מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים
11 בפברואר 2015
אנו מתארים פרוטוקול לניטור ניידות רדיאלית של תאים חיסוניים שאינם נצמדים במבחנה באמצעות מנגנון סעפת/החלקה של שקיעת תאים. נדידת תאים עוקבת אחר חד-שכבות של תאי גידול או על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בדיקה במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בניידות התא ובתפקוד הציטוטוקסי.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים נדידה של תאי T אפקטורים שאינם נצמדים מעל שכבה אחת (monolayer) של תאי גידול נצמדים. זאת מושגים תחילה על ידי הקמת שכבה אחת של תאי גידול נצמדים בבארות של שקופיות עם מסכת טפלון מצופות poly D lysine, ובשלב שני תאי T אפקטורים מסומנים פלואורסצנטית שוקעים למרכז השכבה באמצעות סבב שקיעת תאים (cell sedimentation manifold). לאחר מכן, מיקרוסקופיית אור ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשות להדמיית נדידת התאים שאינם נצמדים מעל השכבה אחת.
התוצאות מראות כי יכולות הנדידה והפונקציות האפקטוריות של לימפוציטים T שאינם נצמדים, בתרבית משותפת עם שכבה של תאי גידול נצמדים, נשמרות לאחר שהלימפוציטים הועברו באמצעות וקטור רטרו-ויראלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן למדוד נדידה רדיאלית של לימפוציטים T אפקטורים שאינם נצמדים בתרבית משותפת עם תאי גידול נצמדים. לדבר זה השלכות מרחיקות לכת עבור חולים עם גידולי מוח ראשוניים או גרוריים, כיוון שלימפוציטים T ציטוטוקסיים אלוגנאיים, שעברו שינוי כדי לבטא גן מפעיל של פרו-תרופה, כגון cytosine deaminase, נבדקים כגישה רב-מודיאלית להסרת גידולים במוח.
באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו ביצירת שכבות מונושכבה של תאי גידול דבקים, וזאת בשל ההטרוגניות של מאפייני ההיצמדות בצמיחת תאי הגידול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים ליצירת שכבת מונושכבה אחידה של הגידול ושיקוע יעיל של L-O-C-T-L שאינם דבקים דורשים הבנה מנוסה של מאפייני שני סוגי התאים. כדי להתחיל, הניחו עד ארבעה סטריליים.
10 זכוכיות עם ציפוי Teflon בעלות בארות בתוך צלחת פטרי סטרילית בגודל 150 millimeter על 15 millimeter. הניחו לצד הזכוכיות צלחת פטרי בגודל 35 millimeter על 10 millimeter המכילה שני עד שלושה מיליליטר של מים סטריליים כדי לספק לחות. לאחר מכן, בצעו טיפול מקדמי (preco) לזכוכיות על ידי כיסוי של כל בארה בתמיסה של 100 micrograms per milliliter של poly D lycine או poly L lysine.
דגרו את השקופיות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, לאחר מכן שאבו את התמיסה ושטפו את פני הבאר פעמיים עם PBS כאשר בארי הדגימה מוכנים. קצרו בקבוק של תאי גידול נצמדים שהגיעו למצב של התלכדות (confluent). ספרו את מספר התאים החיוניים באמצעות מיקרוסקופ אור, ולאחר מכן השעיו את התאים בריכוז של 5×10⁶ תאים למילליליטר.
בתוך מצע גידול עם בופר, הוסף חמישה עד 10 µL של תרחיף התאים לכל באר, בהתאם לסוג תאי הגידול, השלם את נפח הבאר ל-40 µL באמצעות מצע ובצע פיפוט איטי מעלה ומטה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. לאחר זריעת הבארה, השאר את תאי הגידול לשקוע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הנח את המכסה על צלחת הפטרי והעבר אותה בזהירות לאנקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide להדגרה למשך 24 שעות לפחות.
החליפו את מצע התרבית בבארים מדי יום על ידי הסרה זהירה של חלק מהמצע מהשכבה החד-שכבתית (monolayer) והחלפתו בנפח גדול יותר של מצע T-cell מלא וטרי. התאים יהיו בדרך כלל קונפלואנטיים (confluent) בתוך יום עד שלושה ימים כדי להכין אותם לשקיעה על גבי השכבה החד-שכבתית של תאי הגידול. אספו את תאי ה-T שאינם נצמדים וסמנו אותם בצבע למעקב אחר התרבות תאים (cell proliferation dye) בהתאם לפרוטוקול היצרן, לפחות שעה אחת לפני הבדיקה.
בשלב הבא, הניחו את התא הלח את שקופיות תאי הגידול בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. שטפו את הבארות באמצעות PBS בעזרת פיפטה, ולאחר מכן הוסיפו לבארות 45 µL של מצע גידול מלא עם 10% סרום. החליקו מניפולטור סטרילי לשקיעת תאים מעל הבארות, עד שהוו וו בקצה המניפולטור נוגע בתחתית השקופית.
וודאו שהתווך נראה בערוצי המניפולד. לאחר מכן ספרו את התאים שאינם נצמדים והשעיו אותם בריכוז של 1-2 × 10⁵ תאים ל-µL בתווך.
שבשו בעדינות את התאים כדי להסיר מקבצי תאים שעלולים להפריע לשקיעת התאים. העבירו באיטיות בעזרת פיפטה 1 µL מתיתלי התאים לתוך התעלה של המניפולטור עבור כל באר. לאחר מכן, דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לתאים בתעלה לשקוע על השכבה החד-שכבתית.
לאחר שהתאים שקעו, הרמו בעדינות את המניפולד (manifold) ישר למעלה מבלי לגעת בזכוכית. ודאו שמשקעי התאים התמקמו בתוך היקף תעלת המניפולד. תחת מיקרוסקופ, התאים שהתמקמו אמורים להיצמד קלות לשכבה החד-שכבתית (monolayer), כך שהזזה עדינה של הזכוכית לא תפזר את המשקע.
לאחר אישור שכיבון התאים, העבירו את הזכוכית למסור מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא פחמן דו-חמצני ולחות. השתמשו בעדשה עם הגדלה של פי 4 לצילום התאים בשדה בהיר ובדימוי פלואורסצנטי רב-ערוצי. רכשו תמונות של אזור נתון בערוץ השדה הבהיר ובערוצים הפלואורסצנטיים, ולאחר מכן הוסיפו סרגלי מיקרון באמצעות תוכנת לכידת התמונות.
לאחר השגת כל נקודות הזמן, אחסן את הפיתוח באינקובטור לח ברווחים שבין נקודות הזמן. גרור והנח את קובצי התמונה אל תוכנת עריכת התמונות ובחר באפשרות הוספת שכבה (add layer) כדי ליצור קובץ תמונה עם מספר שכבות. מיזג את תמונות האור והפלואורסצנציה לשכבה אחת.
השתמש בתוכנת הרכישה כדי לצלם שטח של שמונה מילימטרים על שמונה מילימטרים. יש להגדיר את התוכנה כך שתבצע תפירה (stitch) אוטומטית של התמונות שצולמו באמצעות הערוץ המיוצג בצורה הטובה ביותר בכל הבאר. אם צולמים בערוצי פלואורסצנציה בלבד, זה צריך להיות הערוץ המשמש לצילום התאים הדבקים.
לחלופין, ניתן לתפור את התמונות באמצעות תוכנה לעריכת תמונות. פעולה זו מבוצעת על ידי יישור אזורים בתמונות שנשמרו מתמונה אחת לשנייה והנחת התמונות זו על גבי זו עד ליצירת תמונה שלמה. תפרו את התמונות יחד באמצעות תוכנת העריכה.
השתמש בתמונות המשולבות כדי ליצור מפות עוצמת פלואורסצנציה של פני השטח באמצעות תוכנת Image J, כדי להמחיש ויזואלית אגרגציה או התפשטות של תאי T פלואורסצנטיים לאורך זמן. תאי T ציטוטוקסיים אלוגנאיים אנושיים (Allo CTL), שעברו טרנסדוקציה באמצעות וקטור רטרו-ויראלי בעל יכולת רפליקציה המקודד לגן ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (emerald green fluorescent protein), הונחו במרכז של שכבה אחת (monolayer) של תאי גליומה. לאחר ארבע שעות, תאי ה-Allo CTL יצרו אגרגטים נראים לעין עד לשעה ה-24.
שטחים ריקים הופיעו בשכבת התאים החד-שכבתיים ההיצמדים, דבר המעיד על ליזיס של תאי הגידול, וחלק מתאי ה-allo CTL נדדו מעבר לקצה הקדמי. תאי Allo CTL עכבריים המסומנים פלורסצנטית הוצבו במרכז שכבה חד-שכבתית של תאי גליומה המסומנים פלורסצנטית; לאחר שעה אחת, תאי ה-Allo CTL היו קשורי קשר הדוק לתאי הגליומה, ובתוך 48 שעות, תאי ה-Allo CTL נדדו הרחק ממרכז השכבה. מפות פלורסצנציה הופקו מתמונות אלו באמצעות תוכנת ImageJ והן מראות נדידה משמעותית הרחק מהמרכז לאחר 48 שעות.
חשוב להחליף את מצע הגידול מדי יום עבור השכבה החד-שכבתית (monolayer) של תאי הגידול כדי לשמור על תנאי תרבית בריאים. בנוסף, לאחר רכישת מיומנות, השקיעה של תאים שאינם נצמדים אמורה להימשך כ-20 דקות בעקבות נוהל זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מעקב אחר נתיב התאים (cell path tracing), כדי לענות על שאלות בנוגע לקצב שבו allo CTL נעים על פני השכבה החד-שכבתית או למשך הזמן שהם נמצאים במגע עם תאי הגידול בעודם מבצעים את תפקודיהם הציטוטוקסיים.
פרוטוקול זה יסייע לחוקרים בתחום של תרפיה גנטית אימונולוגית לבחון את נדידתו של תאי T לימפוציטים שעברו מודיפיקציה גנטית בתרבית משותפת (co culture) עם תאי גידול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תאים שאינם נצמדים ותאים נצמדים לתרבית משותפת, וכיצד להשתמש במניfold לשקיעת תאים כדי לחקור נדידה רדיאלית אופקית של תאים שאינם נצמדים מעל שכבה אחת של תאי גידול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור הניידות הרדיאלית של תאי מערכת חיסון שאינם נצמדים in vitro באמצעות סבב של שקיעת תאים (cell sedimentation manifold). נדירתו של לימפוציטים T אפקטורים על פני שכבות מונו-שכבה של תאי גידול נמעכבת באמצעות מיקרוסקופיית אור ופלואורסצנציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- לימפוקיטים T אפקטורים שאינם נצמדים ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- הבנת נדידתם יכולה לספק תובנות לגבי אימונותרפיה לסרטן.
- לשיטות קיימות לחקר נדידת תאים יש מגבלות.
- מחקר זה נועד לשפר את המדידה של ניידות לימפוקיטים T בתרבית משותפת עם תאי גידול.
מטרת המחקר
- להדגמת נדירה של לימפוציטים T אפקטורים שאינם נצמדים מעל שכבות חד-שכבתיות של תאי גידול נצמדים.
- להערכת התפקוד של לימפוציטים אלו בסביבת תרבית משותפת (co-culture).
- לבחינת היתרונות של טכניקת סבון השקעת התאים (cell sedimentation manifold).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של שכבה אחת (monolayer) של תאי גידול דבקים על שקופיות טפלון מצופות poly D lysine.
- סימון פלואורסצנטי של לימפוציטים T אפקטורים.
- שימוש במניפולטור לשקיעת תאים להנחת לימפוציטים על גבי השכבה המונית של תאי הגידול.
- ויזואליזציה של נדידת תאים באמצעות מיקרוסקופיית אור ופלוורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- לימפוציטים T אפקטורים נדדו בהצלחה מעל לשכבה Ein-layer של תאי גידול.
- הנדידה והתפקודים האפקטוריים נשמרו לאחר טרנסדוקציה באמצעות וקטור רטרו-ויראלי.
- שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של נדידה רדיאלית.
- לממצאים יש השלכות על פיתוח טיפולים לגידולי מוח.
מסקנות
- טכניקת סבב השקיעה של תאים יעילה לחקר נדידה של T lymphocytes.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של תגובות חיסוניות בסביבות גידולים סרטניים.
- מחקרים עתידיים עשויים לנצל שיטה זו ליישומים טיפוליים באונקולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של ניידות תאי חיסון שאינם נצמדים ותפקוד ציטוטוקסיק בתרבית משותפת עם תאי גידול נצמדים, ובכך מספקת ראיות פרה-קליניות קריטיות עבור מועמדים לאימונו-אונקולוגיה. על ידי שמירה על התפקוד האפקטורי לאחר טרנסדוקציה רטרו-ויראלית, השיטה תומכת בהסרה מכניסטית של סיכונים בטיפולים בתאי T שעברו שינוי גנטי לפני הערכה in vivo. הבדיקה מגשרת בין שלב תיקוף המטרות בשלב הגילוי לבין הערכה טרנסלציונית של תרופות מבוססות תאים, דבר הרלוונטי במיוחד עבור אימונותראפיות לגידולי מוח הדורשות הוכחה לליזיס של הגידול וליכולת נדידה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של נדידת תאי T אפקטורים וליזיס של גידול בזמן אמת.
- ערך תפעולי: מבדיל בין תת-אוכלוסיות שעברו טרנסדוקציה לאלו שלא, באמצעות סימון פלואורסצנטי לצורך תיקוף פונקציונלי.
- ערך ניבוי: תומך ברמת הביטחון במטרה על ידי מתאם בין נדידה רדיאלית לבין פונקציות אפקטוריות ציטוטוקסיות במערכת של שיתוף-תרבית (co-culture) רלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר מפות פלואורסצנציה כמותיות של עוצמת פני השטח למדידת פיזור תאי מערכת החיסון לאורך זמן.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של שקיעת תאי אפקטור באמצעות פלטפורמת סעפת להשקעה עקבית בין הבארות.
- מדרגיות: תאימות לפורמטים של רב-בארות המאפשרים בדיקה מקבילה של מבני וקטורים או תנאי מינון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: שומר על תפקודי האפקטור לאחר התעתוק, ובכך תומך בהערכה של תאי T שעברו מודיפיקציה גנטית לפני מחקרים in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות בין תאים והעברה של וקטורים ויראליים, ובכך מפחית עמימות בנוגע למנגנון הפעולה.
- רלוונטיות למחלה: מדמה באופן ישיר תרבית משותפת (co-culture) של גליומה, ובכך מספק מידע לפיתוח אימונותרפיה לגידולי מוח.
שילוב תהליכי עבודה וסבבי עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת הערכה מוקדמת של תכונות נדידה וציטוטוקסיות של לימפוציטים מהונדסים לפני שלבי אופטימיזציה של המולקולה המובילה ומחקרי רעילות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן היפותזות ביולוגיות בנוגע לתנועת תאי חיסון ומעורבות גידולים במערכת של שבילי תרביות משולבות (co-culture) מבוקרת.
- סריקה: מספק מדדי נדידה כמותיים ותוצאות של ציטוטוקסיות לצורך תיעדוף תאי אפקטור שעברו טרנסדוקציה של וקטורים.
- אנליטיקה: מייצר נתונים מרחביים וזמניים המבוססים על פלואורסצנציה, המאפשרים השוואה סטטיסטית של ניידות וליזיס בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תפקודי אפקטור in vitro לרצף פרה-קליני על ידי אישור שימור התפקוד לאחר שינוי גנטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת סוגים שונים של אפקטורים חיסוניים עבור התשבחות אונקולוגיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ראיות ישירות למעורבות המטרה (target engagement) והסרת סיכונים מכניסטית באמצעות ויזואליזציה של ליסיס של גידול והגירה של תאי חיסון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות סבב שיקוע (sedimentation manifold) והבחנה פלואורסצנטית, דבר המפחית שונות במבדקי תאי חיסון.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי קישור בין מוביליות ותפקוד in vitro לבין יעילות חזויה in vivo.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים של מועמדים לטיפול גנטי-אימונולוגי על ידי אישור פונקציונליות כפולה (הגירה + ציטוטוקסיות) בשלב הפרה-קליני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית ראשונית של תאי מערכת החיסון, טרנסדוקציה רטרו-ויראלית וטכניקות סימון פלואורסצנטי.
- תלוי במיקרוסקופיה הפוכה עם בקרת סביבה ובתוכנה לניתוח תמונות לצורך מיפוי פלואורסצנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה של יצירת שכבה אחת (monolayer) של תאי גידול ושקיעה של תאי אפקטור בין משתמשים ואתרים שונים.
- שיקולי התאמה כוללים תכונות היצמדות משתנות של גידולים ופנוטיפים שונים של תאי מערכת החיסון בין מינים ובמצבי הפעלה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות ביחסים אופטימליים בין תאי אפקטור למטרה ובשלמות השכבה לצורך מעקב מדויק אחר נדידה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:58
Seeding the Slides with Adherent Tumor Cells
4:05
Sedimentation of the Non-adherent T Cells onto the Tumor Cell Monolayer
5:49
Data Acquisition, Analysis, and Display
7:41
Results: Migration of Alloreactive Cytotoxic T Lymphocytes across Tumor Cell Monolayers
8:55
Conclusion
