הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

המטרה הכוללת של טכניקת הדמיה וניתוח זו היא לבודד מידע ספציפי מאות מורכב. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד לדמיין ולכמת מיטוכונדריה ספציפית לעצב עם מיטוכונדריה אחרת בתוך האפידרמיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירולוגיה כגון כיצד המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים של אנשים בריאים משתווה למיטוכונדריה ספציפית לעצב של חולים עם סיבוכים נוירולוגיים.

היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שאנו לוקחים אות מורכב ומוציאים ממנו מידע ספציפי. הפרוטוקול הזה מסייע לנו לבודד אות ספציפי כמו האות בקשיות האלה מהאותות שסביבם. התכוננו לצביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית של ביופסיות עור על ידי תיוג תחילה של צלחת של 96 בארות על פי סכימה זו.

לאחר מכן פיפטה 150 מיקרוליטר של תמיסת משפר אות מלאי כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים משניים לכל באר בשורה העליונה. הכן בארות שטיפה על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט 1x לכל באר בשורות שתיים ושלוש של צלחת 96 הבארות. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת חסימת BSA של 5% לבארות של שורה ארבע.

יש לדלל את הנוגדנים העיקריים PGP9.5 ו-PDH ב-1,500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה של 1% BSA ולהוסיף 150 מיקרוליטר לכל באר בשורה החמישית. השתמש בלולאת חיסון כדי להעביר את החלקים לתמיסת משפר האות בשורה הראשונה. לאחר שהחלקים נמצאים בתמיסת הנוגדנים העיקרית בשורה החמישית, עטפו את הצלחת היטב בסרט מעבדה כדי למנוע אידוי ולאחר מכן ערבבו את הדגימות על נדנדה שטוחה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

דגירה עם נדנדה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. התחל את היום השני של ההליך על ידי פיפטינג של 150 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה של 1% BSA לבארות בשורות שש, שבע ושמונה של צלחת 96 הבארות. הוסף את הנוגדנים המשניים המצומדים פלואורופור ל-1,500 מיקרוליטר של 1% BSA.

לאחר מכן פיפטה 150 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית לכל באר בשורה תשע. שטפו את החלקים על ידי מעבר דרך בארות שש, שבע ושמונה. לאחר שהחלקים נמצאים בתמיסת הנוגדנים המשנית בשורה תשיעית, עטפו את הצלחת בפרפילם וכסו בנייר אלומיניום כדי להגן על אותות הקרינה.

דגירה עם נדנדה כמו קודם. ביום השלישי, פיפטה 150 מיקרוליטר של PBS סטרילי מסוננת 1x לשורות 10, 11 ו-12. מעבירים את הדגימות לשורה 10 ואז מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום.

שוטפים שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה. לאחר מכן, הכינו שקופית מיקרוסקופ להרכבת החלקים על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של PBS 1x מסונן על המגלשה. לאחר השלמת השטיפות, העבירו קטע משורה 12 אל המגלשה ולאחר מכן הוסיפו טיפה אחת עד שתיים של מגיב הרכבה המכיל DAPI ישירות על גבי הקטע.

הנח בעדינות כיסוי זכוכית בגודל 50 מילימטר על 24 מילימטר 1.5 מיקרוסקופ מעל הקטע. הנח את השקופיות בחושך למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי לרפא את אמצעי ההרכבה לפני אחסון או הדמיה של השקופיות. בחר את מטרת טבילת השמן פי 40 במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר הפוכה.

בחר את הלייזרים והגלאים המתאימים כדי לדמות את הגרעינים, סיבי העצב והמיטוכונדריה. הזן את פרמטרי הסריקה הבאים לתוכנת המיקרוסקופ, רזולוציית עוצמה של 12 סיביות, קצב סריקה של 500 הרץ עם ממוצע של שתי פריימים וזום של 2.2. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לרזולוציה רוחבית אופטימלית על ידי בחירת רזולוציית סריקה של 1024 על 1024.

מטב את הרזולוציה הצירית והחיתוך האופטי על ידי בחירת צמצם קונפוקלי של יחידת אוויר אחת בגודל צעד Z של 210 ננומטר. סרוק כל אות בנפרד והתאם את מתח הגלאי והיסט כדי להסיר פיקסלים רוויים מעל ומתחת. הפעל סריקה חיה של האות העצבי והתאם את בקרת המיקוד Z כדי למצוא ולהגדיר את מישורי המוקד העליונים והתחתונים בתוכנת המיקרוסקופ המקיפים את האות העצבי בתוך קטע הרקמה.

סרוק את סדרת Z הסופית עם סריקה רציפה כדי למנוע ערב-דיבור של אות פלואורסצנטי. בודדו את האפידרמיס משכבת הקרנית והדרמיס על ידי ציור אזור סביב האפידרמיס באמצעות כלי בחירה על תמונה משוכפלת של התמונה המקורית. לאחר מכן חתכו את התמונה לבחירה.

חשב פונקציות התפשטות נקודתיות עבור האותות הקונפוקליים הקרינה הירוקה והאדומה באמצעות תכונת חישוב פונקציית ההתפשטות. לאחר מכן הגדר את הפרמטרים עבור מקדם שבירה בינוני לנפט ב-1.515 ואת הצמצם המספרי עבור יעד נפט 40X ב-1.25. הגדר את חור הגלאי ביחידת אוויר אחת ובחר אורך גל עירור לייזר.

השתמש בשחזור איטרטיבי המוגדר לביטחון של 100%, מגבלת איטרציה של 10 מחזורים, וה-PSFs הירוקים והאדומים להפחתת העוויתות של אותות הקרינה הירוקים והאדומים. השתמש בכלי יצירת משטח כדי ליצור משטח סביב אותות העצבים המפותלים תוך בחירת תכונה חלקה ללא סימון, עוצמה מוחלטת לסף, סף תחתון של 3,000 וסף עליון של 65,535. שמור על המשטחים מעל 10 ווקסלים.

הסר את המשטחים שאינם עצביים באמצעות לשונית העריכה במשטח העצב כדי לבחור משטחים בודדים שאינם עצבים או החזק את מקש Control לחוץ כדי לבחור משטחים מרובים שאינם עצבים. מחק את המשטחים שאינם עצבים שנבחרו על-ידי לחיצה על לחצן מחק. השתמשו בכרטיסיית העריכה במשטח העצב ולחצו על הלחצן 'מסיכה הכל' במאפייני המסיכה.

בחלון החדש, בחר ערוץ חמש מיטוכונדריה מפורק תחת בחירת הערוץ ולאחר מכן בדוק ערוץ כפול לפני החלת המסכה. לחץ על לחצן הבחירה עבור קבוע מבפנים/חוץ ובדוק את המשטח החיצוני של הווקסלים שהוגדרו ל-0.0 ולחץ על כפתור אישור. לבסוף, צור משטחים ספציפיים למיטוכונדריה באמצעות כלי יצירת משטח כדי ליצור משטח סביב האותות המיטוכונדריאלים המפותלים על ידי בחירה בתכונה חלקה ללא סימון ושימוש בחיסור רקע לסף.

הגדר את קוטר הכדור הגדול ביותר ל-1.50 מיקרומטר, את הסף התחתון ל-2,000 ואת הסף העליון למקסימום 65,535. הקפד לשמור על המשטחים מעל 1.0 ווקסלים. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית מייצגת זו ממחישה את אות הקרינה הירוקה הספציפית לעצב.

משטח תלת-ממדי המוצג בציאן נוצר עבור האות העצבי. לאחר מכן האות המיטוכונדריאלי הספציפי לעצב מבודד משאר האותות המיטוכונדריאלים האפידרמיסיים על ידי שימוש במשטח העצב ככלי מיסוך. אות הקרינה האדום המיטוכונדריאלי הספציפי לעצב שנוצר משמש ליצירת משטחים המוצגים כמג'נטה סביב המיטוכונדריה בתוך משטח העצב המוצג בציאן.

זה מאפשר לראות את המיטוכונדריה בסיבי העצב בפירוט. כאן, נתוני פני השטח המיטוכונדריאלי מוצגים כהיסטוגרמה של תדר גודל כדי לדמיין את אחוז המיטוכונדריה הקיימים בכל אחת מהכיפופים השונים בהתאם לנפחם. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לטפל ברקמה במהלך תהליך הצביעה כדי להבטיח שהרקמה שקועה במלואה בתמיסות כדי לספק צביעה אחידה ועקבית בכל החלקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין ולכמת מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמליים אנושיים. הפרוטוקול המפורט שלנו נועד ללמד חוקרים אחרים כיצד לצבוע, לדמיין, לעבד ולנתח ביופסיות עור אנושיות במטרה להבין את המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות מבוססות מיטוכונדריה כגון נוירופתיה.