טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את השינויים בתהליך הפגוציטי או לפעול בפילמור בעקבות הוספת אגוניסטים או אנטגוניסטים. זה מושג על ידי הוספת חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית לתאים הפגוציטים ומתן מספיק זמן להתרחשות פגוציטוזיס. כצעד שני לעצירת פגוציטוזיס, תאים מטופלים בכחול טריאם כדי לכבות פלואורסצנטיות של חלקיקים לא מופנמים שנשטפים ומאוחר יותר מקובעים בפרלדהיד.

הבא הוא צביעה וכימות. על מנת להקל על זיהוי פלואורסצנטי של תאים וחלקיקים, תאים המתקיימים עם DPI או אקטין, התוצאות מראות את השפעת הטיפול על פגוציטוזיס ופילמור אקטין כפי שכומת באמצעות יחס פלואורסצנטי אדום ירוק לכחול על סמך ניתוח פלואורומטרי. היתרון העיקרי של טכניקת הפלואורו מטרית על פני השיטות הקיימות הוא שמדובר בשיטה חסכונית בתפוקה גבוהה להערכת פגוציטוזיס.

זה מאפשר מניפולציה מינימלית של דגימה וכימות מהיר של עוצמת הפלואורסצנט לתא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה והביולוגיה של התא, כגון עד כמה יעיל וכמה מהיר פינוי פתוגן זה. פילמור פעולה משתנה במהלך פגוציטוזיס וכיצד פגוציטוזיס או פילמור אקסון מווסת על ידי אגוניסטים או אנטגוניסטים.

כדי להתחיל את לוחית ההליך, המקרופאגים מקו התאים של העכבר J 7 74 בצלחת של 96 בארות עם תחתית שקופה או שחורה דוגרים על תאי ההיצמדות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים כדי לאפשר לאדיון לצלחת. לאחר מכן הוסף את האגוניסטים או האנטגוניסטים הרצויים או בקרת הרכב לתאים בריכוז של שני x ב-50 מיקרוליטר של PBS או מדיה משלימה ודגירה למשך פרק זמן רצוי. בשלב זה, ודא שהחלקיקים והתוויות הפלואורסצנטיים מוגנים מפני אור בכל עת במהלך העיבוד, הכביסה והדגירה.

על מנת למנוע פוטוהלבנה להשתמש בחלקיקים בתרחיף כגון חרוזי דקסטר המסומנים בפלורסנט על תמיסת המלאי למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסיפו כמות שווה של ריאגנט אופסוניסטי לחלקיקים הפלואורסצנטיים ומערבלו במרץ למשך דקה נוספת. לאחר מכן, דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר צנטריפוגת הדגירה החלקיקים היו חמש דקות.

ב-500 פעמים G.הסר את הסופרנטנט S המכיל עודף ריאגנט אופסוניזציה. לאחר מכן יש לשטוף את החלקיקים עם 100 מיקרוליטר PBS. מערבל את הדגימה כדי להשעות מחדש את הגלולה ולצנטריפוגה למשך חמש דקות של פי 500 G.חזור על שלבים אלה פעמיים נוספות כדי להבטיח אופטימיזציה נכונה והסרה של נוגדנים לא קשורים.

כדי להכין את תמיסת העבודה של חלקיקים מיוננים, השעו מחדש את החלקיקים בחמישה מיליליטר מדיה. לאחר מכן אחסן אותו הרחק מהאור עד לשימוש נוסף. כעת הניחו את תמיסת העבודה של החלקיקים במאגר מגיב סטרילי.

הוסף 50 מיקרוליטר של חלקיקי אופסוניזציה לתאים שהוכנו קודם לכן לריכוז סופי של 15 ננוגרם למיליליטר, ואפשר לפגוציטוזיס להתרחש בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. לשיטת פגוציטוזיס רציפה, אפשר 30 דקות עד שעה עד שהחלקיקים הפלואורסצנטיים יגיעו לתחתית הבאר ויבואו במגע עם התאים. אם עורכים ניסוי מהלך זמן, הוסיפו חיידקים במרווחי זמן שונים ועצרו את כל לוח התגובות בו זמנית.

כדי לשפר את מהירות העיבוד לתאי הדבקה, הסר את הסנט והוסף 50 מיקרוליטר של טריאם כחול מדולל עם PBS על מנת לכבות פלואורסצנטיות של חיידקים לא מופנמים לאחר דגירה טריאן. שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS כדי להסיר שאריות טריאן. לאחר מכן, תקן את התאים עם 50 מיקרוליטר של 4% פרלדהיד ודגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שוטפים את הצלחת עם PBS. הסר את כל הנוזל והוסף 50 מיקרוליטר DPI לאחר חמש דקות של צביעה, שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר PBS לכל באר ורשום פגוציטוזיס לאחר קיבוע פרלדהיד.

שוטפים את הצלחת פעמיים עם 100 מיקרוליטר PBS לבאר לכל שטיפה. לאחר מכן הוסיפו לתאים 50 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100 ב-PBS לחדירה ודגרו אותם במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את ה-0.1% Triton X עם PBS פעמיים.

לאחר מכן חסום את התאים עם 1%BSA למשך 20 דקות כדי למנוע קשירה לא ספציפית של התווית. כעת הכינו את תמיסת העבודה של כתם רוד דומין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מתנול בחמישה מיליליטר PBS. לאחר החסימה, הסר מיד את תמיסת ה-BSA.

הוסף 50 מיקרוליטר של רומין פויד ותמיסת עבודה לכל באר ודגר את התאים בחושך למשך 20 דקות של טמפרטורת החדר. כדי לכמת פגוציטוזיס, הנח את הצלחת בקורא לוחות פלואורסצנטי הקלט פלואורסצנציה ירוקה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 488 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 518 ננומטר ופלואורסצנציה כחולה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 355 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 460 ננומטר. כדי לכמת פילמור אקטין באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים, הקלט פלואורסצנציה אדומה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 584 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 620 ננומטר ופלואורסצנציה כחולה.

מסנן אש ועירור באורך גל של 355 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 460 ננומטר. לאחר מכן, חלקו את ה-RFU הכולל של הקרינה הירוקה או האדומה בקריאת הקרינה הכחולה בהתאם לתווית החלקיקים או לכימות פגוציטים לעומת אקטין עקב צלחת גבוהה. כדי להציג שונות, השתמש במדדים יחסיים כדי להמחיש בצורה הטובה ביותר את המגמות שנצפו וכדי לאפשר ניתוח סטטיסטי אמין יותר.

תמונה זו ממחישה את השינויים בפילמור אקטין בעקבות הוספת מעכב. אלה הם היווצרות הפסאודופודיה והנה השינויים בסלסול הממברנה. בתמונה זו, התאים הורשו להפנים חרוזי X מצומדים של פיצי ביחס של 20 לאחד חרוז לתא למשך 60 דקות.

ואז התאים יישטפו עם טריאן ו-PBS קבועים עם פרלדהיד, חדירים עם אצטון וכתם ל-F actin באמצעות מוט דומין, F חלציים ו-dpi, פגוציטוזיס רציף של חלקיקים אופסוניזים ולא מחומצנים הוא די דומה. כאשר J 7 74 תאים מפנימים חרוזי dextra. מעניין לציין כי פילמור אקטין בעקבות פגוציטוזיס מגביר את ההאטה בנקודות זמן מאוחרות יותר בעוד שפילמור האקטין לאחר הפנמה של חלקיקים לא אופ אינו מגדיל אף אחת מהשיטות הפגוציטיות המשתמשות בחלקיקי דקסטרה מביאה לשינויים בכדאיות התא לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שעתיים עם מספר צלחות בכל פעם אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בניתוח מטרי פלואור כשיטה יעילה וחסכונית לתפוקה גבוהה לניתוח פגוציטוזיס ותהליכים תאיים אחרים.