בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור רקמות לב מהונדסות אנושיות בעלות הרכב תאים מוגדר. שיטה זו יכולה להתמודד עם אתגרים מרכזיים בתחום הנדסת רקמות הלב, כולל בקרה על שונות ויעילות התמיינות לב והבנה כיצד סוגי תאים ספציפיים משפיעים על תפקוד התכווצות הלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתוצאה הסופית היא רקמת לב מהונדסת אנושית בהרכב מבוקר ומוגדר.

שכפולים של טכניקה זו מתרחבים לטיפול במחלות לב מכיוון שרקמות מוגדרות יכולות לספק פלטפורמת סינון חדשה, רלוונטית ביולוגית וביו-רפואית המסוגלת להעריך התערבויות טיפוליות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טיפולי לב חדשים, ניתן להשתמש במערכת רקמת הלב המהונדסת אנושית גם להבנת מנגנונים של טיפול בתאי לב. החל מתרביות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 0.04% טריפסין-EDTA.

דגרו על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. כאשר התאים דוגרים, הוסף 12 מיקרוליטר של מעכב ROCK לשישה מיליליטר של תמיסת נטרול טריפסין. מוציאים את הצלחות מהחממה ומוסיפים מיליליטר אחד מתמיסת הנטרול לכל באר בצלחת שש הבארות.

העבירו את כל התאים מכל באר לצינור צנטריפוגה יחיד של 15 מיליליטר. שטפו את כל שש הבארות בנפח אחד של שלושה מיליליטר של PBS ושלבו את השטיפה הזו עם התאים בצינור. צנטריפוגה את הצינור ב-300 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים.

כדי להכין את התאים למיון תאים חיים על ידי FACS, הכינו את מאגר הצביעה על ידי הוספת חמישה מיליליטר FBS ו-50 מיקרוליטר מעכב ROCK ל-45 מיליליטר PBS על קרח. הסר את הסופרנטנט מהתאים הגלולים והשהה אותם מחדש ב-1.2 מיליליטר של מאגר מכתים. העבירו 200 מיקרוליטר מהתאים התלויים לצינור צנטריפוגה חדש מקורר מראש של 50 מיליליטר על קרח.

לאחר מכן, העבירו את המיליליטר הנותר של תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר מקורר מראש על קרח והוסיפו שני מיקרוליטרים של SIRP alpha-PE/Cy7 וארבעה מיקרוליטרים של נוגדנים CD90-FITC. מערבבים בעדינות את מתלה התא עם פיפטת העברה ומניחים את הצינור על קרח. דגרו את שני הצינורות של 50 מיליליטר המכילים את הבקרה השלילית ואת הדגימה על שייקר נדנדה על קרח בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

בזמן הדגירה, העבירו שלושה מיליליטר של מדיום התמיינות שניים לכל אחד משני צינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של מעכב ROCK, ואחסן את צינורות איסוף ה-FACS הללו על קרח לפני השימוש. לאחר מכן, גלולה את התאים המוכתמים ב -300 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ושטפו אותם פעמיים עם 10 מיליליטר PBS קר כקרח. השעו בעדינות את גלולת הדגימה עם מיליליטר אחד עד שלושה מיליליטר של מאגר צביעה המכיל DAPI. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מכתים ללא DAPI לגלולת הבקרה השלילית.

סנן את שני תרחיפי התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון כדי להסיר גושי תאים, ולאחר מכן העבר אותם לצינורות FACS מפוליסטירן על קרח. הביאו מיד את הדגימות לממיין התאים. החל ממדגם בקרת הצביעה השלילית, קבע את פרמטרי השער.

לאחר מכן, בעת הפעלת תאי המדגם, בחר עבור אוכלוסיית התאים החיים השליליים של DAPI. אסוף גם את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-FITC וגם את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-PE/Cy7 באופן עצמאי ב-20 PSI. לאחר תרבית וצבירה מחדש של תאים, כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט, הסר את לוחות תרבית התאים מהחממה והעביר את המדיום לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

שוטפים את הצלחות עם שלושה מיליליטר PBS ומעבירים את הכביסה לאותו צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו לצלחות שלושה מיליליטר של 0.04% טריפסין-EDTA ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר חמש דקות, בדוק את הלוחות לניתוק תאים באמצעות מיקרוסקופ.

לאחר שכל התאים התנתקו, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת נטרול טריפסין לצלחות. מערבבים בעדינות ומעבירים את התאים לצינור הצנטריפוגה המקורי של 50 מיליליטר. שוטפים את הצלחות עם חמישה מיליליטר PBS ומוסיפים את הכביסה הזו גם לצינור.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -300 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של סרום בקר יילודים, או מדיום NBS. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

גלולה את התאים ב -300 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והסר את הסופרנטנט. כדי להתחיל לייצר את שש רקמות הלב המהונדסות, יש לדלל 60.0 מיקרוליטר מתוך חמשת המיליגרם למיליליטר מלאי קולגן ל-3.125 מיליגרם למיליליטר עם 1.5 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד, 9.6 מיקרוליטר של 10X PBS ו-24.9 מיקרוליטר של מים סטריליים טהורים במיוחד. כאן, חשוב להימנע מהכנסת בועות אוויר לתערובת הקולגן מכיוון שבועות האוויר משתחררות לאט מהתמיסה הצמיגה ועלולות להפריע להיווצרות הרקמות במהלך דחיסת הרקמות.

פיפטה במורד הצינור של 15 מיליליטר כדי להוסיף 12.0 מיקרוליטר כל אחד של 10X MEM ו-0.2 ערימות רגילות ב-pH 9 כדי לדלל את תערובת הקולגן. לאחר מכן מוסיפים את מטריצת קרום המרתף לתערובת הקולגן לריכוז סופי של 0.9 מיליגרם למיליליטר ומערבבים בעדינות. אחסן את תערובת הטישו הסופית הזו על קרח.

לאחר מכן, העבירו את כל תערובת הרקמות לכדור התא והוסיפו תאים משלימים כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. מלאו את הצינור לנפח סופי של 150 מיקרוליטר במדיית NBS נטולת תאים וערבבו בעדינות. פיפטה בזהירות 25 מיקרוליטר מתרחיף התא לכל אחת משש הבארות בלוחית הבסיס של הביוריאקטור.

חזור על הליך הערבוב בין כל באר כדי להשעות מחדש את כל התאים שאולי שקעו. פיפטה רקמה אחת בלבד לכל באר בכל פעם כדי להבטיח נפח ומספר תאים עקביים לכל רקמה. בנפרד, דחוף שתי שורות של פולידימתילסילוקסן, או PDMS, דחף חיישנים משני צידי מסגרת הפוליסולפון ליצירת שישה זוגות של עמודים מנוגדים.

הפוך את המסגרת על גבי לוחית הבסיס כך שזוג עמודים אחד ייכנס לכל באר המכילה את מתלה התא. לאחר מכן מניחים את הביוריאקטור בצלחת של 60 מילימטר ומניחים את המנה ללא הכיסוי שלה בתוך צלחת של 10 סנטימטרים. הנח את המכסה על צלחת 10 סנטימטר והעביר את כל מכלול הביוריאקטור לתוך חממת תרבית הרקמות.

לאחר שעתיים של דגירה, הסר את מכלול הביוריאקטור והוסף 14 מיליליטר של מדיום NBS כדי לכסות את לוחית הבסיס. החזר את הביוריאקטור לחממת תרבית התאים והחלף מחצית מהמדיום מדי יום. לאחר 48 שעות, הסר את לוחית הבסיס בעדינות כמה מילימטרים בכל פעם.

לאחר מכן החזר את הביוריאקטור כשהרקמה פונה כלפי מטה אל המדיום. אם רקמה נופלת מעמוד בעת הסרת לוחית הבסיס, חבר מחדש בעדינות את הרקמה לעמוד. התמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים מביאה לתרבית מעורבת של בעיקר קרדיומיוציטים ופיברובלסטים המתארגנים בעצמם לאשכולות ויוצרים קורים פועמים חזקים בכל הצלחת.

מיון FACS של תרביות אלה גילה כי שיטת התמיינות זו מביאה לאוכלוסייה המכילה לפחות 65% תאי SIRP אלפא חיוביים ו-10% תאים חיוביים CD90. לאחר הסרת לוחית הבסיס, רקמות הלב המהונדסות באדם, או HECTs, מורשות להרכיב את עצמן בתוך הביוריאקטור. HECTs בוגרים ודחוסים מסיטים באופן גלוי את עמדות חישת הכוח המשולבות עם ממוצע של חמישה עד 15 מיקרו-ניוטון של כוח.

מדידות כוח עווית חושפות כיצד משתנים מבודדים משנים את כוח ההתכווצות ברקמות המהונדסות המוגדרות הללו. כאן, כאשר הרקמות מתווספות ל-10% תאי גזע מזנכימליים אנושיים, נצפה שיפור משמעותי בכוח ההתכווצות הן בתדרי הקצב של הרץ אחד והן בתדר של שני הרץ. לאחר השליטה, ההתמיינות תארך כ-20 יום, מיון התאים כחמש שעות ובניית הרקמה כשלוש שעות.

יידרשו שבעה ימים נוספים להיווצרות רקמה תקינה לאחר הבנייה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כולל תיוג תאים והשלמה של תערובת הרקמות, על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות להשפעות של אינטראקציות תא-תא ספציפיות או לקבוע את מנגנוני הטיפול התאי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור רקמות לב מהונדסות אנושיות עם הרכב תאי ידוע ומבוקר.