דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות עור תלת מימדי בעובי מלא, הדומה לעור טבעי וליצור פצעים מדויקים וניתנים לשחזור בתנאים סטריליים באמצעות מכשיר פציעה אוטומטי. זה מושג על ידי הטמעה ראשונה של פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים בהידרוג'ל קולגן אחד. לאחר מכן, קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים ראשוניים יושבים על גבי ההידרוג'ל המצופה פיברונקטין.

לאחר מכן המודל מתורבת בתנאים שקועים, ולאחר מכן תחת ממשק נוזל אוויר, נוצר מקביל עור תלת מימדי בעובי מלא, המורכב ממרכיב עורי ואפידרמיס רב שכבתי. לבסוף, פצע סטנדרטי נוצר בסביבה סטרילית. בסופו של דבר, צביעה אימונוהיסטוכימית ומיקרוסקופיה משמשים להערכת המבנה ההיסטולוגי של העור הפצוע בעובי מלא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כמו מודלים של בעלי חיים, למשל, הוא שמקבילת העור בעובי מלא מורכבת מתאים אנושיים ראשוניים. אז יחד עם מכשיר הפציעה האוטומטי, אנו יכולים ליצור פצעים סטנדרטיים, כך שמכשיר הפציעה האוטומטי יכול לספק תובנה לגבי תהליכי ריפוי פצעי עור בסביבה אנושית. ניתן ליישם אותו גם במערכות שלנו כגון הנדסת רקמות עצם.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של ריפוי פצעים, כגון תהליכים ביולוגיים, תיקון עור בסיסי ודיבור צולב תאי בין מרכיב האפידרמיס לעור. כדי להתחיל, ממיסים קולגן עם 0.1% חומצה אצטית לריכוז סופי של שישה מיליגרם למיליליטר. הכן תמיסת נטרול ג'ל על ידי ערבוב של 232.5 מיליליטר של שני X dmm, 7.5 מיליליטר FCS, 7.5, מיליליטר של שלושה הי מולארי ו -2.5 מיליליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר.

מקום כונדרויטין סולפט מוחדר לבארות של צלחת 24 בארות מנתק פיברובלסטים עוריים אנושיים או HDFS ומצנטריפוגה את תרחיפי התאים למשך חמש דקות. ב-270 גרם, ספרו את התאים והצנטריפוגה Eloqua של 1, 200,000 HDF למשך חמש דקות. ב-270 גרם, הסר את ה-snat והשתמש בארבעה מיליליטר של תמיסת נטרול ג'ל מקוררת כדי להשעות בזהירות את ה-HDF מבלי לגרום לבועות אוויר.

לאחר מכן השעו מחדש את התמיסה עם שמונה מיליליטר תמיסת קולגן. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה רב-שלבית והוסיפו 500 מיקרוליטר של תערובת תאי קולגן לכל תוספת. בצלחת 24 הבארות דגרו את הג'לים למשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לג'לים להתמצק.

לאחר מכן השתמש בשני מיליליטר DMM בתוספת 10% FCS לבאר. כדי לטבול את הג'לים, דגרו את הג'לים למשך 24 שעות. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להמיס חלבון פיברונקטין אנושי לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר דגירה של הג'לים המקבילים לעור למשך 24 שעות, הסר את המדיום. השתמש ב-25 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין כדי לכסות כל מקבילה עורית ולדגור על הג'לים למשך 30 דקות. בינתיים, השעו מחדש את האפידרמיס האנושי, קרטינוציטים או HKS עם ק"ג שניים פלוס 5% FCS לריכוז סופי של מיליון תאים לליטר זרע, 100,000 היקים על גבי כל ג'ל.

לאחר מכן דגרו ג'לים למשך 45 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד באמצעות קג"מ שני מוכנים פלוס 5% FCS הטביעו את התאים והמשיכו את הדגירה. לאחר דגירה של יומיים-שלושה, החלף את המדיום ב-2% FCS ואחריו החלפה בינונית ללא FCS, יומיים-שלושה לאחר מכן. ביום השביעי, הסר לחלוטין את המדיום.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי למקם כל תוספת לבאר אחת של צלחת שש בארות. לאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום מעלית אוויר לבאר. הקפד לא להרטיב את פני השטח של ה-FTSC.

החלף את המדיום כל יומיים-שלושה למשך 14 ימים נוספים. הכן את מכשיר הפציעה האוטומטי באמצעות 70% אתנול ואור אולטרה סגול לחיטוי אזור העבודה באמצעות מלקחיים סטריליים. יש להניח את ערכות העור באזורים המיועדים לכך בלוחית מנשא דגימת החיטוי.

הנח לוחית מנשא לדוגמה לשקע שמתחת לראש הקידוח. השתמש בתוכנת הבקרה כדי להגדיר את פרמטרי הפציעה כדלקמן. מהירות סיבוב 15, חדירת 000 סל"ד, 1.5 מילימטרים.

הנעה 100 הרץ. העבר את פרמטרי הפציעה למכשיר הפציעה האוטומטי. התחל את הליך הפציעה בסיום.

הסר את לוחית מנשא הדגימה מהשקע והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את ה-FTSE הפצוע בחזרה לתוספת המשמשת לתרבות. דגירה על ה-FTSE הפצוע עד להערכה ניסויית. השתמש במודלים לניתוח ההיסטולוגי שלו בכל עת.

ה-HDFS וה-HKS המבודדים אופיינו בצביעה אימונוהיסטוכימית לפני השימוש בהם עבור FTSE. ה-HDF חיובי למנטון, סמן לפיברובלסטים ראשוניים HEK מבטאים מאוד חלבון התמיינות מוקדם CYTOKERATIN 14, אך כמעט ללא חלבון התמיינות קרטינוציטים מאוחר CYTOKERATIN 10. ה-FTSE תורבת במשך שבעה ימים בתנאים בינוניים שקועים, ולאחר מכן 14 ימים בממשק נוזל האוויר.

במהלך תהליך זה, ה-FTSC מתכווץ באופן משמעותי תוך 21 יום. ה-HEK מתרבים על ידי שינוי הרמה הבינונית באופן שפני הדגמים נחשפים לאוויר. ועל ידי הגדלת ריכוז הסידן, מגרים את ה-HKS להתמיין לאפידרמיס רב-תאי המורכב מכמה שכבות תאים חיוניות של קרטינוציטים.

במצבים שונים של התמיינות D וקרנית אטריום. כאשר משווים את צביעת ההמטין והאאוזין של FTSE לעור אנושי מקומי, מתברר ש-FTSE מחקה ארכיטקטורה היסטולוגית של העור. ניתן לצבוע את ה-HDF בהידרוג'ל קולגן אחד בנוגדנים ראשוניים נגד וימנטין.

בנוסף, קרטינוציטים יוצרים שכבת אפידרמיס המורכבת מציטוקרטין 14 תאים חיוביים וסמן ההתמיינות המאוחר. ציטוקרטין 10 מתבטא בשכבות הסופר בסיסיות. יתר על כן, הקורניום של St.Stratum חיובי ל-RIN לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העור לחקור ריפוי פצעים עוריים ומערך מבחנה סטנדרטי המחקה מקרוב את עור האדם.