שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאתר ולעקוב אחר הנדידה, ההתרחבות וההישרדות של תאי גזע ותאי אב באפיתל הקרנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי האפיתל של הקרנית הנוגעות להומאוסטזיס, תיקון רקמות, הזדקנות ופתולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה להקמה והיא מאפשרת מעקב שושלת לא פולשני של תאים בצורה משובטת.

כדי להתחיל, בחר תחילה זן עכבר טרנסגני של Cree עם מקדם ספציפי לרקמה הניתנת להשראה כדי לתייג את תאי האב האפיתל הלימבליים והקרניים ותאי הגזע. נעשה שימוש בקו Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. לאחר מכן, בחר את קלטת הקשת המתאימה בהתאם לשאלת המחקר ולקו הקרי הזמין.

במקרה זה, נעשה שימוש בקו Brainbow 2.1. חצו את זן הקונפטי ההומוזיגוטי R 26 R עם הזן ההומוזיגוטי K 14 Cree ERT כדי ליצור עכברים עם ארבעה תאים חיוביים בצבע K 14 כדי לגרום לרקומבינציה בעכברים הטרנסגניים. ראשית שוקלים 80 מיליגרם טמוקסיפן וממיסים אותו במיליליטר אחד של שמן תירס על ידי וורקסינג.

מניחים את התמיסה באמבט מים רועדים, נשמר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה, ומשאירים אותה באמבטיה עד להרדמה הבאה. עכבר הטרוזיגוט Brainbow 2.1 Cree ERT בן שמונה שבועות, ובדוק את עומק ההרדמה עם צביטת הבוהן יש למרוח בזהירות 100 מיקרוליטר של תמיסת הטמוקסיפן על כל משטח עיניים של העכבר. יישום ישיר של טמוקסיפן מניב יעילות גבוהה של אינדוקציה של Cree אחסן כל תמיסת טמוקסיפן שנותרה מוגנת מפני האור בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

יש לחמם את התמיסה לפני היישום, שחוזר על עצמו במשך שלושה ימים רצופים עבור כל עכבר. ראשית ממיסים גרם אחד של אבקת טמוקסיפן בחמישה מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד סטרילי. כדי לייצר תמיסה של 200 מיליגרם למיליליטר, הניחו את התמיסה באמבט מים רועדים, שמרו על 65 מעלות צלזיוס עד שהיא מתבהרת והשאירו אותה באמבטיה עד לשימוש.

לאחר מכן יש להרדים את העכבר ולבדוק את עומק ההרדמה באמצעות צביטה בבוהן, למרוח משחת עיניים על העין הלא מטופלת של העכבר כדי להגן עליה מפני התייבשות במהלך ההליך ולתת משככי כאבים נאותים. לאחר מכן, יש לשאוב 200 מיקרוליטר מתמיסת הטמוקסיפן למזרק ללא כל מחט מחוברת, ולמרוח אותו באופן מקומי על כל קרנית העין. הנוזל מתמצק על הרקמה בטמפרטורת החדר.

טפל בעכבר עד שהוא שומר על שכיבה חזה והחזיר אותו לחברת אחרים רק כשהוא בהכרה מלאה. לאחר הקרבת עכברים בנקודות זמן מתאימות לאחר הזירוז, פציעה בעין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. גרעין את העין על ידי לחיצה ראשונה על העפעף כדי להוציא את גלגל העין מהשקע.

החלק מלקחיים מעוקלים מאחורי גלגל העין כדי להחזיק את עצב הראייה ומשוך את גלגל העין כלפי מעלה כדי לנתק אותו. מניחים כל גלגל עין בכלי 60 מילימטר המכיל PBS. הנח את הצלחת המכילה את העין מתחת למיקרוסקופ סטריאו כירורגי.

ודא שאתה מזהה את המבנה הבסיסי של העין, הקרנית, הלימבוס ועצב הראייה. הסר את עצב הראייה, השריר ורקמת החיבור סביב העין. החזיקו את העין בחלק האחורי כשהקרנית פונה כלפי מטה, ובצעו חתך בסקלרה בחלק האחורי של גלגל העין בעזרת מספריים קפיציים.

הגדל את החתך כדי לאפשר לעדשה לצוץ החוצה ולהסיר את הקשתית בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, בצע ארבעה עד חמישה חתכים רדיאליים על ידי חיתוך מהמרכז לכיוון הפריפריה כדי לשטח את הקרנית ולאחר מכן הסר את כל החלקים הנותרים של הקשתית בעזרת מרית שטוחה דקה. לבסוף, חותכים את הרקמה ההיקפית העודפת המקיפה את הלימבוס כדי לתקן את הקרנית.

מעבירים את הרקמה המנותחת לכלי של 12 בארות ומדגרים אותה ב-4%para של פורמלדהיד למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו לזמן קצר את הרקמה ב-PBS כדי להכתים את גרעיני התא. דגרו את הקרנית בשני מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת DPI למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה קצרה ב-PBS.

לאחר מכן, הניחו את הקרנית על מגלשת זכוכית כשצד האפיתל פונה כלפי מעלה. לאחר מכן הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על גבי הקרנית וכסו אותה בתלושי כיסוי. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בארבע מעלות צלזיוס.

להדמיית קרנית, השתמש במערכת קונפוקלית ספקטרלית המאפשרת הפרדה של פליטות R-F-P-Y-F-P-G-F-P ו-CFP. ראשית הגדר את אורכי גל הקרינה, העירור והפליטה בהתאם לחלבונים הפלואורסצנטיים של המוח. קלטת Bo, הדואגת למנוע עירור צולב או חפיפה של אותות פליטה.

לאחר מכן, רכשו תמונות אריחים כדי לדמיין את כל הקרנית ברזולוציה גבוהה. כאן, השג מערך של תמונות 12 על 12 בכל ארבעת ערוצי הפלורסנט. לבסוף, מזג את התמונות ליצירת שושלת מורכבת.

ניסויי מעקב באמצעות עכברי קונפטי R 26 R בוצעו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי אב אפיתל לימבליים וקרנית. בתנאי מצב יציב, אשכולות קטנים של תאים פלואורסצנטיים נצפו 10 ימים לאחר האינדוקציה כצפוי. לאחר ארבעה חודשים התפתחו פסים מהלימבוס למרכז הקרנית המרמזים על כך שתאים נודדים מהלימבוס כדי לחדש את הקרנית לאחר פגיעה בקרנית.

נדידת המסור מהלימבוס התרחשה במהירות עם פסים לימבליים ארוכים ועבים שהתפתחו תוך שבעה ימים. מודל זה הוא בעל ערך למעקב ומחקר של תאי גזע ואב בקרנית בנסיבות שונות. זה יאפשר לחקור את התרחבות התאים המשובטים, הישרדות ונדידה במצב יציב ובתנאי לחץ כמו פציעה, מוטציה של כוויה כימית ועוד בעתיד.

מודל זה עשוי לשמש גם כדי לנתח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות קרנית נורמלית ופתולוגית. טכניקה זו עשויה לתרום להבנתנו מצבים פתולוגיים שונים כגון ניוון קרנית, כוויות וטראומה בקרנית, ובנוסף להערכת ההשפעה של טיפולים שונים על התחדשות הקרנית, הרחבת תאים ונדידה.