הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד בו זמנית דמוי קולטן וקשירה ולצפות באיתות הסידן המושרה על תא בודד. זה מושג על ידי בידוד ביוטין והתאמת האוסמולריות של תאי דם אדומים אנושיים או RBCs כדי להשתמש בהם כמתמר כוח רגיש במיוחד. השלב השני הוא פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית בקנה מידה מיקרו, הכולל ניקוי, הרחבה וציפוי ליגנד.

לאחר מכן, תאי ה-T מבודדים ומודגרים עם צבע הסידן פחות מ-2:00 לפנות בוקר, מה שמאפשר תצפית על ריכוז יוני הסידן התוך-תאי. השלב האחרון הוא הכנת המיקרו-פיפטות בתא הניסוי הנדרשות במיוחד להגדרת הניסוי. בסופו של דבר, בדיקת כוח הממברנה הביולוגית הפלואורסצנטית או טכניקת BFP משמשת כדי להראות את ההידבקות של תא לחרוז מצופה ליגנד, למדוד את קינטיקה של קשירת ליגנד הקולטן, ובינתיים לפקח על רמת הסידן התוך תאית.

טכניקה זו שימושית בהבנת האופן שבו כוח מכני מורגש על ידי תאי T באמצעות זיהוי אנדרוגנים. יתרון מרכזי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא ש-FBIP יכול למדוד קינטיקה של קשירת ליגנד קולטן ואיתות תוך תאי בו זמנית. החלקים המאתגרים של פרוטוקול זה כוללים ייצור ידני של נתיבי מיקרו פפ בקטרים הנכונים, איסוף תאים ודבורים עם מיקרו PEPs והרכבת בדיקת הכוח, שעלולה להיכשל בהתחלה, אם כי הוא לא יכול היה להיות כאן להדגמה של הסרטון הזה.

המחבר השותף ארנולד ג'י, שסיים לאחרונה את הדוקטורט שלו במעבדה שלי, תרם באופן משמעותי לאימות הייצור הראשוני של פרוטוקול FBAP. השג שמונה עד 10 מיקרוליטר דם מדקירת אצבע והוסף למיליליטר אחד של קרבונט ביקרבונט, סילון חיץ להשאיר מערבולת או פיפטה את התערובת והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב 900 גרם. שוטפים פעם נוספת.

לאחר מכן, מערבבים 10 מיקרוליטר מאריזת ה-RBC המתקבלת, 171 מיקרוליטר של מאגר ביקרבונט קרבונט ו-1049 מיקרוליטר ביוטין. תמיסת קישור PEG NHS ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שימוש באותם הליכי כביסה לפני שטיפת תערובת ה-RBC המתקבלת פעם אחת עם מאגר קרבונט ביקרבונט, ולאחר מכן פעמיים עם N שני מאגר של 5%.

לאחר מכן יש לדלל את הניסטטין ל-N שניים 5% מאגר. כדי ליצור ריכוז סופי של 40 מיקרוליטר למיליליטר, מערבבים חמישה מיקרוליטרים של ה-RBC הביוטיני עם 71.4 מיקרוליטר תמיסת ניסטטין ודוגרים למשך שעה באפס מעלות צלזיוס. לבסוף, שטפו את הדגימות פעמיים עם N שני מאגר של 5% ואחסנו את ה-RBC הביוטיני עם N שני מאגרים של 5% בתוספת 0.5% BSA במקרר הרכיבו חתיכה אחת של מיקרו פיפטה בגודל שלושה אינץ' על חולץ המיקרו פיפטה.

לחץ על כפתור המשיכה כך שאמצע הנימים יחומם על ידי המכונה והנימים יימשכו משני הקצוות ליצירת שני נימים עם קצות חדים, שהם הפיפטות הגולמיות. לאחר מכן הרכיבו פיפטה גולמית על מחזיק הפיפטה של המיקרו פיפטה Forge חום כדי להמיס את כדור הזכוכית על החישול. הכנס את קצה הפיפטה הגולמית לתוך כדור הזכוכית.

מצננים את כדור הזכוכית ומושכים את הפיפטה הגולמית כדי לשבור אותה מבחוץ, ולהשאיר את קצהו בתוך הכדור. חזור על הליך זה עד לקבלת פתח הקצה הרצוי לבניית תא התא שנחתך תחילה ל -40 מילימטר על 22 מילימטר על 0.2 מילימטר החלקת כיסוי באמצעות חותך זכוכית לשתי חתיכות בגודל 40 מילימטר על 11 מילימטר על 0.2 מילימטר. תא התא בנוי על תשתית של מחזיק תא תוצרת בית המורכב משתי חתיכות של ריבועי מתכת וידית המקשרת ביניהם.

בעזרת דבק חסד החליק כיסוי אחד לצד התחתון של מחזיק החדר באופן שהוא מגשר על שני ריבועי המתכת. באופן דומה, הדביקו את החלקת הכיסוי השנייה לצד העליון, שיהווה תא החלקה מקביל לכיסוי. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להזריק 200 מיקרוליטר של חיץ ניסיוני בין שתי החלקות הכיסוי.

ודא שהמאגר מתחבר לשני החלקות הכיסוי. סובב בעדינות ונער את החדר כדי לאפשר למאגר לגעת בשני קצוות החדר. לאחר מכן הזרקו בזהירות שמן מינרלי לשני צידי החדר, מאגפים את אזור החיץ הניסיוני, ובכך אטמו את המאגר מהאוויר הפתוח.

הזרקת תרחיפים של prob. חרוזים הם bcs ומטרות באזורים העליונים, האמצעיים והתחתונים של אזור החיץ בהתאמה. כדי להתחיל בניסוי BFP, הפעילו את המיקרוסקופ ואת מקור האור.

הנח את החדר על המיקרוסקופ הראשיtage. השלב הבא הוא התקנת כל שלושת הפיפטות המיקרו של ה- BFP. הגשושית משמאל היא לתפוס RBC.

המטרה מימין היא לתפוס את התא והעוזר מימין למטה משמש לתפוס חרוז להתקנה, להשתמש במזרק מיקרו כדי למלא מחדש מיקרו פיפטה עם מאגר ניסיוני. הסר את המיקרו פיפטה ממחזיק הפיפטה והחזק אותו במקום נמוך יותר כדי לאפשר לנוזל לטפטף מהקצה. הכנס במהירות את המיקרו פיפטה לקצה המחזיק, וודא שאף בועת אוויר לא נכנסת למיקרו פיפטה.

במהלך ההחדרה, הדק את בורג המחזיק, ולאחר מכן התקן כל מחזיק פיפטה על המיקרו מניפולטור המתאים לו. דחוף את המיקרו פיפטה לכיוון החדר כך שקצותיהם ייכנסו לאזור חיץ החדר. התאם את המיקום של המיקרו פיפטה ומצא אותם מתחת לשדה הראייה של המיקרוסקופ.

הסתובב בבמת מחזיק החדר כדי למצוא את המושבות של שלושת האלמנטים. בזה אחר זה, התאם את המיקום של המיקרו פיפטה המתאימה על ידי סיבוב כפתורי המניפולטורים כדי לאפשר לקצה המיקרו פיפטה להתקרב לתא אחד או לחרוז, לשאוב את התא או החרוז. על ידי התאמת הלחץ בתוך המיקרו פיפטה המתאימה, כל שלושת המיקרו פיפטות יתפסו את האלמנטים המתאימים להם.

הסתובב בבמת מחזיק החדר כדי למצוא שטח פתוח הרחק ממושבות האלמנטים המוזרקים שם יבוצע הניסוי. החלף את המצב החזותי של המיקרוסקופ כדי לדמיין את התמונה בתוכנית המחשב. העבר את כל שלושת האלמנטים בקצות הפיפטה לשדה הראייה של התוכנית.

לאחר מכן, יישר את חרוז הבדיקה ואת ה-RBC ותמרן בזהירות את חרוז הבדיקה לקודקוד ה-RBC. כעת פגעו בקצרה בחרוז על ה-RBC ונסוגו בעדינות, כוונו את הלחץ של המיקרו-פיפט העוזר כדי לפוצץ בעדינות את החרוז כך שהוא יישאר דבוק על קודקוד ה-RBC. הרחק את פיפטת העזר ויישר את חרוז המטרה והבדיקה בתוכנית.

בחלון שדה הראייה, השתמש בכלי התוכנית כדי למדוד את הרדיוסים המתאימים של המיקרו פיפטה של הגשושית, ה-RBC ואזור המגע המעגלי בין ה-RBC לחרוז הבדיקה. ערכים אלה מאפשרים להעריך את קבוע הקפיץ של ה-RBC על ידי המשוואה המפורטת בפרוטוקול הטקסט. לאחר הזנת קבוע קפיץ ה-RBC הרצוי לתוכנית, צייר קו אופקי על פני קודקוד ה-RBC, אשר יניב עקומה בחלון הסמוך המציינת את הבהירות של כל פיקסל.

לאורך קו זה, גרור את קו הסף כך שיהיה בערך מחצית מעומק העקומה. לאחר מכן, בחר את מצב הניסוי הרצוי, בדיקת תנודות תרמיות, בדיקת תדר הידבקות או בדיקת מהדק כוח. הגדר את הפרמטרים כרצונך.

לחץ על התחל, המאפשר לתוכנית להזיז את פיפטת היעד ולהניע את המטרה פנימה והחוצה ממגע עם איסוף נתוני הגשושית יבוצע ובמקביל, המתעד את מיקום חרוז הפרו בזמן אמת. עצור את התוכנית על ידי לחיצה על הכפתור עצור ניסוי שבו בכל פעם יופיע חלון. כדי לאפשר שמירת הנתונים שנרכשו לשימוש בפונקציית הקרינה של מערכת BFP הפעילה את מקור אור העירור ואת מצלמת הקרינה, הנשלטים על ידי תוכנית נפרדת.

לאחר מכן בחר את הפרמטרים להדמיית הקרינה, כולל ערוצי חשיפה ועירור. עקוב אחר כל ההכנות בפרוטוקול הניסוי BFP, כולל יישור הגשושית והמטרה כדי לאפשר הדמיה של התמונה הפלואורסצנטית החיה של תא המטרה הנרגשת על ידי אור עירור של 340 ננומטר או 380 ננומטר. השתמש בכלי החיתוך כדי לחתוך בערך את האזור שבתוכו התא יישאר במהלך כל תקופת ההקלטה.

לאחר מכן, לחץ בו זמנית על הקלטה והתחל ללחוץ. Record מאפשר לאור של 340 ננומטר ו-380 ננומטר לעורר לסירוגין את תבנית הקרינה התוך-תאית. זוג תמונות פלואורסצנטיות תואמות יתועדו לסירוגין בערך אחת בכל שנייה.

לחיצה על התחלה מתחילה ניסוי BFP לניתוח אינטראקציה מולקולרית וניסוי הדמיה פלואורסצנטית לניטור איתות סידן תוך תאי ממשיכים לנתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעקומות נתונים גולמיות של כוח הזמן, הכוח נגזר ממעקב אחר שינוי המיקום של חרוז הפרו. באירוע ללא הידבקות, הכוח יחזור לאפס באות הזמן ההפוך של הכוח לאחר שתא המטרה נסוג ממשטח החרוז.

לעומת זאת, באירוע כוח קרע, ההדבקה תתבטא בהעלאה מהירה של הכוח לרמה חיובית במהלך הנסיגה, ואחריה ירידה מהירה חזרה לאפס. באירוע של פעם בחיים, הכוח החיובי יהיה מהודק כדי לממש מישור. אורך הרמה הוא לכל החיים.

על ידי ביצוע חוזר ונשנה של מחזורי ניסוי VFP, תיגזר עקומת כוח מול זמן. מוצגות כאן תמונות פלואורסצנטיות של כמה או שניים של תאי T טעונים בעת עירור על ידי ערוצי אור של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. שתי התמונות מציגות קווי מתאר ברורים של התא, מה שמצביע על כך שהתא היה צבוע היטב לאחר שנתוני הקינטיקה המחייבת ונתוני הקרינה נגזרו מתא T, הן עקומת אורך החיים המצטברת והן עקומת רמת הסידן מוצגות באותו איור כדי למצוא את המתאם ביניהן.

עכשיו אתה צריך להבין היטב כיצד לבצע ניסוי A-F-B-I-P. במהלך הליך זה. חשוב לזכור לבדוק אם יש פגם כלשהו בבדיקת הכוח, כמו קוטר המיקרו פיפט, אורך הקרנת תאי הגומי ומיקום החרוז.

כל זה ישפיע על דיוק מדידת הכוח. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המכנית המולקולרית לחקור את מנגנון ההתמרה המכנית בכל המערכות הביולוגיות האפשריות.