Name: טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: למד שיטה פלואורומטרית לכימות פאגוציטוזה במקרופאגים ופולימריזציה של אקטין. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל ובעל תפוקה גבוהה לחקר תהליכים חיסוניים ותאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למקורות המימון הבאים: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (ל-S.R) ו-F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (ל-J.N).

הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש עבור יישומים רבים כגון כימות של פילמור phagocytosis ויקטין הכמשמש בעבודה שפורסמה בעבר שלנו 12. הפרוטוקול משאיל את עצמו למגוון רחב של שינוי, וסוגי תאי טבלה 1 וחלקיקים נוצלו בהצלחה בלימודים האחרונים. שימוש סטנדרטי של פרוטוקול זה לכימות של פילמור phagocytosis או אקטין מתואר בתרשים 1. <img alt="תרשים 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600"> תרשים 1:. תרשים של assay fluorometric לכימות של פילמור phagocytosis ויקטין לאחר התאים מצופה, טופלו, ואפשרו לדבוק, חלקיקים שכותרתו עם הקרינה ירוקה (FITC) מתווספים לתאים לphagocytosis. תגובה הוא נעצר על ידי trypan או antibiלשטוף otic (כדי למנוע חלקיקים-הפנים שאינם) והקיבעון מתבצע עם paraformaldehyde 4%. תאים הם מוכתמים לאחר מכן עם תווית אדומה ניאון אקטין (phalloidin rhodamine) ותווית כחולה ניאון (DAPI). אינדקסים של phagocytosis ופילמור יקטינו לכמת כמו יחס של יחידות הקרינה היחסית של ירוק / כחול (FITC / DAPI), או הקרינה אדומה / כחולה (rhodamine / DAPI). 1. ציפוי ותאי טיפול הערה: לפני תחילת, לשקול הפעלת הטיפולים עם לפחות 4 משכפל טכני, וכוללת את הפקדים הבאים בפריסת הצלחת: תאים בלבד (בלא כתם, עם DAPI לבד או rhodamine לבד) וחלקיקים בלבד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל התוספת של חומרים כימיים בצעדים 1-4 במנדף תרבית תאים סטריליים כדי להגן על הדגימות מזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים צלחת (קו תא J774 עכברי) בצלחת 96-היטב ב1-5 x 10 4 תאים ב -50 μl (לכל טוב) של תוספת תקשורת שחומם מראש. צלחות אידיאליים לשיטה זו הן 96-גם צלחות שחורות עם תחתית שקופה או שחורה, תלוי ביכולות קורא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקשורת בתוספת, להשתמש בחום של 10% מומת FBS כדי למנוע הפרעה של מפל משלים, ופניצילין 1% / סטרפטומיצין (אם לא באמצעות חיידקים חיים לphagocytosis). אם תאים חסיד באמצעות לאפשר 1-2 שעות להידבקות, ולתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת עם תאים במשך 10 דקות ב 500 x גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגוניסטים / יריבים רצויים או שליטה ברכב בריכוז 2x (resuspended ב PBS או יותר עדיף, בתקשורת בתוספת) ב -50 μl עבור נפח סופי של 100 μl (1x) ו דגירה של כמות רצויה של זמן. מאגרי פיפטה ומגיב רב-ערוצי יאפשר עיבוד המהיר ביותר. </li></ol> 2. Opsonization של חלקיקי פלורסנט ftp_upload / 52,195 / "width =" 500 52195table1.jpg "/&gt; סוגי תאים נבדקו וחלקיקי ניאון בניתוח fluorometric של phagocytosis ופילמור אקטין טבלה 1 מדגימה שילובים של סוגי תאים (שורות תאים, ותאים ראשוניים) שהקבוצה שלנו השתמשה באמצעות שיטת fluorometric: טבלה 1.. מלבד מסתכל על phagocytosis ופילמור אקטין על ידי תאים מסוג בר, יש לנו גם כמה מנוצלת של חלקיקים אלה לבדיקה של phagocytosis על ידי תאי transfected להביע GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). גם הקרינה של התאים transfected עם פלסמידים המכילים כתבי ניאון יכולה לשמש כסמן סלולארי בנוסף לDAPI אגדה בטבלה. - פילמור אקטין; P - phagocytosis; PT - phagocytosis ידי GFP שכותרתו תאי transfected; OPDex - opsonized חרוז dextran; HKOP - חום הרוגים opsonized. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחלקיקים ותוויות ניאון מוגנים מפני אור בכל העת, during עיבוד, כביסה, כמו גם במהלך הדגירה על מנת למנוע photobleaching <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלקיקים יבשים, לשקול את חיידקים נהרגו חום ניאון opsonized (HKOP) (E2861: זן E. coli K-12), תוך שימוש במפרטים של היצרן. תשמור על עצמך כדי לוודא שהחשבונות ההמוניים במשך 10: 1 - 20: 1 חיידקים: יחס תא (או לפחות 10: 1 - נפוצה בכימות של phagocytosis) 13,14. מספר החלקיקים יכול להיות מסופק על ידי היצרן או נקבע באמצעות couting דילולים סדרתי של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 50 μl PBS ו מערבולת דקה 1 בהגדרה הגבוהה ביותר. ודא vortexing הנכון (כאן ובכל רחבי הפרוטוקול) כחלקיקים נוטים לצבור אשר עשוי להשפיע יעילות של opsonization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלקיקים בתרחיף כגון חרוזים dextran ככותרתו fluorescently (חרוזים DEX), מערבולת פתרון מניות דקות 1, לקחת 50 μl של השעיה או בהתאם לריכוז חרוז בד הנפחetermine הר של חרוזים כדי להקל על 10: 1 חרוז: יחס תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של מגיב opsonizing לחלקיקים ונמרץ מערבולת עוד דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקיקים עם opsonizing מגיב על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, צנטריפוגות החלקיקים במשך 5 דקות ב 500 XG, ולהסיר את supernant מכיל מגיב opsonizing עודף. לשטוף את החלקיקים על ידי הוספה של PBS 100 μl, מערבולת resuspend גלולה, וcentrifugate במשך 5 דקות ב 500 x גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה שתי פעמים כדי להבטיח opsonization וההסרה של נוגדן מאוגד נכונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון העבודה של חלקיקי opsonized ידי resuspending ב 5 מיליליטר של תקשורת (מספיק לצלחת אחת 96-היטב) ולאחסן הרחק מאור עד בנוסף לתאים. </li></ol> 3. phagocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון העבודה של חלקיקים במאגר מגיב סטרילי. מכאן, להוסיף 5056; l של חלקיקי opsonized לתאים מוכנים בשלב 1 (לריכוז סופי של 50 ng / ml) ולאפשר phagocytosis להתרחש בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. מודגמים להלן שתי שיטות של phagocytosis שניתן להעריך בשיטה זו (תרשים 2). </li></ol><img alt="תרשים 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600"> תרשים 2:. השוואה של phagocytosis הרציף לעומת לסנכרן phagocytosis הרציף מציינת הפנמה מתמשכת של חלקיקים לאורך זמן כפי שהם מגיעים לאט את התאים על תחתית הבאר. צעד מנוגד סנכרון (צנטריפוגה) מאלץ את החלקיקים לשקוע לתחתית, שיפור הקשר עם חלקיקי התא, ושהוביל להפנמה מיידית על ידי התאים. phagocytosis המסונכרן הוא תהליך מהיר שמהירות רבה יותר מפנימים חלקicles בשל תא המוגבר: קשר חלקיקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטה רציפה phagocytosis (תרשים 2) המאפשר לתאי phagocytose רציפות חיידקי opsonized כפי שהם שוקעים לאט לתחתית ובאים במגע עם תאים, לנצל מסגרות זמן ארוכות יותר כדי לאפשר לחיידקים להגיע לתחתית הבאר ולקבל ב לגעת בתאים. אם ביצוע ניסוי timecourse, להוסיף חיידקים במרווחי זמן שונים ולעצור את כל הצלחת של תגובות באותו הזמן על מנת לשפר את מהירות העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטה המסונכרן phagocytosis (תרשים 2) שמשפרת את החלקיקים: תא קשר באמצעות צנטריפוגה, ספין למטה כל הצלחת המכילה תאים וחלקיקים (5 דק 'ב 500 XG) ברגע שהחלקיקים מתווספים, כדי להקל על סנכרון של כל נקודות הזמן ו כדי לזרז את החלקיקים: האינטראקציה תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את מהלך הזמן החל מייד לאחר השלמת centriצעד fugation. אם ביצוע ניסוי כמובן זמן, לעצור כל נקודת זמן באופן עצמאי במרווחי זמן שונים כמפורט להלן. </li></ol></li></ol></li></ol> הערה: שיטת phagocytosis המסונכרן היא קצת יותר מייגע מקודמתה, אבל מספקת מדד phagocytic גבוה יותר בזמן קצר יותר. 4. phagocytosis הפסקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים חסיד, להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μl של כחול trypan מדולל עם PBS (דילול 1: 2), על מנת לכבות הקרינה של חיידקים-הפנים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת ולהסיר supernatant. הוסף 50 μl של trypan הכחול בדילול מלא. ודא צנטריפוגות הצלחת ב( 5-10 דקות ב 500 XG) בין כל שטיפה על מנת למזער את אובדן התא ומאפשר שטיפה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה trypan, לשטוף תאים פעמיים עם PBS כדי להסיר כל trypan שייר (עד PBS הוסר מהבאר הופכת ברורה). Trypan הוכח כדי להרוות את הקרינה 15,16 של, חלקיקי חיידקי חום נהרג הלא הפנימו שכותרתו fluorescently, אך לא לחיידקים חיים או חרוזים OPDex. לחיידקים חיים, כולל שטיפה עם אנטיביוטיקה כמו פניצילין, סטרפטומיצין, גנטמיצין או במקום לשטוף trypan כדי למנוע תופעות של בלבול של הקרינה מחלקיקים-הפנים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם של paraformaldehyde 4% 100 μl, ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS (בכל טוב 100 μl לכל שטיפה). בשלב זה, לשמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, או להמשיך ישירות מכתים וכימות. הערה: כל השלבים הבאים מהווים הקדמת שלב זה יכול להיעשות מחוץ למכסת מנוע תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הנוזל ולהוסיף 50 μl של DAPI ב -5 / מיליליטר ng מחדש בPBS. לאפשר 5 דקות לצביעה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. בעקבות הצעד לשטוף, להוסיף 50 μl של PBS על כל phagocytosis היטב והשיא. </li> 5. אקטין מכתים הערה: בנוסף לphagocytosis, שיטת fluorometric תאפשר כימות של פילמור אקטין על ידי מדידת עוצמת אקטין, אשר מצטמצם בעיכוב של lamellipodia, pseudopodiae, וקרום פורע כתוצאה מטיפול במעכבים (איור 1 א). זהו צעד אופציונאלי, אם עניין בכימות של פילמור אקטין בנוסף לphagocytosis. אם פילמור אקטין הוא המטרה הסופית, תוך שימוש בחלקיקי ניאון לphagocytosis הוא אופציונאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון paraformaldehyde (שלב 4.3), לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS לכל גם 100 μl לכל שטיפה. הוסף 50 μl של 0.1% Triton X-100 ב PBS עבור permeabilization ו דגירה -5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פי 2 Triton X-100 0.1% עם PBS (כאמור לעיל), ולחסום עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) במשך 20 דקות כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של label. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות חסימה, להסיר את פתרון BSA ולהוסיף phalloidin rhodamine מייד. כדי להכין את פתרון העבודה של כתם rhodamine, שימוש בפתרון methanoic (המסופק על ידי היצרן) 100 μl ב 5 מיליליטר של PBS (מספיק לצלחת אחת). מהפתרון עובד להוסיף 50 μl לכל גם דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: בעקבות צעדי הכביסה ומכתים DAPI כמו בשלב 4.4 תאים יהיו מוכנים לכימות. </li></ol> 6. כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את phagocytosis באמצעות קורא צלחת ניאון ירוק הקרינה שיא, באמצעות מסנן עירור ב λ = 488 ננומטר ומסנן פליטה בקרינת λ = 518 ננומטר, וכחולה באמצעות מסנן עירור ב λ = 355 nm ומסנן פליטה בλ = 460 nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את פילמור אקטין באמצעות קורא צלחת ניאון, הקרינה כחולה שיא באמצעות λ = 355 וλ = 460 nm שפעת (כאמור לעיל), ואדום ננומטרorescence באמצעות מסנן עירור ב λ = 584 nm וλ = 620 nm מסנן פליטה. הערה: Orbital או איתור מרכזי מקובלת להקלטה. סוגים מסוימים של תאים לאסוף יותר לקצה גם מהמרכז, שבו הקלטת מסלול מקרה יכולה להיות יתרון. בפרט, ממוצע של שלוש נקודות מסביב למסלול יכול לשמש גם כדי להשיג תוצאות מדויקות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את RFU הכולל של הקרינה ירוקה או אדומה על ידי קריאת הקרינה כחולה (מDAPI), בהתאם לתווית החלקיק או phagocytic לעומת כימות אקטין (תרשים 1). בשל שונות צלחת לצלחת גבוהות, להשתמש במדדים יחסי (כגון ביחס לt = 0 שליטה), כדי להמחיש הטוב ביותר מגמות שנצפו וכדי להקל על ניתוח סטטיסטי אמין יותר. </li></ol></ol>

<ol><li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).</li>
<li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Bone+And+Joint+Surgery.+British+Volume%22%5BJournal%5D)">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633(2013).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621(2012).</li>
<li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development%2C+stress+response%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li>
<li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li>
<li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li>
<li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory%2C+GM-CSF-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898(2013).</li>
<li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li>
<li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRP%2Fanti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70(2011).</li>
<li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-%2C+Rac-1-%2C+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+Of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li>
<li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193(2007).</li>
<li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li>
<li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22132%22%5BJournal%5D)">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li>
<li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מגבלות עיקריות של טכניקת fluorometric הן שונות ניסיוני כמו גם אובדן תא הקשורים לכביסה ושימוש בתאים שאינם חסיד נרחבים. שונות הוא ציינה בעיקר בשל השינוי בחלקיקי ניאון כמו המשקל וpipetting במהלך תקופת ההכנה של מניות הפתרון הוא לא דרך של שמירה על מספרים זהים של חלקיקים מניסוי לניסוי מדויק. כדי לטפל בבעיה של שונות בין ניסויים, יכולים לבוא לידי ביטוי נתונים במונחים יחסי, למשל כphagocytosis% או לקפל שינוי מהשליטה (שליטה...

כימות של אות ניאון כבר בשימוש נרחב במגוון רחב של שיטות מדעיות החל PCR, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה confocal, וסריג ניתוח זמנית ELISA. יש הדמיה הקרינה וכימות יישום רחב והוא יכול להיות כלי נהדר לניתוח כמותי של תהליכים תאיים שונים. שימוש בסמני ניאון והאות שלהם כבר מהפכה בעשור האחרון, והופעתה של קוראי צלחת ניאון יש להקל כימות תפוקה הגבוה של הקרינה הנפלטת במהלך תהליכים תאיים. ניתוח Fluorometric יכול לשמש כלי נהדר בכימות של phagocytosis. Phagocytosis נחקר מאז גילוי phagocytes ידי Metchnikoff בשנת 1800 1. במהלך השנים, במגוון שיטות כבר נוצל כדי לבחון תהליך חשוב זה חיוני להגנה חיסונית מולדת נגד פלישת חיידקים, נגיפיות, פטריות וטפילות פתוגנים 2-5. שיטות קודמות של מיקרוסקופיה כימות מנוצל וטכניקות stereological כדי להמחיש תאים הphagocytosing, שהיו לכמת אז על ידי ספירה של חלקיקים הפנימו (ידני או עם שימוש בתוכנה) 6-8. חסרונות מסוימים לבאמצעות מיקרוסקופ לבד לניתוח כמותי הם שספירה ידנית של חיידקים היא עבודה אינטנסיבית ונוטה יותר להטית משקיף. שיטה נוספת המשמשת בכימות של phagocytosis היא טכניקת המיקרוביולוגית של ציפוי של חיידקים מהתא lysates (להלן phagocytosis) על צלחות תרבית חיידקים, אך שיטה זו יכולה להיכשל לתת דין וחשבון למנגנונים ונוכחות של חיידקים הפנימו באופן חלקי bactericidal. שיטה זו היא עוד יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה למיקרוסקופיה ולוקחת כמה ימים כדי לנתח. נראה cytometry זרימה להיות דרך המהירה והיעילה ביותר לכימות phagocytosis ונוצל על ידי קבוצות רבות 9-11, אבל העלות הגבוהה נפוצה הקשורים במחוונים דרושים לניתוח עושה את זה בשיטה יקרה ביותר בהשוואה למבחנים שהוזכרו קודם לכן. שיטת fluorometric היא אלטרנטיבה טובה לcytometry זרימה לניתוח של הפנמת חלקיקים שכן הוא מציע כימות משוחד של ציוד הקרינה באמצעות שאינו כעלותו. יתרונות נוספים אחרים של fluorometry הם יעילות גבוהה, ויכולות תפוקה גבוהות לכימות הקרינה הנפלטת על ידי שכותרתו החלקיקים הפנימו. יתרונות של fluorometry ניתן להסיק לכימות של תהליכים אחרים מאשר phagocytosis. לדוגמא, ניתוח fluorometric ניתן ליישם ללמוד כל תהליך מוביל לשינויים בביטוי של תאית או קולטני קרום הנכנס, שינויים בתא חדירות / כדאיות, יעילות transfection, ואפנון בפילמור אקטין. חיסרון אחד של טכניקת fluorometric הוא ש, בהתאם לתוויות שימוש, ייתכנו גבוהניסוי לניסוי שונות אשר בדרך כלל ניתן לפתור על ידי הוכחת נתונים באמצעות כימות יחסי, כגון שינוי קיפול או עליית אחוזים מהשליטה.

<table><tbody><tr><td>1 &mu; m כדורי פלואו פלואורסצנטיים צהובים-ירוקים;</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>F8852</td><td>משלבות 50&mu; l עם 50&mu; l מגיב אופסוניזציה למשך 30 דקות ב-37oC לפני השימוש</td></tr><tr><td>חום הורג E. coli חלקיקים ביולוגיים פלואורסצאין מצומדים</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>E2861</td><td>מורכבות מחדש (5 מ"ג) ב-50 &mu; l של PBS ולשלב עם 50 &mu; l מגיב אופסוניזציה למשך 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מגיב אופסוניזציה</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>רודמין פלואידין</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">הפריטים שלהלן זמינים במותגים רבים אך הפריטים בהם השתמשנו במחקר זה הם מהיצרנים הבאים:</td></tr><tr><td>מצע גדילה של תאי RPMI</td><td>Gibco</td><td></td><td>בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין; חם ב-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>קורא פלטות פלואורסצנטיות - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>לדלל ל-4% לפני השימוש</td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>גריינר</td><td>655097</td><td>תחתית שקופה או שחורה או שקופה - לוחות שחורים</td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית (8 - 12 ערוצים)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x צינורות מיקרופוגה PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0.6 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>קוניקלס (10 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקת התפוקה fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

המטרה של ניתוח fluorometric היא לשמש ככלי עזר יעילים, חסכוני, תפוקה גבוהה של ניתוח phagocytosis ותהליכים תאיים אחרים. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים, שני חסיד ולא חסיד, לבחון מגוון רחב של תכונות הסלולר. כאשר לומדים phagocytosis, טכניקת fluorometric מנצלת סוגי תאי phagocytic כגון מקרופאגים, וחלקיקי opsonized שכותרתו fluorescently הקרינה שיכולים להיות כבוי בנוכחות trypan הכחולה. בעקבות ציפוי של מקרופאגים חסיד ב96-גם צלחות, חלקיקי ניאון (ירוק או אדום) מנוהלים ותאים מותר phagocytose לכמויות שונות של זמן. בעקבות הפנמה של חלקיקי ניאון, תאים נשטפים עם trypan כחול, המאפשר הכחדה של אות ניאון מחיידקים אשר לא הפנימו, או שהם רק הקפדה על פני התא. בעקבות לשטוף trypan, תאים נשטפים עם PBS, קבועה,nd מגואלות DAPI (תווית ניאון כחולה גרעינית), המשמש לסימון גרעינים של תאים. על ידי כימות fluorometric פשוט באמצעות קריאת צלחת גרעינית (כחולה) או חלקיקי הקרינה (אדום / ירוקה) אנחנו יכולים לבחון את היחס של יחידות יחסית הקרינה של ירוק: כחולות ולקבוע מדד phagocytic מעיד על כמות חיידקי ניאון הפנימו לכל תא. משך assay באמצעות טפטפות שיטה ורבות ערוצים 96-גם לשטיפה, מסוף phagocytosis לסיים רכישת נתונים, הוא פחות מ 45 דקות. Cytometry זרימה יכולה לשמש באופן דומה, אך היתרון של fluorometry הוא התפוקה הגבוהה שלה, שיטה מהירה של הערכה עם מניפולציה מינימאלית של דגימות וכימות מהיר של עוצמת ניאון לכל תא. ניתן ליישם אסטרטגיות דומות לתאים שאינם חסיד, שכותרתו חיידקים חי, פילמור אקטין, ובעצם כל תהליך ניצול הקרינה. לכן, fluorometry היא שיטה מבטיחה עבור העלות נמוכה, הגבוה throughpיכולות ut במחקר של תהליכים תאיים.

שתי דרכים עיקריות לכימות phagocytosis ופילמור אקטין לאחר מכן באמצעות פרוטוקול זה היא להתבונן phagocytosis רציף או מסונכרן. ניתוח מיקרוסקופי (איור 1) מדגים תמונות ניאון דומות למה שfluorometer הוא ההקלטה (ראה גם תרשים 1). באיור 1 הן הקרינה אדומה של אקטין, 268 הקרינה ירוקה של FITC תוויות HKOP E. coli, כתם DAPI גרעיני, ואת התמונה הממוזגת של כל שלושה 269 fluorophores יחד. תמו...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות פגוציטוזיס של חלקיקים פלואורסצנטיים על ידי קו תאי מקרופאגים דבק בשיטה פלואורומטרית. שיטה זו מאפשרת כימות תפוקה גבוהה של הפנמת חלקיקים כמו גם פילמור האקטין המתקבל.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את השינויים בתהליך הפגוציטי או לפעול בפילמור בעקבות הוספת אגוניסטים או אנטגוניסטים. זה מושג על ידי הוספת חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית לתאים הפגוציטים ומתן מספיק זמן להתרחשות פגוציטוזיס. כצעד שני לעצירת פגוציטוזיס, תאים מטופלים בכחול טריאם כדי לכבות פלואורסצנטיות של חלקיקים לא מופנמים שנשטפים ומאוחר יותר מקובעים בפרלדהיד.הבא הוא צביעה וכימות. על מנת להקל על זיהוי פלואורסצנטי של תאים וחלקיקים, תאים המתקיימים עם DPI או אקטין, התוצאות מראות את השפעת הטיפול על פגוציטוזיס ופילמור אקטין כפי שכומת באמצעות יחס פלואורסצנטי אדום ירוק לכחול על סמך ניתוח פלואורומטרי. היתרון העיקרי של טכניקת הפלואורו מטרית על פני השיטות הקיימות הוא שמדובר בשיטה חסכונית בתפוקה גבוהה להערכת פגוציטוזיס.זה מאפשר מניפולציה מינימלית של דגימה וכימות מהיר של עוצמת הפלואורסצנט לתא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה והביולוגיה של התא, כגון עד כמה יעיל וכמה מהיר פינוי פתוגן זה. פילמור פעולה משתנה במהלך פגוציטוזיס וכיצד פגוציטוזיס או פילמור אקסון מווסת על ידי אגוניסטים או אנטגוניסטים.כדי להתחיל את לוחית ההליך, המקרופאגים מקו התאים של העכבר J 7 74 בצלחת של 96 בארות עם תחתית שקופה או שחורה דוגרים על תאי ההיצמדות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים כדי לאפשר לאדיון לצלחת. לאחר מכן הוסף את האגוניסטים או האנטגוניסטים הרצויים או בקרת הרכב לתאים בריכוז של שני x ב-50 מיקרוליטר של PBS או מדיה משלימה ודגירה למשך פרק זמן רצוי. בשלב זה, ודא שהחלקיקים והתוויות הפלואורסצנטיים מוגנים מפני אור בכל עת במהלך העיבוד, הכביסה והדגירה.על מנת למנוע פוטוהלבנה להשתמש בחלקיקים בתרחיף כגון חרוזי דקסטר המסומנים בפלורסנט על תמיסת המלאי למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסיפו כמות שווה של ריאגנט אופסוניסטי לחלקיקים הפלואורסצנטיים ומערבלו במרץ למשך דקה נוספת. לאחר מכן, דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר צנטריפוגת הדגירה החלקיקים היו חמש דקות.ב-500 פעמים G.הסר את הסופרנטנט S המכיל עודף ריאגנט אופסוניזציה. לאחר מכן יש לשטוף את החלקיקים עם 100 מיקרוליטר PBS. מערבל את הדגימה כדי להשעות מחדש את הגלולה ולצנטריפוגה למשך חמש דקות של פי 500 G.חזור על שלבים אלה פעמיים נוספות כדי להבטיח אופטימיזציה נכונה והסרה של נוגדנים לא קשורים.כדי להכין את תמיסת העבודה של חלקיקים מיוננים, השעו מחדש את החלקיקים בחמישה מיליליטר מדיה. לאחר מכן אחסן אותו הרחק מהאור עד לשימוש נוסף. כעת הניחו את תמיסת העבודה של החלקיקים במאגר מגיב סטרילי.הוסף 50 מיקרוליטר של חלקיקי אופסוניזציה לתאים שהוכנו קודם לכן לריכוז סופי של 15 ננוגרם למיליליטר, ואפשר לפגוציטוזיס להתרחש בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. לשיטת פגוציטוזיס רציפה, אפשר 30 דקות עד שעה עד שהחלקיקים הפלואורסצנטיים יגיעו לתחתית הבאר ויבואו במגע עם התאים. אם עורכים ניסוי מהלך זמן, הוסיפו חיידקים במרווחי זמן שונים ועצרו את כל לוח התגובות בו זמנית.כדי לשפר את מהירות העיבוד לתאי הדבקה, הסר את הסנט והוסף 50 מיקרוליטר של טריאם כחול מדולל עם PBS על מנת לכבות פלואורסצנטיות של חיידקים לא מופנמים לאחר דגירה טריאן. שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS כדי להסיר שאריות טריאן. לאחר מכן, תקן את התאים עם 50 מיקרוליטר של 4% פרלדהיד ודגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן שוטפים את הצלחת עם PBS. הסר את כל הנוזל והוסף 50 מיקרוליטר DPI לאחר חמש דקות של צביעה, שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר PBS לכל באר ורשום פגוציטוזיס לאחר קיבוע פרלדהיד.שוטפים את הצלחת פעמיים עם 100 מיקרוליטר PBS לבאר לכל שטיפה. לאחר מכן הוסיפו לתאים 50 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100 ב-PBS לחדירה ודגרו אותם במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את ה-0.1% Triton X עם PBS פעמיים.לאחר מכן חסום את התאים עם 1%BSA למשך 20 דקות כדי למנוע קשירה לא ספציפית של התווית. כעת הכינו את תמיסת העבודה של כתם רוד דומין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מתנול בחמישה מיליליטר PBS. לאחר החסימה, הסר מיד את תמיסת ה-BSA.הוסף 50 מיקרוליטר של רומין פויד ותמיסת עבודה לכל באר ודגר את התאים בחושך למשך 20 דקות של טמפרטורת החדר. כדי לכמת פגוציטוזיס, הנח את הצלחת בקורא לוחות פלואורסצנטי הקלט פלואורסצנציה ירוקה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 488 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 518 ננומטר ופלואורסצנציה כחולה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 355 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 460 ננומטר. כדי לכמת פילמור אקטין באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים, הקלט פלואורסצנציה אדומה באמצעות מסנן עירור באורך גל של 584 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 620 ננומטר ופלואורסצנציה כחולה.מסנן אש ועירור באורך גל של 355 ננומטר ומסנן פליטה באורך גל של 460 ננומטר. לאחר מכן, חלקו את ה-RFU הכולל של הקרינה הירוקה או האדומה בקריאת הקרינה הכחולה בהתאם לתווית החלקיקים או לכימות פגוציטים לעומת אקטין עקב צלחת גבוהה. כדי להציג שונות, השתמש במדדים יחסיים כדי להמחיש בצורה הטובה ביותר את המגמות שנצפו וכדי לאפשר ניתוח סטטיסטי אמין יותר.תמונה זו ממחישה את השינויים בפילמור אקטין בעקבות הוספת מעכב. אלה הם היווצרות הפסאודופודיה והנה השינויים בסלסול הממברנה. בתמונה זו, התאים הורשו להפנים חרוזי X מצומדים של פיצי ביחס של 20 לאחד חרוז לתא למשך 60 דקות.ואז התאים יישטפו עם טריאן ו-PBS קבועים עם פרלדהיד, חדירים עם אצטון וכתם ל-F actin באמצעות מוט דומין, F חלציים ו-dpi, פגוציטוזיס רציף של חלקיקים אופסוניזים ולא מחומצנים הוא די דומה. כאשר J 7 74 תאים מפנימים חרוזי dextra. מעניין לציין כי פילמור אקטין בעקבות פגוציטוזיס מגביר את ההאטה בנקודות זמן מאוחרות יותר בעוד שפילמור האקטין לאחר הפנמה של חלקיקים לא אופ אינו מגדיל אף אחת מהשיטות הפגוציטיות המשתמשות בחלקיקי דקסטרה מביאה לשינויים בכדאיות התא לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שעתיים עם מספר צלחות בכל פעם אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בניתוח מטרי פלואור כשיטה יעילה וחסכונית לתפוקה גבוהה לניתוח פגוציטוזיס ותהליכים תאיים אחרים.

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה, אנו חוקרים אינטראקציה בין גידולים למקרופאגים באמצעות בדיקת אינטראקציה מבוססת פלואורסצנטיות של מקרופאגים טרנסוולים. הבדיקה כוללת ניתוח של נדידת מקרופאגים באמצעות כימוטקסיס המושרה על ידי כימיקלים.

בדיקת משיכה למקרופאגים מבוססי פלואורסצנטיות: שיטה במבחנה לחקר אינטראקציה בין גידולים למקרופאגים באמצעות כימוטקסיס המושרה על ידי כימיקלים

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק phagocytosis שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia coli.

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.

הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

למד שיטה פלואורומטרית לכימות פאגוציטוזה במקרופאגים ופולימריזציה של אקטין. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל ובעל תפוקה גבוהה לחקר תהליכים חיסוניים ותאיים.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

גלה סרטונים נוספים