דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

מטרת הניסוי הבא היא ליצור רקמת שריר הלב פונקציונלית מיושרת באמצעות הדפסת מיקרו מגע. זה מושג על ידי הדפסת מיקרו מגע ראשונה פיברונקטין על מצעי פולי דימתיל סילוקסן. כצעד שני, טרנסגני כפול.

קווי תאי גזע עובריים מובחנים במבחנה ומבודדים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, המאפשר להשיג אוכלוסיות מטוהרות מאוד של אבות קרדיוגניים חזקים. לאחר מכן, אבות לבביים מבודדים נזרעים על מצעי PDMS מיקרו פטנטים כדי לגרום להם להיות זדוניים ולקבל צורת מיוציט לב דמוי מוט. מתקבלות תוצאות המראות בידוד מוצלח וצמיחה איזוטרופית של אבות לבביים על סמך עובדות וניתוח אימונופלואורסצנטי.

יצירת רקמת שריר הלב איזוטרופית יכולה לסייע להתקדם בתחומי הביולוגיה של תאי הגזע והנדסת הרקמות על ידי העלאת האפשרות לפתח חזרה של תאים ספציפיים למחלה לפיתוח וגילוי תרופות. ועל ידי הנחת היסודות לרפואה רגנרטיבית לבבית. מגן IL ראשון, 180 4 אלסטומר פולי דימתיל אלן ביחס חומר אקורינג מבוסס 10 לאחד ומערבבים היטב.

הסר את המכלול באמצעות חומר ייבוש כדי לחסל בועות אוויר. יוצקים את ה-PDMS לתוך מאסטר שיוצר בעבר עם רוחב 20 מיקרון ושני רכסי כלים מיקרוניים המופרדים על ידי מרווח של 20 מיקרון, ואז מרפאים במשך יומיים בייבוש בטמפרטורת החדר כדי לקבל חותמות PDMS במרקם מיקרו. לאחר עיבוד חותמת ה-PDMS משטחי הידרופיליים עם מנקה פלזמה.

עקר את הבולים עם 70% אתנול למשך דקה. בארון בטיחות ביולוגי יש לייבש במהירות עם אוויר דחוס. מכסים את משטחי החותמת הסטריליים בתמיסת פיברונקטין לספיגה לפחות 10 דקות לאחר הספיגה.

מנערים את תמיסת הפיברונקטין מהחותמות ומייבשים במהירות עם אוויר דחוס. צור מגע קונפורמי בין חותמת לפתקי כיסוי זכוכית מצופים PDMS שהוכנו בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט למשך שתי דקות ולחץ בחוזקה. שוטפים מצעי דפוס מיקרו במים מזוקקים.

אחסן אותם במים מזוקקים למשך שבועיים לכל היותר של ארבע מעלות צלזיוס, אלא אם כן יש להשתמש בהם באופן מיידי. מצפים שש צלחות באר עם ג'לטין סטרילי של 0.1% במים מזוקקים ונותנים לו להיספג במשך 15 דקות 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופה זו, הכינו את הפיברובלסטים העובריים של העכבר מאהור אליקוט על ידי הוספתם ל -50 מיליליטר PBS בצינור חרוטי. צנטריפוגה של המת' ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות והשעיה מחדש במדיום מת'.

לאחר שחלף זמן הדגירה, שאפו את עודפי הג'לטין והוסיפו את המס לבארות. אפשר ל-MES יום אחד להתחבר. הכן את תאי הגזע העובריים או תאי הגזע העובריים מחומר מחשבה על ידי הוספתם ל-50 מיליליטר PBS בצנטריפוגה חרוטית.

תאי ה-ES 1000 סל"ד למשך חמש דקות ו-Resus משעים אותם בתווך ESC. הוסף את תאי ה-E ES לבארות המכילות מיתוסים ושמור בתווך ESC עד שמגיעים למפגש לעיסוי תאי ES קופלואנטים. ראשית שאפו את מדיום ה- ESC ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS סטרילי.

לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר של נסיעות לבאר. דגרו את הצלחת במשך שלוש וחצי דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. פיפטה את תמיסת ה-TRIPSIN למעלה ולמטה מספר פעמים.

הראשון לפרק את מושבות התאים Ees. לאחר מכן נטרל את תמיסת הטריפסין על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מדיום ESC לבאר. עסו את תאי ה- ES לפי היחס הנדרש כאן תאי ה- E ES עוברים ביחס של אחד ל -30, מה שמאפשר להם להגיע למפגש תוך שלושה ימים.

התחל את ההתמיינות במבחנה כאשר תאי ה-ES הגיעו למפגש. ראשית מצפים כלי תרבית של 10 ס"מ עם ג'לטין סטרילי של 0.1% במים מזוקקים ונותנים להם להיספג במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. במהלך תקופה זו, קצרו את תאי ה- ES כמו קודם.

לאחר שחלפו 15 הדקות, שאפו את כל הג'לטין העודף והוסיפו כשליש עד מחצית מתרחיף תאי ה-E ES לכלים מתורבתים המכילים מדיום הסתגלות. לאחר תרבית התאים במדיום הסתגלות במשך יומיים, קצרו את תאי ה-ES המותאמים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל PBS באמצעות 1.5 מיליליטר טריפסין. צנטריפוגה אותם ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות והשעו אותם מחדש במדיום התמיינות.

הכינו גופי עובר או EBS של כ-1000 תאים לכל טיפה של 10 מיקרוליטר של מדיום התמיינות בכלי תרבית של 15 סנטימטר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הופכים את הלוחות והתרבות. EBS תולה טיפות במשך יומיים וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר יומיים וחצי, משוך את ה-EBS משישה לשמונה צלחות, 15 סנטימטר, לאחת באמצעות מדיום בידול ותרבית אותן במשך שלושה וחצי ימים נוספים. לאחר שלושה וחצי ימים נוספים, יש לאסוף את ה-EBS בצינור חרוטי של 50 מיליליטר ולשטוף את הצלחת פעם אחת עם PBS סטרילי כדי לאסוף את כל ה-EBS. לאחר מכן הניחו להם לשקוע לתחתית למשך כחמש דקות.

לאחר מכן הסר את ה- supinate ושטוף את ה- EBS עם PBS סטרילי. הניחו ל-EBS לשקוע שוב לתחתית למשך כחמש דקות. יש לנתק את ה-EBS על ידי הוספת 2.5 מיליליטר טריפסין ולנער את השפופרת בעדינות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

לאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר של PBS סטרילי לתמיסת הטריפסין ופיפטה למעלה ולמטה עם הפיפטה הסרולוגית של 10 מיליליטר בערך שמונה עד 10 פעמים כדי לפרק אשכולות תאים. נטרל את הטריפסין עם 10 מיליליטר של מאגר פקס המכיל תא ES 7.5% E או FBS בדרגת התמיינות ו-0.01% DPI בצנטריפוגת PBS, EBS מנותק ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את הסופינאט והוסף כמיליליטר אחד של פיפטת חיץ פקס למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד בערך שמונה עד 10 פעמים כדי לפרק אשכולות תאים.

העבירו את התאים לצינור תחתון עגול סטרילי עם מסננת תאים של 35 מיקרון לקבלת תרחיף תא בודד. מיין תאי ES מובחנים באמצעות ציטומטר זרימת אריה וקבל אוכלוסיות מטוהרות של אבות חדריים מחויבים. עיין בחלק הטקסט של הפרוטוקול לאסטרטגיית השער המפורטת.

אכלתי את מצעי דפוס המיקרו עם 1% אוניק F1 27 במים מזוקקים למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS סטרילי. חבר אטמי PDMS סביב אזור התבנית ולחץ בחוזקה.

לאחר מכן זרע אבות לבביים על מצעי דפוס מיקרו פיברונקטין. התמונות הבאות הן מתרשים ציטומטריית זרימה מייצג של היום השישי תאי ES מובחנים במבחנה. תמונה זו מציגה שער על משרעת פיזור קדימה FSCA ומשרעת פיזור צד SSCA.

זה מאפשר הפרדה של תאים שלמים מפסולת תאית. כאן נראה שער על FSCA ורוחב פיזור קדימה FSCW. זה מאפשר בידוד של סינגלטים של תאים מכפילים ואגרגטים תאיים אחרים.

תמונה זו מציגה שער ב-SSCA ופיזור עם SSCW. זה מגביר את טוהר הסינגלים של התאים. תמונה זו מציגה שער על צביעת FSCA ו-DPI המאפשר בידוד של תאים שליליים DPI ברי קיימא מתאים שאינם ברי קיימא.

כאן ניתן לראות שער לפיקו, רין, PE וציאן PE ב-DI שבע PE SI שבע. זה מאפשר להשיג תאים חיוביים אדומים אמיתיים ושליליים אדומים אמיתיים ולהוציא תאים שליליים אדומים אוטו-פלואורסצנטיים. תמונות אלה מראות שער עבור משרעת פלואורסצאין איזותיוציאנט מתאימה CA ו-PEA המאפשרת מיון של תאים חיוביים ירוקים אמיתיים ושליליים ירוקים אמיתיים בתוך אוכלוסיות שליליות אדומות ושליליות אדומות.

טיהור פקס של תאי ES מובחנים במבחנה חושף ארבע אוכלוסיות נפרדות של אבות כפי שניתן לראות מתרשים ציטומטריית זרימה זה. ארבע האוכלוסיות המובחנות של אבות הן אדום, ירוק חיובי, אדום חיובי, ירוק חיובי, אדום שלילי, ירוק שלילי חיובי ואדום ירוק שלילי שלילי. תמונת מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מייצגת זו מציגה מצעי פיברונקטין בדוגמת מיקרו.

סרגל קנה המידה מייצג 80 מיקרון. תמונה זו מציגה מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מייצגת של עובדות שמקורן בעובר, אבות מבודדים בפאנלים העליונים ועובדות נגזרות ESL, אבות מבודדים בפאנלים התחתונים לאחר חמישה ימים נוספים של תרבית על גרעיני מיקרו פיברונקטין צבועים בכחול. S-M-M-H-C-A אלפא אקטינין סרקומרי מוכתם באדום נראה ירוק.

סרגל קנה המידה הוא 40 מיקרון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר רקמת שריר הלב תפקודית אנזוטרופית ממקור תאים מתחדש של פרוטוס לבבי.