הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

המטרה הכללית של טכניקת ההדמיה והניתוח זו היא לבודד מידע ספציפי מתוך אות מורכב. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד להדמיות ולכמת מיטוכונדריה ספציפיות לעצבים לעומת מיטוכונדריה אחרות בתוך האפידרמיס. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירולוגיה, כגון כיצד מיטוכונדריה בתוך סיבי עצבים תוך-אפידרמליים של אנשים בריאים משתווה למיטוכונדריה ספציפיות לעצבים של מטופלים עם סיבוכים נוירולוגיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לקחת אות מורכב ולהפיק ממנו מידע ספציפי. פרוטוקול זה מסייע לנו לבודד אות ספציפי, כגון האות בקשיות אלו, מהאותות שסביבו. הכין את הדגימות לצביעת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית של ביופסיות עור על ידי סימון פלטת 96 בארות בהתאם לסכימה זו.

לאחר מכן, טפטפו 150 µL של תמיסת stock signal enhancer לכל באער בשורה העליונה, כדי להפחית קישור לא ספציפי של נוגדנים משניים. הכינו באערים לשטיפה על ידי הוספה של 150 µL של 1x phosphate buffered saline לכל באער בשורות שתיים ושלוש של פלטת 96 הבאערים. לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של תמיסת חסימה 5%BSA לבאערים בשורה ארבע.

דללו את הנוגדנים הראשוניים PGP9.5 ו-PDH ב-1,500 µL של תמיסת שטיפה המכילה 1% BSA והוסיפו 150 µL לכל באר בשורה חמש. השתמשו בלולאת הזרקה כדי להעביר את החתכים אל תמיסת מגבירה האות בשורה אחת. לאחר שהחתכים נמצאים בתמיסת הנוגדן הראשוני בשורה חמש, עטפו את הפלטה היטב בניילון נצמד למעבדה כדי למנוע התאיידות, ולאחר מכן ערבבו את הדגימות על רוקר שטוח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

דגרו עם נעיradians למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. התחילו את היום השני של הפרוטוקול על ידי העברת 150 µL של תמיסת שטיפה 1%BSA לבארים בשורות שש, שבע ושמונה של פלטת ה-96 בארות. הוסיפו את הנוגדנים המשניים המשורשרים לפלואורופור ל-1,500 µL של 1%BSA.

לאחר מכן, טפטפו 150 µL של תמיסת הנוגדן המשני לתוך כל באער בשורה תשע. שטפו את החתכים על ידי העברתם דרך באערים שש, שבע ושמונה. ברגע שהחתכים נמצאים בתמיסת הנוגדן המשני בשורה תשע, עטפו את הפלטה ב-parafilm וכסו בנייר אלומיניום כדי להגן על אותות הפלואורסצנציה.

דגרו תוך כדי נדנוד כפי שבוצע קודם לכן. ביום השלישי, העבירו בפיפט 150 µL של 1x PBS מסונן וסטרילי לשורות 10, 11 ו-12. העבירו את הדגימות לשורה 10 ולאחר מכן כסו את הפלטה בנייר אלומיניום.

שטוף למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד. לאחר מכן, הכן זכוכית למקרוסקופ להרכבת החתכים על ידי טפטוף של 50 µL של 1x PBS מסונן על גבי הזכוכית. עם סיום השטיפות, העבר חתך משורה 12 אל הזכוכית, ולאחר מכן הוסף טיפה אחת עד שתיים של ריאגנט הרכבה המכיל DAPI ישירות מעל החתך.

הנח בעדינות זכוכית כיסוי למסמיק במידה של 50 מילימטר על 24 מילימטר ועובי 1.5 מעל לחתך. השאר את הפלתיות בחושך למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למצע ההדבקה להתייבש לפני אחסון הפלתיות או ביצוע הדמיה. בחר בעדשה שמןית 40X במיקרוסקופ קונפוקלי עם סורק לייזר הפוך.

בחרו את הלייזרים והגלאים המתאימים כדי לדמיין את הגרעינים, סיבי העצב והמיטוכונדריה. הזינו את פרמטרי הסריקה הבאים לתוכנת המיקרוסקופ: רזולוציית עוצמה של 12-bit, קצב סריקה של 500 Hertz עם ממוצע של שתי פריימים, וזום של 2.2. הגדירו את תוכנת המיקרוסקופ לרזולוציה לטראלית אופטימלית על ידי בחירת רזולוציית סריקה של 1024 על 1024.

יש לבצע אופטימיזציה לרזולוציה האקסיאלית ולחיתוך האופטי (optical sectioning) על ידי בחירת מפתח קונפוקאלי של יחידה אחת של אוויר (one air unit) עם גודל צעד Z של 210 nanometers. סרקו כל אות בנפרד והתאימו את מתח הגילוי (detector voltage) ואת ההיסט (offset) כדי להסיר פיקסלים בעלי רוויה גבוהה או נמוכה מדי. הפעילו סריקה חיה (live scan) עבור אות העצב והתאימו את בקרת מיקוד ה-Z כדי למצוא ולהגדיר בתוכנת המיקרוסקופ את מישורי המיקוד העליון והתחתון המכילים את אות העצב בתוך חיתוך הרקמה.

סרוק את סדרת ה-Z הסופית באמצעות סריקה רצפית (sequential scanning) כדי למנוע crosstalk של אות הפלואורסצנציה. בודד את האפידרמיס מהשכבה הקרנית (stratum corneum) ומהדרמיס על ידי סימון אזור סביב האפידרמיס באמצעות כלי בחירה על עותק של התמונה המקורית. לאחר מכן, גזור את התמונה לפי הבחירה.

חשבו את פונקציות התפזורה של הנקודה (point spread functions) עבור אותות הקונפוקליות של הפלואורסצנציה הירוקה והאדומה באמצעות תכונת חישוב פונקציית התפזורה. לאחר מכן, הגדירו את הפרמטרים עבור מקדם שבירה של שמן ב-1.515 ואת הממספר האופטי (numerical aperture) עבור עדשת שמן 40X ב-1.25. הגדירו את חור הפינולה (pinhole) של הגלאי על יחידת אוויר אחת ובחרו את אורך גל העירור של הלייזר.

השתמש בשחזור איטרטיבי (iterative restoration) המוגדר ל-100% confidence, הגבלה של 10 מחזורים (cycles) לאיטרציות, וב-PSFs הירוקים והאדומים עבור דקונבולוציה (deconvolution) של אותות הפלואורסצנציה הירוקים והאדומים. השתמש בכלי create surface כדי ליצור משטח סביב אותות העצב שעברו דקונבולוציה, כאשר נבחר uncheck smooth feature, absolute intensity עבור סף הסינון (thresholding), סף תחתון של 3,000 וסף עליון של 65,535. שמור על משטחים הגדולים מ-10 voxels.

הסר את המשטחים שאינם עצבים באמצעות לשונית העריכה ב-nerve surface כדי לבחור משטחים בודדים שאינם עצבים, או לחץ ללא הפסקה על מקש ה-Control כדי לבחור מספר משטחים שאינם עצבים. מחק את המשטחים שנבחרו שאינם עצבים על ידי לחיצה על כפתור ה-Delete. השתמש בלשונית העריכה ב-nerve surface ולחץ על כפתור mask all במאפייני המסכה (mask properties).

בחלון החדש, בחר בערוץ חמש mitochondria deconvolved תחת בחירת הערוץ, ולאחר מכן סמן duplicate channel לפני החלת המסכה. לחץ על כפתור הבחירה עבור constant inside/outside, סמן set voxels outside surface ל-0.0 ולחץ על כפתור ה-OK. לבסוף, צור משטחים ספציפיים למיטוכונדריה באמצעות כלי ה-create surface כדי ליצור משטח סביב אותות המיטוכונדריה ה-deconvolved המסוכים, על ידי בחירה ב-uncheck smooth feature ושימוש ב-background subtraction לצורך סף (thresholding).

הגדירו את קוטר הכדור הגדול ביותר ל-1.50 micrometers, את הסף התחתון ל-2,000 ואת הסף העליון למקסימום של 65,535. ודאו כי המשטחים נשארים מעל 1.0 voxels. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית מייצגת זו ממחישה את אות הפלואורסצנציה הירוקה הספציפית לעצב.

משטח תלת-ממדי המוצג בצבע ציאן נוצר עבור אות העצב. לאחר מכן, אות המיטוכונדריה הספציפי לעצב מבודל משאר אותות המיטוכונדריה האפידרמליים על ידי שימוש במשטח העצב ככלי מיסוך. אות הפלואורסצנציה האדומה של המיטוכונדריה הספציפי לעצב שנוצר משמש ליצירת משטחים המוצגים בצבע מגנטה סביב המיטוכונדריה בתוך משטח העצב המוצג בצבע ציאן.

דבר זה מאפשר לראות את המיטוכונדריה בסיבי העצב בפירוט. כאן, נתונים על פני השטח של המיטוכונדריה מוצגים כהיסטוגרמת תדירות גדלים כדי להמחיש את אחוז המיטוכונדריה שנמצאות בכל אחד מהקיפולים השונים בהתאם לנפחן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על הטיפול ברקמה במהלך תהליך הצביעה כדי להבטיח שהרקמה שקועה לחלוטין בתמיסות, ובכך להבטיח צביעה אחידה ועקבית לאורך כל החתכים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדגים כמותית וויזואלית מיטוכונדריה בתוך סיבים עצביים תוך-אפידרמליים אנושיים. הפרוטוקול המפורט שלנו תוכנן כדי ללמד חוקרים אחרים כיצד לצבוע, לדגיין, לעבד ולנתח ביופסיות של עור אנושי, במטרה להבין את המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות מבוססות מיטוכונדריה, כגון נוירופתיה.