כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent
10 באוקטובר 2015
קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות קוצים דנדריטיים (dendritic spines) מנוירונים פירמידליים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם, ולכמת אותם בתלת-ממד. הדבר מושג תחילה על ידי טיפול בזכוכית כיסוי בלוחות של שישה בארות באמצעות פוליאוריטן ולמינין לצורך תרבית של תאי גזע עצביים. לאחר מכן, תאי גזע עצביים מדללים בתרבית.
התווך נזרע באמצעות תנועת פיפטה סיבובית עדינה, והתאים הושארו להבדיל עד ל-70 ימים בתרבית. לאחר חידוש קבוע של התווך, התאים עברו טרנסדוקציה עם GFP lentivirus, נצבעו עם נוגדני anti GFP ונוגשו לצפייה. לבסוף, התרביות קובעו והקוצים הדנדריטיים דוגמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בסופו של דבר, נתוני התמונה של קוצי דנדריטים אנושיים משוחזרים בתלת-ממד לצורך סיווגם וכימותם. פרוטוקול זה מספק הליך שלב-אחר-שלב להשגת נוירונים גלוטמטריים משכבות שתיים עד ארבע של קליפת המוח האנושית. הוא כולל שימוש בתאי גזע עצביים המופקים מתאי גזע אנושיים רב-עוצמה מושריים (induced pluripotent stem cells) שמקורם בפיברובלסטים אנושיים, בהתבסס על השיטה שפורסמה בעבר.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות שלנו הוא שהיא מאפשרת סגמנטציה אוטומטית של DON right ו-PY בתלת-ממד. זאת עם חיסכון ניכר בזמן לעומת תוכנות קיימות, שבדרך כלל מספקות ניתוח דו-ממדי בלבד. הסיווגים של donr ו-spy הם יעילים מאוד וקלים לשימוש.
להכנת תרביות עצביות, הניחו לוחות כיסוי מזכוכית בתוך צלחות תרבית בעלות שישה בארות והוסיפו poly ornithine; הדגירו למשך לילה תחת מTeaching flow hood. למחרת, השתמשו ב-DPBS לשטיפת לוחות הכיסוי שלוש פעמים והוסיפו laminin; הדגירו תחת מ-flow hood למשך 10 שעות לפחות. הכינו מצע תרבית המכיל את הרכיבים הבאים.
לאחר מכן, השתמש במצע כדי לזרוע ולהפיץ תאי גזע עצביים (NSCs) בצפיפות של 50,000 תאים לסנטימטר רבוע. בצע פיפטינג בתנועות סיבוביות איטיות כדי להפחית התקבצות של תאים, לצורך טרנסדוקציה של נוירונים המופקים מ-iPSC אנושיים. בכל שלב של הבשלה, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת סטימ (stock solution) המכילה 40 ננוגרם של וקטור לנטי-נגיפי GFP לכל באר תרבית המכילה מצע תרבית טרי, והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות. כדי להכין את התאים לאימונופלואורסצנציה, הסר את מצע התרבית והשתמש ב-4% formaldehyde כדי לקבע את התאים שעברו טרנסדוקציה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
לאחר מכן, השתמש ב-XPBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, טבול את לביבות הזכוכית (cover slips) ב-PBS מועשר ב-0.05% Triton X 110% horse serum והדגר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לבסוף, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את לביבות הזכוכית שלוש פעמים.
הוסף לכל כיסוי זכוכית נוגדס ראשוני ל-GFP בדילול של 1:1000 ב-100 µL של PBS עם 4% horse serum. הדגר בתיבת חשיכה בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. כעת, דלל נוגדן מסומן ב-Alexa Fluor 488 ביחס של 1:200 ב-PBS עם 0.5% tween 20, והדגר את התאים עם תמיסת הנוגדנים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים באמצעות PBS.
השתמשו בתוסף קיבוע (mounting medium) כדי לקבע את הפסחיות עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי, בחרו לפחות 10 נוירונים בריאים לכל תנאי, בעלי מורפולוגיה פירמידלית וענפי דנדריטים מקפלים, כדי לכמת 60 עד 100 micrometers לכל דנדריט. רכשו תמונות באמצעות עדשה שמנית 40 x na, 1.3 oil ולייזר 488 nanometer עם הספק שיא טיפוסי ברמת הדגימה של כ-20 micro watts; הגדירו את גודל הפיקסל לסביב 80 nanometers כדי לדגום כראוי את הקוצים הדנדריטיים.
כדי לדגום את כל נפח הנוירון, רכשו Z stack עם מרווח Z של 150 עד 300 nanometers, המניב 20 עד 30 פרוסות Z לצורך ביצוע כימות תלת-ממדי (3D) של קוצים דנדריטיים. השתמשו בהגדרות הבאות בתוכנת הניתוח לצורך עיבוד מקדים. השתמשו בסינון גאוסיאני (Gaussian filtering) על ידי בחירה ב-image processing smoothing Gaussian filter.
הגדירו את רוחב המסנן כך שיהיה שווה לגודל הפיקסל במישור XY כדי לבצע עקבה חצי-אוטומטית של דנדריטים באמצעות מודול filament tracer. בלשונית slice, השתמשו בכלי המרחק (distance tool) כדי להעריך את קוטר הדנדריט. לאחר מכן, בלשונית surpassed, לחצו על כלי ה-filaments ובחרו באפשרות skip automatic creation כדי להשיג חסון (robustness) טוב יותר בלשונית draw.
כעת בחרו ב-auto path כשיטה, ב-dendrite כסוג, והזינו את קוטר הדנדריט המשוער. באמצעות מצב הבחירה של הסמן, הפכו את הסמן למלבן, והחזיקו את מקש ה-shift תוך לחיצה ימנית על נקודת ההתחלה של הדנדריט. התוכנה תבצע חישובים ראשוניים.
כעת העבירו את הסמן לאורך הדנדריט מנקודת ההתחלה. קו צהוב המייצג את הנתיב הסביר ביותר של הדנדריט מוצג על המסך. לחצו על shift ושמאלה.
לחצו על קצה הדנדריט כדי לבצע סגמנטציה אוטומטית של קוצים בממשק המודול. לחצו על לשונית creation ברשימת ה-rebuild הנפתחת. בחרו ב-rebuild dendrite diameter וסמנו את תיבת ה-keep data.
לאחר מכן לחצו על rebuild. הגדירו את הסף כך שהנפח המופרד (segmented volume) יתאים לנפח הדנדריט בפועל. כאלגוריתם, בחרו ב-shortest distance from distance map.
לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-next תחת הלשונית slice, וקבעו את הקוץ הקטן ביותר, את קוטר הראש ואת האורך המקסימלי. לאחר מכן, תחת הלשונית surpass, הזינו את ערכי הפרמטרים; ערכים של כ-200 עד 300 nanometers עבור הקוטר המינימלי ו-four micrometers עבור האורך המקסימלי מהווים נקודות התחלה טובות. ללא סימון תיבת ה-allow spines, לחצו על כפתור ה-next. לבסוף, כווננו את סף נקודות ה-seed כך שהנקודות הכחולות המייצגות קוצים ימוקמו בראשי הקוצים בפועל.
לאחר מכן לחצו על next. כעת יבוצע החישוב המרכזי, דבר שעשוי להימשך זמן מה. תחת לשונית tools בממשק המודול, לחצו על classify spine. לאחר אימות קיומן של ארבע מחלקות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, ממשק המודול ייצור ארבעה אובייקטי filament חדשים עם תוצאות הסיווג.
לבסוף, ייצאו את הנתונים הסטטיסטיים תחת לשונית הסטטיסטיקה על ידי לחיצה על export all statistics to file. איור זה מדגים תרבית של נוירונים אנושיים המסומנים באמצעות נוגדן anti beta three tubulin. הנטייה להצטברות של תאים ניכרת גם כאן.
מוצג כאן נוירון parametal המסומן ב-GFP, 40 ימים לאחר גבייה (differentiation) מפרוגניטור קורטיקלי מאוחר. מהשכבות הקורטיקליות השטחיות. התמונה המוקטנת מראה הגדלה נמוכה יותר שבה נראה גוף התא.
לוחות אלה מייצגים שחזור תלת-ממדי של מקטעים של קוצים דנדריטיים בשלבים שונים של הבשלה. כאן מוצג הניתוח הכמותי של צפיפות הקוצים ונפח ראש הקוץ. כצפוי, שני פרמטרים אלה עולים לאורך תקופת התרבית.
בעת ביצוע הליך התרבית, חשוב לזרוע ולהפיץ את תאי הגזע העצביים בזהירות רבה על ידי הוספת תאים באיטיות ובתנועה סיבובית עדינה כדי להפחית את התגושים של התאים. זאת מאחר ששיטה זו דורשת זיהוי של נוירונים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מתארת ניתוח כמותי בתלת-ממד של קוצים דנדריטיים בנוירונים פירמידליים גלוטמטארגיים קורטיקליים אנושיים שנגזרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. ההליך כולל דימוי וכמות של קוצים אלו כדי להבין טוב יותר את המורפולוגיה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
רקע
- קוצים דנדריטיים הם קריטיים להעברה סינפטית במוח.
- נוירונים פירמידליים הם סוג מרכזי של נוירונים מעוררים בקורטקס.
- הבנת המורפולוגיה של הקוצים יכולה לספק תובנות לגבי קישוריות עצבית.
- תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מהווים מודל למחקר של נוירונים אנושיים.
מטרת המחקר
- ניתוח המורפולוגיה של קוצים דנדריטיים בנוירונים אנושיים.
- כימות של מאפייני הקוצים בתלת-ממד.
- שיפור ההבנה של מבנים סינפטיים במוח האנושי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית של תאי גזע עצביים על כיסויי זכוכית (cover slips) מטופלים.
- דיפרנציאציה של תאי גזע למשך עד 70 ימים.
- טרנסדוקציה באמצעות לנטיווירס GFP לצורך ויזואליזציה.
- דימוג של קוצים דנדריטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של קוצים דנדריטיים בנוירונים בתרבית.
- הושגה אנליזה כמותית של מורפולוגיית הקוצים.
- תובנות לגבי התכונות המבניות של נוירונים קורטיקליים אנושיים.
- ביסוס מתודולוגיה למחקרים עתידיים על מבנים סינפטיים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לחקר קוצים דנדריטיים.
- הממצאים תורמים להבנת סינפסים מעוררים.
- יישומים פוטנציאליים במחקרים על התפתחות נוירולוגית וניוון עצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
כימות תלת-ממדי של קוצים דנדריטיים בנוירונים פירמידליים המופקים מ-iPSC אנושי מאפשר ניתוח מורפולוגי ברמת דיוק גבוהה, החיוני לתיקוף של מטרות מוקדמות במערכת העצבים המרכזית (CNS). זרימת עבודה זו תומכת בביטחון חיזוי במחקרי תפקוד סינפטי ומפחיתה סיכונים בתוכניות נוירו-מדעיות תרגומיות על ידי אספקת מדדים כמותיים הרלוונטיים לבני אדם. גישה זו נועדה לסייע בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח במסלולי מחקר של מחלות נוירו-פסיכיאטריות ומחלות נוירו-דגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מכניסטית של מבנה הסינפסה בנוירונים ממקור אנושי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות צפיפות ומורפולוגיה של קוצים סינפטיים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי במודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- מספק פלטפורמה למחקרים השוואתיים בין תאי ביקורת לתאים ממקור של חולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים לשחזור של דימיון תלת-ממדי וכימות.
- מפיק פלטים כמותיים המתאימים לסריקת תרכובות בשלבים מאוחרים יותר.
- מכין מערכות נוירונליות עוברות תיקוף עבור פלטפורמות של ניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis).
- מאפשר הערכה מהימנה של מודולטורים סינפטיים בהקשר אנושי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לפנוטיפים של נוירונים אנושיים הרלוונטיים למחלה.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני במסלולי פיתוח של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספקת נקודות סיום כמותיות לפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מפחיתה סיכונים בקבלת החלטות על קידום השלב הבא על ידי ביסוס הנתונים על נוירונים אנושיים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה חסונה של היפותזות ולאפיון פנוטיפי כמותי במודלים עצביים המופקים מתאי iPSC אנושיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים מכניסטיים באמצעות ניתוח תלת-ממדי של קוצים דנדריטיים.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות סטטיסטיות של צפיפות הקוצים, נפח הראש ומצב הבשלה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro למערכות נוירונליות אנושיות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות מחקר מגוונות של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מנרמל דימות תלת-ממדי וכמותיות עבור פלטים הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית בתיקי פיתוח בנוירוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של נכסי CNS מותאם סיכון, בהסתמך על נתונים רלוונטיים לבני אדם.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בגידול תאי iPSC אנושיים ובהביאה עצבית (neuronal differentiation).
- דורש גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנה מתקדמת לניתוח תמונות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי ההדמיה והכימות.
- ייתכן שיידרשו התאמות עבור תתי-סוגים עצביים שונים או מודלים של מחלות.
- טיפול זהיר בתאים הוא קריטי כדי להבטיח זיהוי של נוירונים בודדים ולהפחית התקבצויות (clustering).
