מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להראות נדידת לימפוציטים מסוג T שאינה נדבקת על פני שכבה אחת של תאי גידול דבקים. זה מושג על ידי הקמת שכבה אחת של תאי גידול דבקים בבארות של שקופיות מסיכות טפלון מצופות פולי D ליזין כאפקטור שלב שני המסומן פלואורסצנטי, לימפוציטים T משוקעים במרכז השכבה החד-שכבתית באמצעות סעפת שקיעת תאים. לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי כדי להמחיש את נדידת התאים הלא נצמדים מעל החד-שכבה.

התוצאות מראות כי הנדידה ותפקודי האפקטור של לימפוציטים T שאינם נדבקים בתרבית משותפת עם חד-שכבת תאי גידול דביקה נשמרים לאחר שהלימפוציטים הומרו עם וקטור רטרו-ויראלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן למדוד נדידה רדיאלית של לימפוציטים T אפקטורים שאינם דבקים בתרבית פחם עם תאי גידול דבקים. יש לכך השלכות מרחיקות לכת על חולים עם גידולי מוח ראשוניים או גרורתיים מכיוון שלימפוציטים T ציטוטוקסיים אלוגניים שעברו שינוי כדי לבטא גן מפעיל פרו-תרופתי, כגון ציטוזין דאמינאז, נבדקים כגישה רב-מודאלית לחיסול גידול במוח.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בהקמת חד-שכבות של תאי גידול דבקים בשל ההטרוגניות של צמיחת תאי הגידול במאפייני ההיצמדות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהשלבים ליצירת חד-שכבת גידול אחידה ושקיעה יעילה של L-O-C-T-L שאינו דבק דורשים הבנה מנוסה של המאפיינים של שני סוגי התאים. כדי להתחיל מקם עד ארבעה מעוקרים.

10 שקופיות מצופות טפלון היטב בצלחת פטרי סטרילית בגודל 150 מילימטר על 15 מילימטר. הניחו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על 10 מילימטר המכילה שניים עד שלושה מיליליטר מים סטריליים ליד המגלשות כדי לספק לחות. לאחר מכן, הכניסו את השקופיות על ידי כיסוי כל באר בתמיסה של 100 מיקרוגרם למיליליטר של פולי D ליצין או פולי L ליזין.

דגרו את השקופיות למשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז שאפו את התמיסה ושטפו את פני הבאר פעמיים עם PBS עם בארות הדגימה המוכנות. קצור בקבוק משולב של תאי גידול דבקים. ספרו את מספר התאים בני הקיימא במיקרוסקופ אור, ולאחר מכן השעו את התאים בריכוז של חמישה כפול 10 עד ששת התאים למיליליטר.

במדיום גידול חוצץ, הוסף חמישה עד 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר, תלוי בסוג תא הגידול, הביא את נפח הבאר עד 40 מיקרוליטר עם מדיום ופיפטה למעלה ולמטה לאט כדי לפזר את התאים באופן שווה. לאחר זריעת הבארות, אפשר לתאי הגידול להתיישב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן הניחו את המכסה על צלחת הפטרי והעבירו אותו בזהירות לחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם דגירה של 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפחות.

שנה את מדיום התרבות על הבארות מדי יום על ידי הסרה בזהירות של חלק מהמדיום מהחד-שכבתי והחלפתו בנפח גדול יותר של מדיום תאי T שלם טרי. התאים בדרך כלל יהיו מתכנסים תוך יום עד שלושה ימים כדי להכין תאים לשקיעה על חד-שכבת תא הגידול. קצרו את תאי ה-T שאינם נדבקים וסמנו אותם בצבע התפשטות תאים על פי פרוטוקול היצרן לפחות שעה לפני הבדיקה.

לאחר מכן, הניחו את החדר הלח המכיל את תאי הגידול בארון הבטיחות הביולוגי. שטפו את הבארות עם PBS על ידי פיפטינג ואז הוסיפו 45 מיקרוליטר של מדיום שלם עם 10% סרום לבארות. החלק סעפת שקיעת תאים מעוקרת מעל הבארות עד שהוו בקצה הסעפת נוגע בתחתית המגלשה.

וודא שהמדיום נראה בערוצי הסעפת. לאחר מכן ספור את התאים שאינם נדבקים והשהה אותם באחת עד פעמיים 10 עד החמישית. תאים למיקרוליטר במדיום.

לשבש בעדינות את התאים כדי לחסל כל אשכולות תאים שיפריעו לשקיעת התאים. פיפטה לאט מיקרוליטר אחד של מתלה התא לתעלת הסעפת עבור כל אחד. ובכן, לאחר מכן דגרו את המנגנון בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לתאים בתעלה להתיישב על החד-שכבה.

לאחר שהתאים התייצבו, הרם בעדינות את הסעפת ישר כלפי מעלה מבלי לגעת בשקופית. ודא שכדורי התא ישבו בהיקף תעלת הסעפת. בעזרת מיקרוסקופ, התאים היושבים צריכים להיצמד מעט לשכבה החד-שכבתית כך שהזזה עדינה של השקופית לא תפזר את הגלולה.

לאחר אישור שהתאים שקעו, העבירו את השקופית למיקרוסקופ הפוך המצויד בפחמן דו חמצני ותא לחות. השתמש במטרה ארבע x להדמיה פלואורסצנטית בשדה בהיר ורב-ערוצית של התאים. רכוש תמונות של אזור נתון בערוצי שדה בהיר ופלורסנט ולאחר מכן הוסף פסי מיקרון עם תוכנת לכידת תמונות.

אחסן את השקופית בחממה לחה בין נקודות זמן לאחר רכישת כל נקודות הזמן. גרור ושחרר את קבצי התמונה לתוכנית עריכת התמונות ובחר באפשרות הוסף שכבה כדי ליצור קובץ תמונה עם מספר שכבות. מזג את האור ואת התמונות הפלואורסצנטיות לשכבה אחת.

השתמש בתוכנת הרכישה כדי לצלם תמונות של שטח של שמונה מילימטר על שמונה מילימטרים. יש להגדיר את התוכנה לתפור תמונות שצולמו יחד באופן אוטומטי באמצעות הערוץ המיוצג בצורה הטובה ביותר על פני כל הבאר. אם מצלמים רק תעלות פלואורסצנטיות, זה אמור להיות הערוץ להדמיית התאים הדבקים.

לחלופין, ניתן לתפור את התמונות באמצעות תוכנת עריכת תמונות. זה נעשה על ידי יישור אזורים של התמונות שנשמרו מתמונה אחת לאחרת ושכבת התמונות זו על גבי זו עד ליצירת תמונה שלמה. תפר את התמונות יחד באמצעות תוכנת התמונות.

השתמש בתמונות המשולבות כדי ליצור מפות פלואורסצנטיות בעוצמת פני השטח עם תוכנת Image J כדי להמחיש צבירה של תאי T פלואורסצנטיים או התפשטות לאורך זמן. לימפוציטים T ציטוטוקסיים אנושיים הידועים בשם Allo CTL שהומרו, עם וקטור רטרו-ויראלי מוכשר לשכפול המקודד גן ביטוי חלבון פלואורסצנטי בצבע ירוק אזמרגד ישבו במרכז שכבה אחת של תאי גליומה. לאחר ארבע שעות, כל ה-OCTL יצר אגרגטים גלויים עד 24 שעות.

כתמים ריקים הופיעו בחד-שכבת התא הדבוק המעידים על ליזה של תאי הגידול וחלק מ-allo CTL נדד מעבר לקצה הקדמי. עכברים בעלי תווית פלואורסצנטית Allo CTL ישבו במרכז שכבה חד-שכבתית של תאי גליומה עם תווית פלואורסצנטית של שפעת בשעה אחת Allo CTL הקשורים קשר הדוק לתאי הגליומה ב-48 שעות, Allo CTL נדד הרחק ממרכז עוצמת פני השטח של השכבה החד-שכבתית. מפות פלואורסצנטיות נוצרו מתמונות אלה באמצעות תוכנת תמונה J ומראות נדידה משמעותית מהמרכז לאחר 48 שעות.

חשוב לשנות את מדיום התרבות מדי יום עבור חד-שכבת תאי הגידול כדי לשמור על תנאי תרבית בריאים. בנוסף, לאחר השליטה בשקיעה של תאים שאינם דבקים אמורה להימשך כ -20 דקות בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מעקב אחר נתיב תאים כדי לענות על שאלות לגבי הקצב שבו allo CTL נודד על פני השכבה החד-שכבתית או הזמן שבו הם במגע עם תאי גידול המבצעים את הפונקציות הציטוטוקסיות שלהם.

פרוטוקול זה יסייע לחוקרים בתחום הטיפול הגנטי החיסוני לחקור את הנדידה של לימפוציטים מסוג T שעברו שינוי גנטי בתרבית משותפת עם תאי גידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאים שאינם דבקים ודבקים לכל תרבית משותפת וכיצד להשתמש בסעפת שקיעת התאים כדי לחקור נדידה רדיאלית אופקית של תאים שאינם דבקים על פני חד-שכבת תאי גידול.