Name: דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למד לייצר רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact על משטחי PDMS. שיטה זו משתמשת בתאי גזע עובריים ובמיון תאים פלואורסצנטי לבידוד תאי מקור לבביים טהורים ליישומים קליניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו בוצעה בחלקו במרכז ננו מערכות (CNS), חבר ברשת הלאומית לננוטכנולוגיה תשתיות (NNIN), אשר נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע בפרס NSF לא. ECS-0335765. מערכת עצבים המרכזיים היא חלק מאוניברסיטת הרווארד.

הפרוטוקול ליצירת רקמת שריר לב מתפקד מיושרת ניתן לחלק לשלושה חלקים עיקריים. הייצור של אדון micropatterned באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות אינו נחשב חלק מהפרוטוקול הבא אבל יכול להתבצע על בסיס שיטה הוקמה 6. 1. הדפסת microcontact של פיברונקטין על PDMS מצעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב Sylgard 184 אלסטומר (Dow Corning) PDMS ב10:01 בסיס לריפוי יחס סוכן ודגת ההרכבה באמצעות ייבוש כדי לחסל את כל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure PDMS נגד אדון מפוברק בעבר עם 20 מיקרומטר רחב ו2 רכסים גבוהים מיקרומטר, מופרד על ידי מרווח מיקרומטר 20 עבור 2 ימים בטמפרטורת חדר או 4 שעות על 65 מעלות צלזיוס להשיג בולי PDMS microtextured. </li></ol> * אשפרה בייבוש מומלצת מאוד לחסל את כל בועות אוויר. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המעייל PDMS על גבי תלושי כיסוי זכוכית (למשל22x22 מ&quot;מ) בשעה 5000 סל&quot;ד עבור 2 דקות באמצעות coater ספין התקדמות לייצר דקים ואפילו PDMS מצעים של עובי מיקרומטר 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה בולים עם אתנול 70% כדי להסיר אבק וחלקיקי לכלוך. תן להם אוויר יבש. </li></ol> * חותמות ניתן להשתמש מספר פעמים, לעומת זאת, חידוש בולי PDMS על בסיס קבוע מומלץ עקב שחיקה שטח לאורך זמן. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בולי מקום במנקה SPI פלזמה-Prep השנייה פלזמה ותהליך לדקות 1 ב275 mTorr לעבד משטחי PDMS הידרופילי. </li></ol> * טיפול פלזמת חמצן צריך להיות במעקב. פעמי טיפול ארוכות יותר יכולות לגרום לפיצוח של אלסטומר. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר בולים עם אתנול 70% למשך דקת 1. יבש במהירות עם אוויר דחוס. </li></ol> יש לבצע * צעדים נוספים בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי להחתים משטחים עם Fפתרון ibronectin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל בDDH 2 O). תן לו לספוג לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנער פתרון פיברונקטין מבולים ויבשים במהירות עם אוויר דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קשר קונפורמי בין הבולים וPDMS מצעים עבור 2 דקות ולחץ בחוזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מצעי micropatterned עם DDH 2 O. אחסן אותם בDDH 2 O למקסימום של 2 שבועות ב 4 ° C, אלא אם כן השתמשתי בתחילה. חנות PDMS בולים בDDH 2 O. </li></ol> 2. תחזוקה של קווים כפולים מהונדסים תאי גזע עובריים ראשית, להכין את המדיה הבאה לתאי גזע העוברי של עכבר culturing: פיברובלסטים עכבר עוברי (MEF)-בינוני: ES תא או התמיינות בדרגה הבינונית של שינוי נשר Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P / S) תאי גזע עובריים (ESC)-בינוניים: DMEM, 15% בדרגת התא ES FBS,1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.5% P / S, 0.2% לוקמיה פקטור מעכב (LIF), 0.0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעייל 6-גם עם 0.1% סטרילי ג&#39;לטין בDDH 2 O ולתת לו 15 דקות לספוג ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף MEFs מaliquot מופשר ל 50 המ&quot;ל PBS בצינור חרוטים וחובצה אותם ב -1,000 סיבובים לדקה למשך 5 דקות. Resuspend MEFs בMEF הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספיחה, aspirate ג&#39;לטין העודף ותוספת MEFs לתוך הבארות. אפשר יום 1 MEFs לצרף. </li></ol> * Aliquot של 10 מ&#39;מספיק MEFs עבור 3 צלחות 6-כן. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר MEFs צרף, להוסיף תאי גזע עוברי מaliquot מופשר ל 50 המ&quot;ל PBS בצינור חרוטים וחובצה אותם ב -1,000 סיבובים לדקה למשך 5 דקות. תאי גזע עובריים בresuspend הבינוני ESC ולהוסיף אותם לבארות המכילות MEFs. תאי גזע עוברי בתרבית ESC בינוני עד מפגש הוא הגיע. </li></ol> * ברגע שתאי גזע עוברי הגיעו מפגש, passaging הוא required כדי למנוע צמיחת יתר ולשמור על מושבות תאי גזע עוברי. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי גזע עוברי לpassaging. Aspirate ESC הבינוני ולשטוף פעם אחת עם סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 500 μl של טריפסין. 3.5 דקות תהליך על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון טריפסין מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור את מושבות תאי גזע עוברי, ולנטרל אותו עם 500 μl של ESC-בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע עוברי Passage לפי היחס הרצוי שלך, 33 μl העברה לדוגמה טובה נוסף עם הכינו MEFs בעבר למעבר 1/30. לשמור על תאי גזע עוברי בESC-בינוני. </li></ol> * יחס מעבר של 1/30 מאפשר לתאי גזע עוברי, כדי להגיע לנקודת מפגש תוך 3 ימים. תאי גזע עוברי מעבר על פי לוח זמני בידול המבחנה בשלך. 3. בהתמיינות במבחנה של קווים כפולים מהונדסים תאי גזע עובריים ובידוד והזריעה של אבות קרדיולוגיים ראשית, להכין את followiתקשורת ng דרוש להתמיינות במבחנה של תאי גזע עוברי: הסתגלות-בינוני: הבינוני של Iscove השינוי של Dulbecco (IMDM), 15% ES FBS תא בכיתה, 1% NEAA, 0.5% P / S, 0.2% LIF, 0.0007% 2-ME בידול-בינוני: IMDM, 15% FBS התמיינות בדרגה. 1% NEAA, 0.5% P / S, 0.35% מחומצה אסקורבית 0.1M, 0.0007% 2-ME <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל בהתמיינות תאי גזע עוברי מבחנה כאשר הגיעו מפגש. 10 מנות תרבות סנטימטר מעייל עם 0.1% סטרילי בג&#39;לטין DDH 2 O ולתת לו 15 דקות לספוג ב 37 ° C. </li></ol> * היה מודע משך תהליך בידול המבחנה ב. זה לוקח 8 ימים עד שניתן לבודד אבות לב. תכנן את הניסויים שלך בהתאם. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע עוברי קציר כמו קודם. לאחר הספיחה, aspirate ג&#39;לטין העודף ולהוסיף כ 1/3-1/2 של השעית תאי הגזע העוברי לתרבות המוכנהמאכלים המכילים הסתגלות בינונית. תאי תרבות למשך 2 ימים. </li></ol> * בחר את כמות תאי גזע עוברי, להסתגלות לפי הניסויים שלך. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר מותאם תאי גזע עוברי לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל PBS באמצעות 1. 5 מ&quot;ל של טריפסין. צנטריפוגה תאי גזע עובריים ניתקו ב1000 סל&quot;ד למשך 5 דקות וresuspend אותם בהתמיינות בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך גופי embryoid (EBS) של כ -1,000 תאים לכל טיפת μl 10 ב15 מנות תרבות סנטימטר באמצעות פיפטה רבה ערוצית. הפוך את הצלחות והתרבות EBS כתלוי טיפין במשך 2.5 ימים ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2.5 ימים, הברכה EBS של 6-8 סנטימטר 15 מנות תרבות לאחד באמצעות בידול בינוני ותרבותם במשך 3.5 ימים נוספים על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3.5 ימים, לאסוף EBS בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ולתת להם לשקוע בתחתית לכ 5 דקות. תמצוץ את supernatant ולשטוף עם EBS סטרילי PBS. בואו EBS שוב שוקע לתחתית עבור approximately 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק EBS על ידי עיבודם עם 2. 5 מ&quot;ל של טריפסין למשך 2 דקות באמבט מים ב 37 ° C רועד צינור ברכות. לאחר מכן יש להוסיף 2. 5 מ&quot;ל של PBS סטרילי לפתרון טריפסין ופיפטה מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגית כ 8-10 פעמים כדי לשבור אשכולות תא. לנטרל טריפסין עם 10 מ&quot;ל של חיץ FACS המכיל 7.5% FBS תא או ES התמיינות בדרגה ו0.01% DAPI ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה EBS ניתק ב1000 סל&quot;ד למשך 5 דקות וresuspend כ 1 מ&quot;ל של חיץ FACS. פיפטה מעלה ומטה עם פיפטה 1 מ&quot;ל כ 8-10 פעמים כדי לשבור אשכולות תא. </li></ol> * הוסף חיץ FACS בהתאם לסכום המשוער של EBS ניתק. תאים מרוכזים מדי גבוה עלולים לסתום במהלך FACS ותאים מרוכזים נמוכים מדי עלולים להאריך את זמן FACS שלא לצורך. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לצינור סטרילי עגול עם תחתית מסננת תא 35 מיקרומטר להשיגהשעית תא בודדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע עוברי באמצעות בדיל מיין Cytometer תזרים FACSAria ולקבל מטוהרי אוכלוסיות של CVP. </li></ol> * פתחנו אסטרטגית gating רב שלבים לבודד תאים צבעוניים מטוהרים מאוד. בקיצור, אנחנו השער הראשון במשרעת קדימה פיזור (FSC-) ומשרעת פיזור צד (SSC-) (איור 1 א). זה מאפשר לנו להפריד בין תאים שלמים מפסולת תאית. אנחנו מכן שער בFSC-קדימה ופיזור-רוחב (FSC-W) (1B איור). זה מאפשר לנו לבודד התאים singlets מכפילויות ואגרגטים סלולריים אחרים. אנחנו מכן שער בSSC-וצד פיזור-רוחב (SSC-W) (התרשים 1C). זה מגדיל את טוהר singlets הסלולרי. אנחנו מכן שער בDAPI ההכתמה לבודד תאי קיימא (DAPI שלילי) מתאים שאינם בנות קיימא (1D איור). אנחנו מכן שער בPhycoeryhthrin משרעת (PE-) וPE-Cyanine לצבוע 7 משרעת (PE-Cy7-) כדי לקבל אדום חיובי (R אמיתי + </sup&gt;) ואמיתיים אדומים שליליים-(R - תאים) ולהוציא תאי autofluorescent האדומים שליליים (האיור 1E). + R ו R - תאים אז מגודרים בנפרד על Amplitude fluorescein isothiocyanate (FITC-) וPE-למיין אמיתיים ירוקים חיוביים-(G +) וירוקים אמיתיים שליליים-(G -) תאים בתוך אוכלוסיות אלה (האיור 1F + 1G). התוצאה הוא 4 אוכלוסיות של תאים כדלקמן: R + G + R, + G - ר - ג + ו R - G - (איור 1H). <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Passivate micropatterned מצעים עם Pluronic 1% F-127 בDDH 2 O למשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף אותם 3x עם PBS סטרילית. </li></ol> * Pluronic F-127 הם שטח הידבקות תא חוסם את זה. הוא תומך בכליאה של הידבקות תא לאזור micropatterned. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אטמי PDMS סביב אזור הדוגמתולחץ בחוזקה. ואז, CVP זרע על גבי מצעי פיברונקטין micropatterned. </li></ol>

<ol><li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
<li>Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiogenesis+and+the+complex+biology+of+regenerative+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine.</a> Science. 322, 1494-1497 (2008).</li>
<li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326, 426-429 (2009).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).</li>
<li>Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+aspects+of+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological aspects of cardiac tissue engineering.</a> Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+regulates+collagen+type+I+expression+in+human+tendon+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).</li>
<li>Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+microtextured+scaffold+templates+to+control+organization+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).</li>
<li>Isenberg, B. C., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+structure+into+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Building structure into engineered tissues.</a> Materials Today. 9, 54-60 (2006).</li>
<li>Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+biomechanics+in+tissue+engineering+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+contractile+strength+of+engineered+cardiac+muscle+by+hierarchal+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture.</a> Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).</li>
<li>Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).</li>
<li>Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+approach+to+micropattern+cells+on+common+culture+substrates+by+tuning+substrate+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability.</a> Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).</li>
<li>Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+postnatal+growth+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Characterisation of postnatal growth of the murine heart.</a> Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).</li>
<li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+pathologic+cardiac+hypertrophy+in+adulthood+is+preceded+by+neonatal+cardiac+growth+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Ohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+of+the+transverse-axial+tubule+system+in+ventricular+cardiomyocytes+from+failing+and+non-failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts.</a> Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373(2009).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+cell+sheets+for+constructing+three-dimensional+tissue+with+well-organized+cell+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation.</a> Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).</li>
<li>Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+of+aligned+cell+sheets+for+layer-by-layer+control+of+complex+tissue+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure.</a> Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרוטוקול זה, הציג שיטה לבודדות אוכלוסיות מטוהרות של אבות קרדיוגני ולזרעם על מצעי micropatterned פיברונקטין מה מאפשר להם ליישר ולקחת צורת מוט myocyte דמוית לב. ארגון סלולרי רגיל הוא קריטי לתפקוד תקין רקמה 8,10, בפרט לרקמת שריר לב. myocytes הלבבי הוכח לפתח 11,12 השתפרו מכאניים ותכונות אלקטרו 11,13 בעת הקמת מערכים סלולריים אניזוטרופי. מאז אבות לב תרבית על מצעי micropatterned פיברונקטין להתמיין לתאי שריר לב בצורת מוט במבחנה, זה מייצג צעד apiv...

למרות התקדמות בטיפול רפואי, אי ספיקת לב מתקדמת נשארה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. התסמונת הקלינית נובעת מאובדן של רקמת שריר לב פונקציונלית ובהמשך חוסר יכולת של לב לא מצליח לענות על הדרישות מטבוליות של אנשים מושפעים. מאז הלב יש יכולת התחדשות מוגבלת, השתלת לב אוטולוגית היא הטיפול היחיד הנוכחי קבל קליני המכוונים במישרין חידוש רקמת לב מתפקד לאיבוד. חסרונות משמעותיים של השתלת לב, כולל מספר מוגבל של לבבות תורמים ואת הצורך בטיפול לדיכוי חיסוני לטווח ארוך, למנוע את השימוש הנרחב של טיפול זה. כתוצאה מכך, טיפול הרפואי היה עמוד התווך של טיפול בחולים עם מחלת לב. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב בריאה וחולה, במבחנה. <html> ההתכנסות האחרונה של טכנולוגיית הנדסת רקמות וביולוגיה של תאי גזע מעלה אפיקים מבטיחים חדשים להתחדשות לב. יצירת רקמת שריר לב פונקציונלית ממקור מתחדש מטופל ספציפי תהיה התקדמות גדולה בתחום. היכולת זו תאפשר לפיתוח מבחנים סלולריים ספציפיים לפיתוח תרופה למחלות וגילוי והייתי להניח את היסודות לרפואת רגנרטיבית לב. תאי גזע עוברי אנושיים (ES) ומה שחשוב יותר, תאי גזע pluripotent מושרים אדם (IPS) מייצגים מקור פוטנציאלי מתחדש מטופל ספציפי של תאי אב חדרית וחדרית myocytes הבוגר. שילוב של ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות אסטרטגיות מטפל בבעיה על ידי יצירת רקמת לב מתפקדת במבחנה שיכול לשמש בפיתוח של מבחנים סלולריים לגילוי סמים או בגישות משובי לב לטיפול באי ספיקת לב מתקדם. _content &quot;&gt; אתגר מרכזי בהתחדשות לב כבר זיהוי של סוג תא אופטימלי. מגוון רחב של תאים נחקר 1, אך עד היום, למרות שמבשרי קרדיוגני multipotent שונים ממקורות שונים כבר גילו, זיהוי של תא המקור שעונה על דרישות קריטיות כגון מחויבות לגורל התא myogenic, תחזוקה של היכולת להרחיב in vivo או במבחנה והרכבו לרקמת שריר לב פונקציונלית הוכיח להיות בעיה מרכזית 2. כבר תארו מערכת עכברית מהונדסת כפולה בעבר המאפשר בידוד של אוכלוסיות מטוהרות של אבות מחויבים חדרית (CVP) מתאי גזע עוברי במבחנה המבדילה מאוד. אנחנו שנוצרנו עכבר מהונדס כפול רומן שמבטא את חלבון פלואורסצנטי האדום dsRed תחת שליטתו של משפר Isl1 תלוי של הגן וMEF2c החלבון פלואורסצנטי הירוק המשופר בשליטהלב הספציפי Nkx2.5 המשפר. בהתבסס על מערכת זו שני צבעי ניאון כתב, אבות ראשונים ושניים בלב שדה מתאי גזע עוברי מתפתחים שאפשר לבודד באמצעות מיון פלואורסצנטי הופעל תא (FACS) על פי הביטוי של MEF2c וNkx2.5 גנים שלהם. CVP להידמות myocytes לב המבוסס על דפוסי הביטוי של סמני שריר לב ואיכויות מבניות ותפקודיות 3, מה מציע הבטחה גדולה למטרות התחדשות רקמת לב. למרות שיש כבר התקדמות הרבה בתחום הנדסת רקמות, מחק ארכיטקטורת הסלולר מולדת נשאר אתגר מרכזי. שיטות מקובלות להתמודדות עם אתגר זה כוללים זריעת פיגומים ביולוגיים או סינטטיים עם תאים במבחנה. בשל מספר החסרונות של פיגומים, כולל פירוק מהיר, יציבות פיזית ומכאנית מוגבלת וצפיפות הנמוכה של תאי 1,4,5, יש לנו ניסינו להנדס פיגום פחות רקמות. Altתאי לב אף יכולים לשנות microenvironment המקומי שלהם על ידי ההפרשה של חלבונים תאיים מטריקס, יש להם יכולת מוגבלת יותר להתארגן לmyocytes לב בצורת המוט בהיעדר רמזים תאיים. לפיכך, תבנית שמספקת תאי רמזים מרחביים וביולוגיים מתאימים לרקמת שריר לב מרכיבים פונקציונלית נדרשת. הדפסת microcontact מטפלת האתגר הזה על ידי מתן טכניקה פשוטה וזולה לשלוט במדויק צורת תא, ארגון ותפקוד 6-8, כל אלה הם קריטיים עבור הדור של רקמת שריר לב מתפקד מיושרת. היא כוללת שימוש בבולי microtextured polydimethylsiloxane (PDMS) עם גדלי תכונה הנעים במורד עד 2 מיקרומטר 9 שיאפשר התצהיר של חלבונים תאיים מטריקס על גבי מצעי PDMS בדפוסים מדויקים ובכך להשפיע על הידבקות התא מרחבית. בזאת, אנו מציעים לשלב טכנולוגית bioengineering רקמות עם הגזע cell ביולוגיה ליצור רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי. בהתאם לכך, אנחנו כאן להפגין הגישה שפורסמה לאחרונה את הדברים הבאים: (1) את הדור של משטחי חלבון micropatterned על PDMS מצעים ידי הדפסת microcontact עבור הדור של תבנית לרקמת שריר לב בציר, (2) הבידוד של מטוהר אבות לבביים מאוד מ תאי גזע עוברי הבחנה במבחנה, ו( 3) שילוב של שתי הטכניקות ליצירת רקמת שריר לב מיושר פונקציונלית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> חומצת L-אסקורבית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A4544 </td><td> להכין תמיסת 0.1M בDDH 2 O </td></tr><tr><td> ייבוש, אבק 10 אינץ </td><td> נובה טק International, Inc </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> של Dulbecco שינוי הנשר הבינוני </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Cytometer הזרימה השנייה FACSAria </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עובריES תא כיתה </td><td> ג&#39;מיני Bio-מוצרים </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> התמיינות בדרגת סרום שור עוברי </td><td> ג&#39;מיני Bio-מוצרים </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> פיברונקטין משור הפלזמה </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> F4759 </td><td> Solubilize ל1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בDDH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest פרימיום כיסוי הזכוכית 22x22mm </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;לטין מעור חזירי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G1890 </td><td> להכין תמיסת 0.1% בDDH 2 O </td></tr><tr><td> Coater ספין ההתקדמות </td><td> התקדמות Research, Inc </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> הבינוני של Iscove השינוי של Dulbecco </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> פקטור מעכב וקמיה </td><td> עצמי-הוכן משורות תאי LIF-מפרישים </td><td></td><td> להכין תמיסת מניות 500x </td></tr><tr><td> ממ חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> פיברובלסטים עובריים של עכבר </td><td> נקטף 12-15 עוברי עכברי יום </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P2443 </td><td> להכין תמיסה של 1% בDDH 2 O </td></tr><tr><td> Tube ישבן עגול עם מסננת תא 35 מיקרומטר </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> מנקה SPI פלזמה-Prep השנייה פלזמה </td><td> ספקי SPI </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgardערכת סיליקון אלסטומר 184 </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL Elast KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> מד ואקום </td><td> ספקי SPI </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

אי ספיקת לב מתקדמת מהווה אתגר קליני מסופק עיקרי, הנובעת מהאובדן של תאי שריר לב קיימא ו / או תפקודיים באופן מלא. למרות טיפול תרופתי אופטימלי, אי ספיקת לב מהווה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב אנושית בריאה וחולה במבחנה. כמו כן, את האתגרים המרכזיים בביולוגית לב משובים סובבים סביב זיהוי והבידוד של אבות לב מטופל ספציפיים בכמויות רלוונטיות קליני. תאים אלה צריכים אז להרכיב לתוך רקמה פונקציונלית דומות לארכיטקטורת רקמת לב הילידים. הדפסת microcontact מאפשרת יצירה של צורות חלבון micropatterned מדויקות המזכירות ארגון מבני של הלב, ובכך לספק רמזים גיאומטריים לשלוט הידבקות התא מרחבית. בזהאנו מתארים את הגישה שלנו לבידוד של תאי שריר לב המטוהר ביותר מתאי הגזע pluripotent המבדיל במבחנה, הדור של משטחי צמיחת תא micropatterned עם חלבונים תאיים מטריקס, וההרכבה של תאי גזע המופקים מתאי שריר הלב לתוך רקמת שריר הלב איזוטרופי.

FACS-טיהור בתאי גזע עוברי בדיל מבחנה התגלתה ארבעה אוכלוסיות שונות של אבות (איור 1). הנוכחות של פיברונקטין micropatterned אושרה על ידי מיקרוסקופיה immunofluorescence שמוצגת העברה מלאה של קווי פיברונקטין רציפים (איור 2). ציפוי של אבות FACS-מבודדים על micropatterns פיברונקטין הביא יישור של R + G + וחלק מהמחקר - G + אוכלוסיות. למרות Pluronic F-127 כחוסם תומך של הידבקות תא היה בשימוש, R <sup...

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

מטרת הניסוי הבא היא להפיק רקמת שריר לב תפקודית ומסודרת באמצעות הדפסת מיקרו-מגע. הדבר מושג תחילה על ידי הדפסת מיקרו-מגע של fibronectin על מצעי poly dimethyl siloxane. כשלב שני, דוברי טרנסגנים.קווי תאי גזע עובריים מובחנים in vitro ומבודדים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), המאפשר קבלת אוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי אב קרדיוגניים חזקים. לאחר מכן, תאי אב לבביים מבודדים נזרעים על מצעי PDMS בעלי מיקרו-תבניות כדי להפוך אותם למעוצבים ולגרום להם לקבל צורה של מוט דמוית מיוציט לבבי. התוצאות המתקבלות מראות בידוד מוצלח וצמיחה איזוטרופית של תאי אב לבביים, בהתבסס על נתונים ואנליזת אימונופלואורסצנציה.יצירת רקמת שריר לב איזוטרופית יכולה לסייע בקידום התחומים של ביולוגיית תאי גזע והנדסת רקמות ביולוגית, על ידי העלאת האפשרות לפיתוח מערכי בדיקה תאיים ספציפיים למחלות לצורך פיתוח וגילוי תרופות, ועל ידי הנחת היסודות לרפואה רגנרטיבית של הלב. ראשית, ערבבו poly dimethyl siloxane elastomer ביחס של 10 ל-1 עם חומר המקשה וערבבו היטב.בצעו ניתון גזים (Degas) למכלול באמצעות מייבש כדי להסיר בועות אוויר. שפכו את ה-PDMS לתוך תבנית מאסטר שהוכנה מראש, בעלת חריצים ברוחב 20 micron ובגובה שני micron, המופרדים במרווחים של 20 micron, ולאחר מכן המתינו לייבוש (cure) במשך יומיים במייבש בטמפרטורת החדר כדי לקבל חותמות PDMS בעלות טקסטורת מיקרו. לאחר מכן, הפכו את פני השטח של חותמות ה-PDMS להידרופיליים באמצעות מנקה פלזמה.עקרו את החותמות באמצעות 70% ethanol למשך דקה אחת. בתוך קבלית בטיחות ביולוגית, ייבשו במהירות בעזרת אוויר דחוס. כסו את משטחי החותמות הסטריליים בתמיסת fibronectin למשך 10 דקות לפחות לאחר הספיגה.נערו מהחותמות את תמיסת הפיברונקטין ויבשו במהירות באמצעות אוויר דחוס. צרו מגע קונפורמי בין החותמת לבין למיקיות זכוכית מצופות PDMS שהוכנו מראש, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, למשך שתי דקות תוך לחיצה חזקה. שטפו את תשתי המיקרו-דפוס במים מזוקקים.אחסן אותם במים מזוקקים למשך מקסימום שבועיים בטמפרטורה של 4 °C, אלא אם כן הם מיועדים לשימוש מיידי. צפה שש פלטות בארות בג'לטין סטרילי בריכוז 0.1% במים מזוקקים והשאר לספיגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C. במהלך זמן זה, הכן את הפיברובלסטים העובריים של העכבר ממנת עבודה קפואה על ידי הוספתם ל-50 milliliters של PBS בשפופרת קונית. סבב את התמיסה בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות והשבה אותם למצב של סספנציה בתווך גידול מתאים.עם סיום זמן האינקובציה, שאבו את עודפי הג'לטין והוסיפו את ה-mes לבארות. המתינו יום אחד להיצמדות ה-MES. הכינו את תאי הגזע העובריים או את תאי ה-ES מאליקוט מורגש על ידי הוספתם ל-50 milliliters של PBS בשפופרת קונית. סבבו בצנטריפוגה.סובב את תאי ה-ES במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות והשהה אותם במדיום ESC. הוסף את תאי ה-ES לבארים המכילות myths ותחזק אותם במדיום ESC עד להשגת התלכדות (confluence) כדי לעסות תאי ES תלכודים. ראשית, שאב את מדיום ה-ESC ושטוף את התאים פעם אחת ב-PBS סטרילי.לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והוסיפו 500 µL של tripsinto אל הבאר. דגרו את הפלטה למשך שלוש דקות וחצי ב-37 °C. העבירו את תמיסת ה-TRIPSIN מעלה ומטה באמצעות פיפט מספר פעמים.ראשית, יש לפרק את מושבות תאי ה-ES. לאחר מכן, יש לנטרל את תמיסת ה-trypsin על ידי הוספת 500 µL של מצע ESC לבאר. יש לערבב את תאי ה-ES בהתאם ליחס הנדרש; במקרה זה, תאי ה-ES מועברים ביחס של 1:30, מה שמאפשר להם להגיע לקונפלואנציה (confluence) תוך שלושה ימים.התחילו את הגזירה (differentiation) במקום (in vitro) כאשר תאי ה-ES הגיעו למצב של התמזגות (confluence). תחילה, צפו צלחות תרבית של 10 סנטימטר ב-0.1% gelatin סטרילי במים מזוקקים והניחו להן להיספג במשך 15 דקות ב-37 degrees Celsius. במהלך זמן זה, אספו את תאי ה-ES כפי שבוצע קודם לכן.לאחר שחלפו 15 דקות, שאבו את עודפי הג'לטין והוסיפו כשליש עד מחצית מתלי ה-E ES לכלי תרבית המכילים מצע הסתגלות. לאחר גידול התאים במצע ההסתגלות למשך יומיים, קצרו את תאי ה-ES המסתגלים לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה PBS, באמצעות 1.5 מיליליטר של טריפסין. סובבו אותם בצנטריפוגה במהירות 1000 RPM למשך חמש דקות והשביתו אותם שוב במצע דיפרנציאציה.הכינו גופי עובר (embryo bodies) או EBS של כ-1000 תאים לכל טיפה של 10 µL של מצע דיפרנציאציה בצלחות תרבית של 15 cm. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הפכו את הצלחות והעבירו לתרבית. השאירו את ה-EBS כטיפות תלויות למשך יומיים וחצי בטמפרטורה של 37 °C.לאחר יומיים וחצי, העבירו את ה-EBS משישה עד שמונה צלחות בקוטר 15 סנטימטר לצלחת אחת המכילה מצע דיפרנציאציה, וגדלו אותם למשך שלושה וחצי ימים נוספים. לאחר שלושה וחצי ימים נוספים, אספו את ה-EBS לשפופרת קונית של 50 מיליליטר ושטפו את הצלחת פעם אחת ב-PBS סטרילי כדי לאסוף את כל ה-ebs. לאחר מכן, המתינו כחמש דקות עד שהם ישקעו לתחתית.לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון ושטוף את ה-EBS ב-PBS סטרילי. המתן עד שה-EBS ישקע שוב לתחתית למשך כחמש דקות. פרק את ה-EBS על ידי הוספה של 2.5 milliliters של trypsin ונער את המבחנה בעדינות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות.לאחר מכן, הוסיפו 2.5 milliliters של PBS סטרילי לתמיסת ה-trypsin ובצעו פיפוט למעלה ולמטה באמצעות פיפט סרולוגי של 10 milliliter כ-8 עד 10 פעמים כדי לפרק צבירי תאים. נטרלו את ה-trypsin עם 10 milliliters של באפר fax המכיל 7.5% FBS בדרגת תאים או דיפרנציאציה ו-0.01% DPI ב-PBS; סבבו במצנטריפוגה את ה-EBS המפורק במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את העלייה (supinate) והוסיפו כ-one milliliter של באפר fax; בצעו פיפוט למעלה ולמטה באמצעות פיפט של one milliliter כ-8 עד 10 פעמים כדי לפרק צבירי תאים.העבירו את התאים למבחנה סטרילית בעלת תחתית עגולה עם מסנן תאים של 35 מיקרון כדי לקבל תגסוסיה של תאים בודדים. בצעו מיון של תאי ES מובחנים באמצעות ציטומטר זרימה מסוג aria והשיגו אוכלוסיות מטוהרות של תאי אב ונטריקולריים מחויבים. עיינו בחלק הטקסטואלי של הפרוטוקול כדי לקבל את אסטרטגיית ה-gating המפורטת.השרים את תשתי המיקרו-תבנית ב-1%onic F1 27 במים מזוקקים למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטוף אותן שלוש פעמים ב-PBS סטרילי. הצמד אטמי PDMS מסביב לאזור התבנית ולחץ בחוזקה.לאחר מכן, זרעו תאי אב לבביים על מצעי מיקרו-תבנית של פיברונקטין. התמונות הבאות לקוחות מתרשים ציטומטריה זרימתית מייצג של תאי ES שעברו דיפרנציאציה in vitro ביום השישי. תמונה זו מראה סינון (gating) על פי אמפליטודת פיזור קדמי FSCA ואמפליטודת פיזור צדי SSCA.פעולה זו מאפשרת הפרדה של תאים שלמים משאריות תאיות. כאן נראה בחירה (gating) על סמך שטח פיזור קדימה FSCA ורוחב פיזור קדימה FSCW. הדבר מאפשר בידוד של תאים בודדים (singlets) מצמדים (doublets) ומצבירים תאיים אחרים.תמונה זו מציגה סינון (gating) של SSCA ופיזור עם SSCW. פעולה זו מגבירה את טוהר התאים הבודדים (singlets). תמונה זו מציגה סינון של FSCA וצביעת DPI, המאפשרת בידוד של תאים חיים שליליים ל-DPI מתאים שאינם חיים.כאן נראה את ה-gating עבור fico, rine, PE ו-PE cyan ב-DI seven PE SI seven. דבר זה מאפשר להשיג תאים חיוביים לאדום אמיתי ותאים שליליים לאדום אמיתי, ולהוציא תאים עם פלואורסצנציית רקע (autofluorescent) שליליים לאדום. תמונות אלו מראות gating עבור עוצמת fluorescein isothiocyanate fit CA ו-PEA, המאפשר מיון של תאים חיוביים לירוק אמיתי ותאים שליליים לירוק אמיתי בתוך אוכלוסיות חיוביות לאדום ושליליות לאדום.טיהור באמצעות FACS של תאי ES שעברו דיפרנציאציה in vitro חושף ארבע אוכלוסיות נפרדות של תאי מקור, כפי שניתן לראות בתרשים פלוו-ציטומטריית זה. ארבע אוכלוסיות תאי המקור הנפרדות הן: אדום חיובי וירוק חיובי, אדום חיובי וירוק שלילי, אדום שלילי וירוק חיובי, ואדום שלילי וירוק שלילי. תמונת מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה מייצגת זו מציגה מצעי פיברונקטין בעלי תבניות מיקרוסקופיות.סרגל המقياس מייצג 80 microns. תמונה זו מציגה מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה מייצגת של facts ממוצא עוברי, פרוגניטורים מבודדים בלוחות העליונים, ושל facts ממוצא ESL, פרוגניטורים מבודדים בלוחות התחתונים לאחר חמישה ימי תרבית נוספים על תבניות מיקרו של fibronectin; גרעינים נצבעו בכחול. S-M-M-H-C-A נצבע באדום ו-sarcomeric alpha actinin מופיע בירוק.סרגל המقياس הוא 40 microns. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר רקמת שריר לב פונקציונלית אניזוטרופית ממקור תאים מתחדש של cardiac protus.

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למד לייצר רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact על משטחי PDMS. שיטה זו משתמשת בתאי גזע עובריים ובמיון תאים פלואורסצנטי לבידוד תאי מקור לבביים טהורים ליישומים קליניים.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

גלה סרטונים נוספים