הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את תנועתיות פני השטח של חיידקים הנקראת נחיל בצורה סטנדרטית וניתנת לשחזור. זה מושג על ידי הכנה וריפוי של לוחות התנועתיות על פני השטח. השלב השני הוא לחסן את לוחות בדיקת התנועתיות של פני השטח בחיידקים ולדגור את הלוחות הללו בסביבה מבוקרת.

לאחר מכן, דפוסי גידול החיידקים במבחני הצלחת מצולמים בזמן אמת. השלב האחרון של ההליך הוא עיבוד התמונות לכימות. בסופו של דבר, הליך זה מספק פרוטוקול סטנדרטי להכנת בדיקת לוחית תנועתיות פני השטח ליצירת מידע דינמי כמותי כגון קצב התפשטות נחיל או התפלגות צפיפות מוצר ביולוגי עבור חיידקים מודאליים על פני השטח.

קבוצות רבות מבצעות בדיקות תנועתיות פני השטח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מספקים פרוטוקול שיטתי הממזער את המשתנים המרובים שעלולים להוביל לחוסר עקביות. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום תנועתיות פני השטח של חיידקים, כגון כיצד חיידקים מתיישבים סוגים שונים של משטחים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תנועתיות נחילי פסאודומונס עם כמה שינויים, ניתן ליישם אותה גם לחקר חיידקים מודאליים אחרים על פני השטח. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ששינויים קטנים בפרוטוקול או בסביבת המעבדה יכולים להשפיע מאוד על תוצאות בדיקת הנחיל. מי שתדגים את ההליך תהיה מורגן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, הכינו תערובת חקלאית על ידי שילוב של 200 מיליליטר של FAB מינוס מדיום נחיל אמוניום גופרתי, 0.9 גרם אגר אצילי ו-0.2 גרם חומצות קאינו לבקבוק מדיה של 500 מיליליטר. השתמש בצלחת ערבוב כדי לערבב היטב את המדיה. לאחר מכן, יש לעקר את המדיה באוטוקלב המוגדר ל-121.1 מעלות צלזיוס למשך 22 דקות עם אפשרות אוורור מהיר.

מיד לאחר העיקור, הדק את מכסה בקבוק המדיה כדי למנוע אידוי מים. הנח את המדיה על צלחת ערבוב מגנטית וקרר את ה-AED ל-50 מעלות צלזיוס בסביבה בטמפרטורת הסביבה תוך ערבוב פעיל. אם יש להשתמש באגר בנקודת זמן ניסויית מאוחרת יותר, ניתן לשמור אותו חם באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס או באינקובטור למשך 15 שעות ללא ערבוב פעיל.

כאשר המדיה מגיעה לכ-50 מעלות צלזיוס בשני מיליליטר גלוקוז מעוקר מסנן, תוך שימוש בטכניקות סטריליות סטנדרטיות, יש לערבב היטב עם מוט הערבוב המגנטי כדי למנוע היווצרות בועות במדיה. במכסה המנוע, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להכניס 7.5 מיליליטר מהאדיה לצלחות פטרי בודדות של 60 מילימטר. אם רוצים שטח פנים גדול יותר, הכניסו 25 ליטר אדיה לצלחות פטרי של 100 מילימטר.

השאירו את כל הכלים לא נערמים ובדקו את מכסה המנוע בגובה בולסי כדי להבטיח משטח אופקי אחיד לאגר להתמצקות. לצלחות של 60 מילימטר, הניחו בצד את מכסי הכלים ורפאו את האגר החשוף במכסה המנוע למשך 30 דקות. מנות גדולות יותר של 100 מילימטר ידרשו זמן ריפוי ארוך יותר.

הלחות, זרימת האוויר והטמפרטורה של מעבדה נתונה עשויים לחייב בדיקת זמן הריפוי לנחיל אופטימלי של החיידק שלך. לאחר הייבוש, יש לחסן מיד את ה-APLs בתאים שגודלו מראש בנפרד לשלב הגידול הרצוי. כדי להתחיל, בחר מושבת חיידקים מבודדת מצלחת LB טרייה וחסן לשישה מיליליטר תרבית. מדיה.

דגרו את התרבות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול אופקי. למחרת, יש לחסן בין 1 ל-5 מיקרוליטר מתרבית הלילה על צלחות אגר הנחיל המיובשות על ידי דקירת משטח האגר בעזרת קיסם סטרילי או מחט חיסון תיל, בהתאם לזן החיידקים, להעביר את לוחות בדיקת הנחיל לאינקובטור עם טמפרטורה מוגדרת ל-30 מעלות צלזיוס, 37 מעלות צלזיוס, או 42 מעלות צלזיוס. הפוך את הלוחות כך שעודף לחות יתעבה על מכסה הצלחת ולא על האגר, אזן את החיידקים בטמפרטורות ספציפיות לזן למשך שעתיים או ארבע שעות ממש לפני הדמיית זמן-lapse.

לאחר מכן, העבירו את הלוחות ליחידת ההדמיה in vivo כך שהחיידקים על פני השטח החקלאי פונים כלפי מטה לכיוון המצלמה ההפוכה של היחידה. מלאו את כל מכסי צלחת הפטרי בכמות קטנה של מים. לאחר מכן הנח כל מכסה כששפת המים פונה כלפי מעלה על גבי לוחות ה-AER ההפוך.

בתוך יחידת ההדמיה, אטום את מארז ההדמיה כדי לשמור על רמת לחות קבועה, כוונן את הגדרות ההדמיה של יחידת ההדמיה והתחל בהדמיה דולג זמן של פעילות הנחיל. לאחר הדמיה בזמן אמת, ניתן לנתח את דינמיקת הנחיל של החיידקים באמצעות ניתוח תמונה סטנדרטי כגון תמונה J בניסוי תנועתיות פני השטח. בדיקת תכולת הלחות של אגר ממש לפני החיסון היא חיונית להשגת תוצאות נחילים מוצלחות.

באופן אופטימלי לוחות AER יקלו על נקודת חיסון הדוקה וישפרו את פעילות נחילי החיידקים, בעוד שצלחות מיובשות יתר ידכאו את תנועתיות פני השטח בנוסף לתכולת הלחות, נוכחותם או היעדרם של תוספי מדיה יכולים גם להשפיע על פעילות הנחיל של חיידקים כפונקציה של טמפרטורת הדגירה על ידי שימוש בזני חיידקים, המבטאים חלבונים זוהר או פלואורסצנטיים. ניתן ללכוד את דינמיקת התחרות בין שני מיני חיידקים שונים בסרטון דולג זמן. יתר על כן, ניתן לברר ולכמת שינויים בצפיפות התאים המקומית ובקצב הביוסינתזה של שומנים מקדמי ניידות בתוך נחיל החיידקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית שחלפה בזמן.

בצע הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית על מנת לענות על שאלות לגבי התנהגות תאים בודדים כדי ליצור ניתוח מפורט, מיקרוסקופי ומיקרוסקופי של תנועתיות פני השטח של חיידקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת נחיל סטנדרטית וניתנת לשחזור ולקבל ניתוח מקיף של תנועתיות פני השטח של חיידקים על ידי הכנה, ריפוי וחיסון מבחני תנועתיות פני השטח ועיבוד וניתוח התוצאה בדפוסי גידול חיידקים.