זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

הנח רקמת רשתית שבודדה מעכבר טרנסגני עם תאי גנגליון רשתית עם תווית פלואורסצנטית, או RGCs, בתא הקלטה.

מידע חזותי מועבר ל-RGCs, שהאקסונים שלהם מעבירים אותו למוח דרך עצב הראייה.

תת-סוגים של RGC נבדלים על ידי דפוסי ההסתעפות של הדנדריטים שלהם, אשר מרובדים לשכבות משנה בתוך שכבת הרשתית הפנימית.

משטחים את רקמת הרשתית ומאבטחים אותה באמצעות עוגן רקמות.

מעבירים את התא לשלב מיקרוסקופ ומחדירים תמיסה מחומצנת כדי לשמור על כדאיות RGC.

באמצעות תאורת אינפרא אדום, זהה את ה-RGCs הפלואורסצנטיים.

מקם פיפטה המכילה עוקב פלואורסצנטי על RGC.

הפעל לחץ חיובי כדי למנוע סתימה.

עבור ללחץ שלילי, משוך את הממברנה לתוך הפיפטה ליצירת איטום.

הפעל יניקה כדי לקרוע את הממברנה, וליצור תצורת תא שלם המאפשרת דיפוזיה של עוקבים לתוך הדנדריטים.

התבונן במורפולוגיה ובריבוד הדנדריטי כדי לזהות את תת-הסוגים של RGC.

שטפו את הרשתית בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת והעבירו אותה לתא הקלטה בתחתית זכוכית עם פיפטת העברה מפלסטיק. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לשטח בזהירות את הרקמה כששכבת קולטני האור פונה כלפי מטה. הסר עודפי נוזלים באמצעות פיפטה. ולעגן את הרקמה באמצעות טבעת פלטינה עם רשת ניילון. לאחר מכן מלאו את החדר בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת והרכיבו אותו על במת מיקרוסקופ. חדרו את הרקמה בתמיסה החוץ-תאית המחומצנת במהירות של 2 עד 4 מיליליטר לדקה.

כדי להתכונן להליך זה, משוך כמה מיקרו פיפטות זכוכית להקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מושך מיקרו-פיפטה. התבונן בשכבת תאי הגנגליון באמצעות אופטיקה IR-DIC. לאחר מכן זהה את תאי ה-GFP בתוספת גנגליון באמצעות אפיפלואורסצנציה בכ-480 ננומטר. לאחר מכן, אתר את הפיפטה המלאה בתמיסה תוך-תאית ב-DIC. הפעל לחץ חיובי קל ואפס כל קיזוזי מתח על המגבר.

לאחר מכן, הורד את המיקרו-פיפטה מזכוכית על תא חיובי ל-GFP והחל שלבי פקודת מתח בדיקה כדי לנטר את התנגדות האיטום. הלחץ השלילי צריך ליצור חותם ג'יגה אוהם בין הפיפטה לקרום התא. לאחר יצירת אטימה יציבה, קרע את הממברנה על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי להשיג גישה לתא שלם. המתן דקה עד שתיים עד שהדנדריטים של התא יתמלאו בעוקב פלואורסצנטי.