כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות קוצים דנדריטיים מנוירונים פרליים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם ולכמת אותם בתלת מימד. זה מושג על ידי טיפול ראשון בהחלקות כיסוי בשש צלחות באר עם פוליאוריטן ולמינין לתרבית תאי גזע עצביים. לאחר מכן תאי גזע עצביים מדוללים בתרבית.

מדיום מצופה, באמצעות תנועת פיפטה מסתובבת עדינה ומותר להם להבדיל עד 70 יום בתרבית. על ידי חידוש המדיום באופן קבוע, התאים מתמרים עם GFP lentivirus צבוע בנוגדנים נגד GFP ומומחשים. לבסוף, התרביות מקובעות והקוצים הדנדריטיים מצולמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

בסופו של דבר, נתוני התמונה של קוצים דנדריטיים אנושיים משוחזרים בתלת מימד לצורך סיווגם וכימותם. פרוטוקול זה מספק הליך מדורג להשגת נוירונים גלוטמטרגיים של שכבה שתיים עד ארבע של קליפת המוח האנושית. זה כרוך בשימוש בתאי גזע עצביים שמקורם בתאי גזע מושרים אנושיים שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בהתבסס על השיטה שפורסמה בעבר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של השיטות הקיימות שלנו הוא זה שמאפשר פילוח אוטומטי של DON right ו- PY בתלת מימד. זאת עם רווח ניכר של זמן על פני תוכנות קיימות, שבדרך כלל מתכוננות מניתוח דו-ממדי בלבד. הדונר והמרגל בסיווגים שימושיים מאוד וקלים לשימוש גם כן.

להכנת תרביות עצביות, הניחו את החלקות כיסוי הזכוכית לשש תבניות תרבית באר והוסיפו פולי אורניתין אינקובאט למשך הלילה מתחת למכסה המנוע למחרת. השתמש ב-DPBS כדי לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים ולהוסיף דגירה של למינין מתחת למכסה המנוע למשך 10 שעות לפחות. הכן מדיום תרבות המכיל את המרכיבים הבאים.

לאחר מכן השתמש במדיום כדי לשגר תאי גזע עצביים או NSCS בצפיפות של 50,000 תאים לסנטימטר רבוע בתנועות סיבוב איטיות על מנת להפחית את אשכולות התאים כדי להמיר נוירונים אנושיים שמקורם ב-IPSC. בכל שלב של התבגרות, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי המכילה 40 ננוגרם של וקטור GFP lentiviral לכל תרבית המכילה מצע תרבית טרי, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. כדי להכין תאים לאימונופלואורסצנטיות, הסר את מדיום התרבות והשתמש בפורמלדהיד 4% כדי לתקן את התאים המומרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש ב-XPBS אחד כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן, טבלו את תלושי הכיסוי ב-PBS בתוספת סרום סוס 0.05% Triton X 110% ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים.

הוסף נוגדן ראשוני GFP 1000 ב-100 מיקרוליטר של סרום PBS 4% סוס לכל החלקת כיסוי. דגירה בקופסה חשוכה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כעת יש לדלל את הנוגדן המצומד Alexa Fluor 4 88 מ-1 ל-200 ב-PBS 0.5% עד 20, ולדגור על התאים עם תמיסת הנוגדנים בטמפרטורת החדר למשך שעה לאחר השימוש ב-PBS כדי לשטוף את השקופיות שלוש פעמים.

השתמש במדיום הרכבה כדי להרכיב את השקופיות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, בחר לפחות 10 נוירונים בריאים לכל מצב עם מורפולוגיה פרמטאלית וארבוריזציה דנדריטית מתקפלת כדי לכמת 60 עד 100 מיקרומטר לדנדריט. רכוש תמונות עם אובייקט שמן של 40 x na, 1.3 ולייזר של 488 ננומטר עם הספק שיא טיפוסי ברמת הדגימה סביב 20 מיקרו וואט, הגדר את גודל הפיקסלים סביב 80 ננומטר לקוצים דנדריטיים שנדגמו כהלכה.

כדי לדגום את כל נפח הנוירונים, רכשו ערימת Z עם מרווח Z בין 150 ל-300 ננומטר, והניבו 20 עד 30 פרוסות Z לביצוע כימות תלת מימדי של קוצים דנדריטיים. השתמש בהגדרות הבאות עבור תוכנת הניתוח לעיבוד מקדים. השתמש בסינון גאוס על-ידי בחירה במסנן גאוס החלקת עיבוד תמונה.

הגדר את רוחב המסנן שווה לגודל הפיקסלים במישור XY כדי לבצע מעקב חצי אוטומטי אחר דנדריטים ממודול מעקב החוטים. בכרטיסיית הפרוסה, השתמש בכלי המרחק כדי להעריך את קוטר הדנדריט. לאחר מכן בכרטיסייה העולה עליה, לחץ על כלי החוטים ובחר דלג על יצירה אוטומטית לחוסן טוב יותר בכרטיסיית הציור.

כעת מוצג בחר נתיב אוטומטי כשיטה, דנדריט כסוג, והזן את קוטר הדנדריטים המשוער. באמצעות מצב הבחירה של המצביע, הפוך את הסמן לתיבה ובחר shift ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על נקודת ההתחלה של הדנדריט. התוכנה תבצע חישובים ראשוניים.

כעת הזיזו את המצביע לאורך הדנדריט מנקודת ההתחלה. מוצג קו צהוב המייצג את נתיב הדנדריטים הסביר ביותר. לחץ על Shift ושמאלה.

לחץ על נקודת הקצה של הדנדריט כדי לבצע פילוח אוטומטי של עמוד השדרה בממשק המודול. לחץ על לשונית היצירה ברשימת השחרור של הבנייה מחדש. בחר בנה מחדש את קוטר הדנדריט וסמן את התיבה שמור נתונים.

לאחר מכן לחץ על בנה מחדש. הגדר את הסף כך שהנפח המפולח יתאים לנפח הדנדריטים בפועל. כאלגוריתם, בחר את המרחק הקצר ביותר ממפת המרחק.

לאחר מכן לחץ על הלחצן הבא מתחת לכרטיסיית הפרוסה, קבע את השדרה הקטנה ביותר, את קוטר הראש ואת האורך המרבי. לאחר מכן, תחת לשונית העלייה, הזן את ערכי הפרמטרים סביב 200 עד 300 ננומטר לקוטר מינימלי וארבעה מיקרומטר לאורך מקסימלי הם נקודות התחלה טובות מבלי לסמן את התיבה אפשר קוצים, לחץ על הכפתור הבא. לאחר מכן, התאם את סף נקודות הזרע כך שהנקודות הכחולות המייצגות קוצים ממוקמות בראשי עמוד השדרה בפועל.

לאחר מכן לחץ על הבא. חישוב הליבה יבוצע כעת ויכול לקחת זמן לסווג את עמודי השדרה תחת הכרטיסייה כלים של ממשק המודול, לחץ על סיווג עמוד השדרה. לאחר אימות שישנן ארבע מחלקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ממשק המודול יפיק ארבעה אובייקטי נימה חדשים עם תוצאות הסיווג.

לבסוף, ייצא את הנתונים הסטטיסטיים בכרטיסייה סטטיסטיקה על ידי לחיצה על ייצוא כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ. איור זה ממחיש את התרבות של נוירונים אנושיים המסומנים כנוגדנים נגד בטא שלושה טובולין. הנטייה לאשכול תאים ניכרת גם כאן.

מוצג כאן נוירון פרמטאלי שכותרתו GFP 40 יום לאחר התמיינות מאב קדמון מאוחר בקליפת המוח. משכבות קליפת המוח השטחיות. הכניסה מציגה הגדלה נמוכה יותר עם גוף התא הנראה.

לוחות אלה מייצגים שחזור תלת מימדי של מקטעים של קוצים דנדריטיים בשלבי התבגרות שונים. הניתוח הכמותי של צפיפות עמוד השדרה ונפח ראש עמוד השדרה מוצג כאן. כצפוי, שני הפרמטרים הללו גדלים במהלך תקופת הגידול.

בעת ניסיון בהליך התרבית, חשוב לצלחת ולשלוח בזהירות רבה את תאי הגזע העצביים על ידי הוספת תאים לאט עם תנועה סיבובית עדינה על מנת להפחית את כולין התאים. ואכן, שיטה זו דורשת זיהוי של נוירונים בודדים.