך כדי לחתוך באופן גס את האזור שבו התא יישאר לאורך כל תקופת ההקלטה.
בשלב הבא, לחצו בו-זמנית על record ועל start clicking. פקודת record מאפשרת לאור באורך גל של 340 ננומטר ו-380 ננומטר לעורר לסירוגין את צבע הפלואורסצנציה התו-תאי. זוג תמונות פלואורסצנציה תואמות יוקלטו לסירוגין, בערך אחת בכל שנייה.
לחיצה על start מתחילה את ניסוי ה-BFP לניתוח אינטראקציה מולקולרית ואת ניסוי דימוי הפלואורסצנציה לניטור איתות סידן תוך-תאי; לאחר מכן יש לנתח את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בעקומות נתוני הגלם של כוח לאורך זמן, הכוח נגזר ממעקב אחר שינוי המיקום של חרוז ה-pro. באירוע ללא היצמדות, הכוח יחזור לאפס באות הכוח ההפוך לאחר שהתא המטרה נסוג מפני שטח החרוז.
לעומת זאת, באירוע של כוח קריעה, ההיצמדות תתבטא בעלייה מהירה של הכוח לרמה חיובית במהלך נסיגה (retraction), ולאחריה ירידה מהירה חזרה לאפס. באירוע של זמן חיים (lifetime), הכוח החיובי יישאר קבוע כדי ליצור רמה (plateau). אורכה של הרמה זו הוא זמן החיים.
על ידי ביצוע חוזר של מחזורי ניסויי VFP, תופק עקום של כוח לעומת זמן. מוצגות כאן תמונות פלואורסצנטיות של תא T בודד או שניים טעונים, בעת עירור על ידי ערוצי אור של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. שתי התמונות מראות קווי מתאר ברורים של התא, המצביעים על כך שהתא נצבע היטב. לאחר שנתוני קינטיקת ההיקשרות ונתוני הפלואורסצנציה הופקו מתא T, מוצגים both עקום זמן החיים המצטבר ועקום רמת הסידן באותה דמות כדי למצוא את המתאם ביניהם.
כעת אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניסוי A-F-B-I-P. במהלך הליך זה, חשוב לזכור לבדוק אם קיים פגם כלשהו בגשש הכוח (force probe), כגון קוטר המיקרו-פיפט, אורך בליטת תא הגומי ומיקום החרוץ.
כל אלה ישפיעו על דיוק מדידת הכוח. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המכנית המולקולרית לחקור את מנגנון ההעברה המכנית בכל המערכות הביולוגיות האפשריות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקת קישור בין קולטן לליגנד תוך כדי תצפית על איתות סידן בתא T בודד. השיטה עושה שימוש בתאי דם אדומים ביוטיניליים כמתמירים של כוח ובחרוזי זכוכית במיקרו-קנה מידה לצורך פונקציונליזציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- ביופיזיקה
רקע
- הבנת האינטראקציות בין רספטור לליגנד היא קריטית למחקר אימונולוגי.
- לאיתות סידן תפקיד מפתח בהפעלה של תאי T.
- טכניקות של מדידה סימולטנית משפרות את דיוק הנתונים.
- שיטות של העברת כוח יכולות לספק תובנות לגבי קינטיקת קישור.
מטרת המחקר
- למדידת קינטיקת קישור של רספטור-ליגנד בזמן אמת.
- לתצפית על איתות סידן המושרה על ידי אירועי קישור.
- לפיתוח שיטה שניתן להחילה על ניתוח של תא בודד.
שיטות שהשתמשו בהן
- בידוד של biotin והתאמת האוסמולריות של תאי דם אדומים אנושיים.
- פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית במיקרוסקאלה באמצעות ליגנדים.
- בידוד ואינקובציה של תאי T עם צבע סידן.
- הכנה של מיקרו-פיפטות בתא ניסוי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של קינטיקת קישור רצפטור-ליגנד.
- ניטור בזמן אמת של רמות סידן תוך-תאיות.
- הדגמה של טכניקת גשש כוח לממברנה ביולוגית מבוססת פלואורסצנציה.
- תובנות לגבי דינמיקת ההיצמדות של תאי T.
מסקנות
- הטכניקה מספקת כלי רב-עוצמה לחקר אינטראקציות בין תאים בודדים.
- היא משפרת את ההבנה של מנגנוני האקטיבציה של תאי T.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לסוגי תאים ומסלולי איתות אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידת קינטיקת קישור בין רספטור לליגנד ואיתות במורד הזרם (downstream signaling) תחת תנאי כוח פיזיולוגיים נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות עבור אימונותרפיה. גשש כוח של ממברנה ביולוגית פלואורסצנטית (fBFP) מאפשר כימות סימולטני של אינטראקציות מולקולריות וזרימת סידן תוך-תאית בתאים חיים בודדים, ובכך מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור ביולוגיים המכוונים לרספטור של תאי T. יכולת זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פרמטרים ביופיזיקליים של קישור לפלטי איתות פונקציונליים במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מתאם בין קינטיקה של קישור רספטור-ליגנד תחת כוח לבין הפעלת איתות סידן בתאי T.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מדידה סימולטנית של קישור ואיתות, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת מטרות באימונו-אונקולוגיה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי ליגנדים המשרים איתות מתמשך תחת תנאים מכניים רלוונטיים פיזיולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף (תאי RBC עם ביוטיניציה כחיישני כוח, חרוזיים מצופים בליגנדים) עבור יישומי סריקה בהמשך הדורשים קריאות של קישור המנוהג על ידי כוח.
- ערך תפעולי: אספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של קינטיקת קישור (כוח, זמן חיים, אירועי קריעה) ואיתות סידן ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה (~1 pN, ~3 nm, ~0.5 msec).
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת הערכה ניתנת להרחבה של תרכובות על ידי אספקת פלטפורמה המשלבת התמרת כוח עם קריאות של איתות פלואורסצנטי לצורך אישור פגיעות (hits).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שימוש בתאי T אנושיים ראשוניים ובטווחים של כוחות פיזיולוגיים כדי לדגמן אינטראקציות TCR-ליגנד הרלוונטיות למחלה בהקשרים אימונולוגיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: קישור בין קינטיקת קישור לתוצאות של איתות סידן, המספק מידע על קשרי מבנה-תפקוד לצורך אופטימיזציה של מולקולות מובילות במעכבי נקודות בקרה או במקשרי תאי T (T-cell engagers).
- מודל פרה-קליני: תמיכה בתיקוף מערכת רלוונטית למחלה על ידי הדגמה של האופן שבו ויסות מכני משפיע על זיהוי אנטיגנים והפעלה בתאי T.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-fBFP משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר קינטיקת קישור ומתאם אותות מכוונים להחלטות של המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מדידה של האופן שבו כוח מכני מווסת את קישור TCR-ליגנד ואת זרימת הסידן במורד המסלול בתאי T חיים.
- סינון: מספק פלטים כמותיים מוכנים לבדיקה (זמן חיים של קישור, כוח קריעה, זרימת סידן) המאפשרים השוואה בין וריאנטים של ליגנדים או מועמדים טיפוליים תחת תנאי כוח מבוקרים.
- אנליטיקה: מספק עקומות מתואמות של כוח לעומת זמן ומדידות של עוצמת פלואורסצנציה המאפשרות לצוויות לקשר פרמטרים ביופיזיים של קישור לתגובות איתות תפקודיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין קינטיקת קישור ברמת תא בודד לבין רציפות איתות הסידן, ובכך תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים למצבי הפעלה של תאי T בתיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לחקר כל אינטראקציית רספטור-ליגנד בממברנה תחת ויסות מכני, ישימה על מטרות בתחומי האימונולוגיה, האונקולוגיה ומדעי המוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בין אירועי קישור לתוצאות תפקודיות במטרות של תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מדידות קישור ואיתות מווסתים בכוח באמצעות מתמרי כוח RBC רגישים במיוחד ומכוילים ובדימות בזמן אמת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי זיהוי ליגנדים המייצרים איתות מתמשך תחת כוח פיזיולוגי, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפיתוח אימונותרפיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מותאם לסיכון, המבוסס על קינטיקת קישור וספי קיים של איתות שנצפו בתאים חיים בודדים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במניפולציה של תאים בודדים, ייצור מיקרו-פיפטות ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצורך הרכבה וכיול של גשש כוח (force probe).
- תלויה בציוד הכולל מצלמות במהירות גבוהה, מיקרו-מניפולטורים, מערכות משוב כוח (force feedback) ומערכי פלואורסצנציה בעלי עירור כפול לצורך דימוי סידן.
- מחייבת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת RBC, פונקציונליזציה של חרוצים וטעינת צבעי סידן כדי להבטיח הדירות בין משתמשים שונים.
- כוללת שיקולי התאמה לסוגי תאים שונים (מעבר לתאי T) ולזוגות ליגנדים, דבר הדורש אופטימיזציה של האוסמולריות, הביוטיניליציה ופרמטרי ה-force clamp.
- כוללת מגבלות מעשיות כגון תפוקה נמוכה עקב לכידה ידנית של תאים/חרוצים ותלות במיומנות המפעיל עבור איכות קצה המיקרו-פיפטה ואיטום התא.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:28
Human RBCs Isolation, Biotinylation and Osmolarity Adjustment
4:07
Preparation for Micropipettes and a Cell Chamber
6:24
BFP Experiment
10:25
Fluorescence BFP (FBFP) Experiment
11:51
Results: Representative T-cell Receptor and Peptide MHC Binding Kinetics Data & Calcium Fluorescence Data from the FBFP Experiment
13:14
Conclusion
