בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

המטרה הכוללת של שימוש בשילוב של טכניקות מיקרומניפולציה ומיקרוסקופ אור כגון FRAP ופוטו-אקטיבציה היא לנטר את הדינמיקה המרחבית של חלבונים המעורבים בוויסות והגירה של השלד התא בתנאים מובחנים או באופן תלוי במסלול איתות. שיטות המיקרומניפולציה שנדונו כאן שימושיות להעברה ישירה של כל סוג של מולקולה לתאים, כמו גם למניפולציה קלה של פעילות החלבון במיקומים תת-תאיים מוגדרים. אז היתרון העיקרי של הטכניקות המוצגות כאן הוא שהן מאפשרות לקבוע את ההשפעות המיידיות שחלבונים מפעילים על התאים יחד עם מעקב אחר ניידותם ברחבי התא.

כדי להתחיל בהליך זה, מעבר שגידל בעבר תאי B16-F1 ביחס של אחד לחמישה לתוך צלחת פלסטיק של שלושה סנטימטרים. שאפו את מדיום תרבית התאים. שטפו את התאים עם PBS, שאפו את ה-PBS והוסיפו טריפסין EDTA כדי לנתק את התאים.

הוסף מדיום תרבית תאים לתאים הטריפסיניים. השעו מחדש והעבירו את התאים לצינורות בז, לאחר צנטריפוגה זו ב-1000 סל"ד למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר הכנסת תאי B16-F1 לצלחת של שלושה סנטימטרים ומתן אפשרות להם להתפשט במשך שש שעות לפחות, העבירו את תאי B16-F1 על ידי הוספת תערובת של 500 ננוגרם של מבנה DNA ומיקרוליטר אחד של מגיב טרנספקציה בתמיסה המכילה 150 מילי-מולרי נתרן כלורי.

עבור תאי B16-F1 מצפים 15 מילימטר כיסוי ב-150 מיקרוליטר תמיסת למינין ודוגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר. עבור תאי NIH 3T3 מצפים את הכיסוי בתמיסת פיברונקטין ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקות הכיסוי המודגרות של הלמינין והפיברונקטין עם PBS ואז לשאוב את ה-PBS.

זרע שני מיליליטר של פיברובלסטים NIH 3T3 ביחס של אחד עד 20 מצלחת קונפלואנט על החלקות הכיסוי המצופות פיברונקטין. זרקו שני מיליליטר של תאי B16-F1 שעברו טרנספטציה ביחס של 1 ל -30 מצלחת קונפלואנט על החלקות הכיסוי המצופות למינין. לאחר מכן, אפשר לתאים להתפשט על החלקות כיסוי למינין ופיברונקטין למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמה ב-37 מעלות צלזיוס לפני המיקרוסקופיה.

הנח את זכוכית הכיסוי כשהתאים עם הצד כלפי מעלה על תא הדמיה מאלומיניום RC-26 מוליך חום. לאחר מכן הנח אוטם פלסטיק על גבי זכוכית הכיסוי כדי ליצור אטימה מאובטחת בין החלקת הכיסוי לתא, תקן על ידי הברגת אוטם הפלסטיק עם מהדקי ההזזה של החדר כדי למנוע דליפה של המדיום. כעת, פיפט 37 מעלות צלזיוס חומם מראש מדיום מיקרוסקופיה לאזור המרכזי.

הכנס את גלאי החום לחריץ המיועד של החדר וקשר את האלקטרודות של החדר לבקר טמפרטורה אוטומטי TC-324B השומר על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה תמיסת חלבון שהופשרה בעבר ב-10,000 גרם למשך 30 דקות לפחות כדי להסיר אגרגטים של חלבון שעלולים להוביל לסתימת מחט אם הם קיימים בנימי המיקרו-הזרקה. בעזרת קצה פיפט גמיש טען מחט מיקרו-הזרקה עם מיקרוליטר אחד של תמיסת חלבון מהצד האחורי.

אם קיימות בועות אוויר בקצה המחט, הקש בעדינות על בסיס המחט על מנת להסיר אותן. לאחר מכן כוונן בזהירות את מחזיק המחט במכשיר המיקרומניפולציה. עם הברגת מחט המיקרו-הזרקה למחזיק המחט, הפעל לחץ על המחט באמצעות התקן לחץ מיקרו-הזרקה לפני העברת קצה המחט למדיום תרבית התא.

לאחר מכן, מקם את המחט בשדה הראייה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה ואז מצא תא מעניין והורד בהדרגה את המחט מעל התא. למיקרו-הזרקה גע בעדינות בקרום הפלזמה של התא שעשוי להספיק כדי לחדור לתא או לסייע לקרע של הממברנה החולפת על ידי הקשה עדינה מאוד על מערך המיקרוסקופ. עצור את תהליך ההזרקה ברגע שהזרימה לתא נראית על ידי הזזת קצה המחט כלפי מעלה לתוך המדיום.

לפני הפעלת הלייזר, עבור לערוץ GFP והתחל רכישת זמן-lapse של תמונה. לאחר מכן, צייר ידנית את האזור שיש להלבין בערוץ GFP תוך כדי viewהתצוגה. התחל פוטוהלבנה על ידי הדק ידני של לייזר 405 ננומטר לפחות שלוש עד ארבע פריימים לאחר התחלת רכישת התמונה.

הגדר את רכישת התמונה GFP 488 ננומטר בתוכנה לחשיפה של 500 אלפיות השנייה ומרווח זמן של 1500 אלפיות השנייה. לאחר מכן, התאם את הגדרות התוכנה לרכישת סרטי זמן-lapse דו-ערוציים או תלת-ערוציים על ידי סימון ריבוע סדרת אורכי הגל ובחירת מספר הערוצים הרצוי בתפריט אורך הגל הנרכש. לפני הפעלת הלייזר, התחל רכישת זמן לשגות תמונה וצייר ידנית את האזור להפעלה פוטו בערוץ ניגודיות הפאזה תוך כדי צפייה בתצוגה.

לאחר מכן התחל פוטו-אקטיבציה על ידי טריגר ידני של לייזר 405 ננומטר לפחות שלוש עד ארבע פריימים לאחר התחלת רכישת התמונה. לניתוח תוצאות ה-FRAP, פתח את סרטוני קיטועי הזמן הנגזרים מ-VisiView בתוכנת MetaMorph. גזור ערכי עוצמה של האזורים המולבנים עבור כל נקודת זמן של התאוששות הקרינה על ידי ציור ידני של האזורים המתאימים באמצעות MetaMorph.

צייר צורה בקצה ה-lamellipodium המכסה את כל האזור המולבן או חלק ממנו והתאם ידנית את מיקומה במסגרות הבאות במידת הצורך כדי לעקוב אחר שינויים בעוצמות הלמליפודיות של האזור המתאים לאורך זמן במהלך תזוזה של הקצה המתקדם. לתיקון הרקע ורכישת פוטו-הלבנה, נתח אזורים מחוץ ובתוך התאים בהתאמה. לאחר בחירת אזור עניין, חלץ את ערכי העוצמה שלו ב-MetaMorph באמצעות מדידות האזור בתפריט מדידה.

ודא שאפשרויות הזמן שחלף והעוצמה הממוצעת נבחרו בתפריט התצורה. לחץ על פתח יומן ובחר חילופי נתונים דינמיים. לאחר מכן לחץ על אישור כדי לפתוח גיליון אלקטרוני של Excel ולחץ שוב על כפתור היומן הפתוח כדי להדביק את ערכי MetaMorph ב-Excel.

השתמש בערכי העוצמה הנגזרים מ- MetaMorph כדי לחשב עקומות התאוששות פלואורסצנטיות של FRAP על-ידי הדבקת ערכי העוצמה בגיליון אלקטרוני של Excel המכיל נוסחאות מתאימות. התאוששות הקרינה של האזור הפוטו-מולבן מנורמלת לרקע ולאזורים פנימיים. לחישוב מחצית הזמן של התאוששות הקרינה הדבק את הערכים של עקומות התאוששות הקרינה עם זמנים מתאימים לתוך SigmaPlot ולאחר מכן בצע התאמת עקומה באמצעות הכלי עלייה אקספוננציאלית למקסימום של אשף ההתאמה הדינמית, בחירת פונקציה מונו או דו-מעריכית בהתאם להתאמת העקומה הטובה ביותר.

ניתן להדביק את הפרמטרים המתקבלים על ידי פתרון הפונקציה שנבחרה בגיליון אקסל המכיל את הנוסחה המתאימה המאפשרת לחשב מחצית זמן התאוששות בהתאמה בשניות. למדידת הדיפוזיה של אקטין פוטו-אקטיבי בעת ההפעלה, כמו גם הצטברות שלו בתוך אזור ספציפי, כגון ה-lamellipodium, השתמש ב-MetaMorph כדי לקבוע את העוצמות לאורך זמן באזורים המתאימים כמו גם מחוץ לתא על מנת לקבוע את הקרינה ברקע לנורמליזציה. לבחינת קצב התזוזה המדויק של אקטין הניתן להפעלה הרחק מאזור ההפעלה או קצב השילוב שלו בתוך ה-lamellipodium, צור עקומות פלואורסצנטיות מנתונים שנגזרו בעבר מ-MetaMorph.

הדבק את ערכי העוצמה עבור אזור הרקע המשמש לנורמליזציה, האזור הציטוזולי המופעל באור או האזור הלמליפודיאלי שיש לחקור בגיליון אלקטרוני של Excel המכיל נוסחאות מתאימות. תמונות ניגודיות פנים של תא פיברובלסטים NIH 3T3 לפני ואחרי מיקרו-הזרקה של GTPase Rac1 הקטן מוצגות כאן. בערך 12 דקות לאחר המיקרו-הזרקה התא שינה את המורפולוגיה שלו מה שמעיד על הזרקה מוצלחת.

מיחזור של EGFP VASP מולבן על ידי מולקולות לא מולבנות בקצה lamellipodium מוצג כאן. בדוגמה הספציפית הזו התאוששות פלואורסצנטית מתיישבת בכ-80% מהפלואורסצנטיות לפני ההלבנה. עם פוטו-אקטיביזציה, אקטין GFP פוטו-אקטיבי מתפזר במהירות מחוץ לאזור הציטוזולי.

חלק ממונומרי האקטין הפוטו-אקטיביים עובר לחזית ויוצר פרץ מהיר של פלואורסצנטיות ב-lamellipodia. שילוב הקרינה נמוך להפליא בלמליפודיה המרוחקת מהאזור הפוטו-אקטיבי מכיוון שחלק המונומרים של אקטין פוטו-אקטיבי מדולל עם מונומרים לא מופעלים במסעם דרך הציטוזול. כאשר אקטין GFP פוטו-אקטיבי מתפזר הרחק מהאזור הפוטו-אקטיבי לאורך זמן, הוא מוחלף ברציפות באקטין שאינו פוטו-אקטיבי.

כתוצאה מכך נצפתה ירידה הדרגתית בעוצמת הקרינה של אזור זה. עם הזמן lamellipodia קרוב לאזור ההפעלה הציטוזולי משלב במהירות אקטין פלואורסצנטי. הירידה הבאה בקרינה נובעת פשוט מדה-פולימריזציה של אקטין ודיפוזיה של מונומר הרחק מהלמליפודיום.

לכן, כאשר ניסויים מבוצעים על מערכת מיקרוסקופיה אחת, השילוב של מיקרו-הזרקה וטכניקות FRAP או פוטו-אקטיבציה יכול להתבצע באופן מציאותי תוך מספר דקות, תלוי באופי החלבונים הנחקרים. זכרו תמיד לשמור על עצמכם מאושרים לפני, במהלך ואחרי מיקרומניפולציה או לאחר חשיפה לאור לייזר. עבור FRAP ופוטו-אקטיבציה חשוב במיוחד שהאזור שנבחר ישמור על שלמותו המבנית לאורך כל הסרט.

ניתן להשלים את הליך המיקרו-הזרקה על ידי יישום מקומי של תרופות חדירות לקרום פלזמה או מעכבי שלד ציטו על מנת לטפל בהשלכות המיידיות של טיפולים נתונים ברמה התת-תאית. טכניקות מיקרומניפולציה סללו את הדרך לחקור תכונות דיפוזיה ודינמיקה תת-תאית של רכיבים וקומפלקסים של שלד תאים ולהבין מסלולים יד שנייה המווסתים מורפוגנזה תאית. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב ולנטר את הדינמיקה המרחבית-זמנית של חלבונים ציטוזוליים, של חלבונים המשולבים בפעולה בתוך השלד הציטולוגי או שוכנים באברונים תת-תאיים שונים, ובסופו של דבר לפענח את הקינטיקה של ויסות התאים.