תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקד במדויק למיקרו דומיינים במפה פונקציונלית כדי לחקור את המבנה והתפקוד של נוירונים ברזולוציה גבוהה. זה מושג על ידי ביצוע הדמיית אותות פנימיים על פני שטח גדול של קליפת המוח כדי לקבל מפה של תכונת הגירוי המעניינת. השלב השני הוא לקבוע את המיקום המדויק במפה שאמור להיות ממוקד להדמיית פוטונים ברזולוציה גבוהה.

לאחר מכן, לאחר מיקום זהיר של הפיפטה העמוסה בצבע פלואורסצנטי, נוירונים מסומנים בסמן הפלואורסצנטי. לבסוף, נאספות תמונות ברזולוציה גבוהה לפוטונים של תגובות או מבנים עצביים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במפת תכונת אות מהותית כדי למצוא אזור עניין, כגון סינגולריות גלגל סיכה של כיוון שניתן למקד לאחר מכן למחקר ברזולוציית נוירון בודד.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן לדמות את קליפת המוח בקני מידה מרחביים שונים באמצעות אותו מערך מיקרוסקופ עם כמה התאמות מהירות בלבד למערכת. זה מאפשר לשלב את הטכניקות הללו כדי להשתמש במפת האותות הפנימית ברזולוציית הקורס כמדריך לבחירת אזור של נוירונים לתיוג עם בדיקות פלואורסצנטיות להדמיה ברזולוציה גבוהה. החיה הורדמה על פי פרוטוקול מוסדי שאושר על ידי ועדה לטיפול בבעלי חיים, והגולגולת נחשפה ונוקה.

תערובת צמנט דנטלית שימשה לחיבור לוחית ראש נירוסטה עם פתח מלבני במרכז לגולגולת. תא מתכת על גבי לוחית הראש משמש כמאגר להדמיה עם עדשת האובייקט לטבילה במים. לוחית הראש מאובטחת על במת XY באמצעות עמודי מתכת.

השתמש במקדחה דנטלית כדי לדלל שטח גדול של עצם בתוך הפתח המלבני של לוחית הראש. מריחת שעוות עצם נחוצה כדי לעצור דימום מזדמן. האזור הדק חייב להתרחב מעבר לגבולות הגולגולת המתוכננת.

לאחר מכן קדחו מתאר מרובע של שניים על שני מילימטר בעצם לקרניוטומיה. שטפו את החדר מעת לעת בנוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי טרי כדי להסיר רסיסי עצם ולמזער את פיזור החום לקליפת המוח הבסיסית. כעת, הרם את העצם בעזרת מלקחיים מספר שלוש.

השתמש במלקחיים מספר חמש ובמספריים קפיציים של ואנה כדי להסיר את השכבות העליונות של הדורה ולהשאיר את השכבה התחתונה שלמה. שכבת הדורה הסופית שקופה וכלי הקליפה צריכים להיות גלויים בבירור דרכה. מרחו טיפה של 2% אירוס חם מומס ב-CSF והניחו מיד כיסוי על הגולגולת.

ראשית, קצף ג'ל ספוג ב-CSF סביב החלק החיצוני של זכוכית הכיסוי כדי למנוע מהאגרוס להתייבש במהלך הדמיית אותות פנימית. לאחר מכן חבר את מצלמת ה-CCG להדמיית אותות פנימית ליציאת הרכבה C הסטנדרטית על גבי שני מיקרוסקופ הצילום והנח מקור אור מאיר על שולחן האוויר ליד מיקום XY tagה ואבטח את מוביל האור מעל הגולגולת. החזר את הדיכרואיקה הראשית ואת המראה מתחת ליציאת הר הים כך שהאור האדום המוחזר הדרוש לאותות פנימיים יעבור ישירות מהגולגולת למצלמת ה-CCD.

הכנס מסנן אינפרא אדום לנתיב האור כדי למנוע מקליפת המוח להתחמם. לאחר מכן הניחו מסנן שמעביר אור ירוק והקליטו תמונת ייחוס דיגיטלית של כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח. לאחר מכן, העבר את מיקוד Z ל-500 מיקרון מתחת לפני השטח של קליפת המוח.

החלף את המסנן הירוק במסנן אדום כדי להאיר את קליפת המוח למדידת אותות פנימיים. ודא שקליפת המוח מוארת באופן אחיד. הגן על הגולגולת מהאור המופק על ידי תצוגת הגירוי החזותי והצג רצף של גירויים חזותיים והקלט תמונות נתוני השתקפות כדי ליצור מפת כיוון תוך 10 דקות, אסוף נתונים המתאימים לארבע חזרות של רצף של שמונה גירויים עם ארבעה כיוונים ושני כיוונים לכל כיוון.

כעת נתח את נתוני האות הפנימיים כדי ליצור מפת צבע כיוון שגויה כפי שניתן לראות כאן. לאחר מכן בחר אזורי יעד פוטנציאליים לתיוג שני פוטונים של נוירונים. לדוגמה, סינגולריות גלגל הסיכה של הכיוון במפה שבהן כל הכיוונים המועדפים מתכנסים.

לאחר מכן, שכבו את מפת הכיוון ואת התמונה של כלי הדם של פני השטח בקליפת המוח והשתמשו בפריסת התחומים הפונקציונליים ובמיקום כלי השטח הגדולים כדי לבחור מטרה, תוך הימנעות ממיקומים עם כלי דם ועורקים גדולים. הכן את תמיסות D הפלואורסצנטיות ומשוך פיפטה ארוכה מתחדדת לפי ההוראות בפרוטוקול הכתוב. טען חמישה מיקרוליטר מתערובת הצבע לתוך הפיפטה.

לאחר מכן הסר את שכבת הדורה הסופית כדי להקל על הכנסת הפיפטה ולקבל את שתי תמונות הפוטון האיכותיות ביותר כפי שמודגם בתרשים זה. יש להניע את הפיפטה לתוך קליפת המוח בזווית של 30 מעלות כדי לעבור בין החדר למטרה. לכן, מיקום פני השטח של קליפת המוח של מיקום כניסת הפיפטה לא יהיה ישירות מעל אזור העניין הממוקד.

לדוגמה, כדי לסמן אזור יעד 200 מיקרון מתחת לפני השטח של קליפת המוח, מיקום כניסת הפיפטה על פני השטח בקליפת המוח יהיה כ-350 מיקרון לרוחב מיקום המטרה. הזז את שלב ה-XY כדי למרכז את מיקום כניסת פני השטח של קליפת המוח מתחת למטרה 20 x או 40 x. לאחר שעמדת הכניסה מרוכזת מתחת למטרה, הרם את מיקום ה-Z של המטרה בשני מילימטרים.

לאחר מכן הפעילו את האור הפלואורסצנטי הירוק, ודמיינו את צבע האלקסה האדום בפיפטה והזיזו את הפיפטה עד שהקצה נמצא מעל מיקום הכניסה למשטח קליפת המוח. תוך כדי צפייה בקצה הפיפטה דרך העיניים של המיקרוסקופ עם תאורת שדה בהיר, הורד את הפיפטה עד שהקצה יגיע למיקום הכניסה הרצוי על פני השטח בקליפת המוח. לאחר מכן, הסר את המטרה והשתמש בחניתות ספיגה נטולות מוך כדי לנדף עודפי נוזל עמוד השדרה המוחי מהגולגולת ולייבש את העצם הסמוכה.

לאחר מכן מרחו טיפה של 3% חם, מומס ב- CSF כדי לייצב את קליפת המוח. לאחר שה-aros התמצק, הכנס מטרה של פי 40 ומלא מחדש את החדר ב-CSF. לאחר מכן, השתמש בציר האלכסוני של המניפולטור המיקרו כדי להזיז את הפיפטה עד שהקצה יגיע לעומק הרצוי בקליפת המוח.

נשיפות פליטת לחץ מזדמנות של תערובת ה-DI יפחיתו את הסבירות שקצה הפיפטה ייסתם כאשר הפיפטה תגיע לשכבה השנייה, שלוש נשיפות קטנות של תערובת ה-DI יאירו את החלל התאי הנוסף ויחשפו מכלול צפוף של גופי תאים עגולים כצללים כהים להעמסת גופים עצביים בכדור קליפת המוח בקוטר 300 עד 600 מיקרון. הזרקו את תערובת הדיקס לחלל החוץ-תאי באמצעות 30 עד 90 פולסים. כל פעימה שנייה אחת, שתיים עד 10 PSI.

לאחר השלמת ההזרקה, המתן מספר דקות, ולאחר מכן הסר את הפיפטה והמטרה. מחוון הסידן הפלואורסצנטי ייקלט במלואו על ידי נוירונים תוך שעה. לבסוף, הסר את הארוס המשמש להורדה ושטוף את תא ההקלטה.

הניחו טיפה קטנה של שניים עד 3% על פני השטח והניחו במהירות כיסוי מעל הגולגולת. הכנס מטרה גבוהה של NA 20 x למחזיק המטרה ומרכז מחדש את האזור המסומן בקליפת המוח מתחת למטרה. באמצעות שלב XY מגן על הגולגולת ממקורות אור זרים ואסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של הנוירונים המסומנים in vivo.

לחלופין, ניתן להשתמש באלקטרופורציה של תא בודד לחקר מורפולוגיה דנדריטית או הדמיה תפקודית של דנדריטים. במתודולוגיה זו, ה-DI מוכנים על פי הפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, בנקודה המתאימה בהליך, קצה הפיפטה ממוקם בסמוך לקרום גוף תא עצבי ואקסו משמש להפעלת פולס אחד עד שלושה.

המילוי המיידי של הנוירון בצבע ניתן להמחשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. תמונה זו מציגה אזור מצולם של שני פוטונים המציג גופי תאים המסומנים במחוון הסידן הפלואורסצנטי OGB 1:00 AM בשכבת קליפת המוח הראייתית שתיים שלוש, סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרון. תמונה זו מציגה את העדפת ההתמצאות של גופי תאי עצב בודדים מאותו אתר המוצג בתמונה הקודמת.

מפה מאורגנת של כיוון גירוי מועדף נראית סביב סינגולריות גלגל הסיכה שהייתה מרוכזת באזור התמונה. כאן אנו רואים את מפת הכיוון המתקבלת עם הדמיית אותות פנימית. הריבוע השחור מתאים לאזור המוצג בתמונת שני הפוטונים הקודמת.

תמונה זו מציגה את הדנדריטים וגוף התא של תא עצב בודד המכוסה במפת הכיוון. תא העצב עבר אלקטרופוציה עם רצפה 5 94 של אלקסה בהנחיית שני פוטונים. כאשר מחסנית Z נאספה in vivo ותהליכים דנדריטיים אותרו במצב לא מקוון באמצעות נוירו-צלול כתוכנה.

מפת הכיוון התקבלה באמצעות הדמיית אותות פנימית לפני אלקטרופורציה של תא בודד. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרון. הקרנה זו של 10 מיקרון Z מהשכבה הראשונה בקליפת המוח מציגה דנדריטים אפיקליים.

החצים האדומים מראים קוצים לאורך דנדריטים ואילו הקרנות Z של 10 מיקרון מהשכבה הקורטיקלית השנייה שלוש מציגות דנדריטים בסיסיים עם קוצים המסומנים על ידי חיצים אדומים ואקסונים המסומנים על ידי חיצים לבנים. שיטה זו שימושית לחקר מפות פונקציונליות בקליפת המוח בקני מידה מרחביים שונים ולמיקוד מדויק של נוירונים בתחום עניין ספציפי. בתוך המפה, הדגמנו את היישום של השיטה לבחינת מפות סלקטיביות של אוריינטציה, אך ניתן להרחיב אותה למפות תכונות חזותיות אחרות כגון רשתית, טופה, דומיננטיות עיניים וכיוון, או לשיטות חושיות אחרות שיש להן מפות מאורגנות פונקציונלית כמו אלה המקודדות תחושת סומטו או אודישן.