סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

המטרה הכוללת של מיקרוסקופ אלקטרונים בקנה מידה גדול זה או ניסוי ננו-טומיה היא להגדיר חילופים מהרמה המקרו-מולקולרית לרמת הרקמה, במקרה של היום, במוח דג הזברה המנוון. ננוטומיה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי החיים. למשל, בניוון עצבי ובמחקר סוכרת מסוג 1.

היתרון העיקרי של ננוטומיה הוא שמידע בלתי מוטה, החל ממקרומולקולות, אברונים, תאים ועד רקמות. זה מאפשר כימות ושיתוף נתונים בגישה פתוחה באמצעות nanotomy.org. למרות שננוטומיה מספקת תובנה לגבי תחזוקה חיסונית ומיקרוגליה במוח הניווני של דג הזברה, היא מיושמת גם על מודלים אחרים של מחלות, כולל תרבית תאים, עכבר ואפילו רקמות אנושיות.

בדרך כלל, מדענים חדשים בטכניקה זו מתקשים מכיוון שכמות הנתונים היא עצומה. זה יכול להיות פי אלף יותר ממה שמתקבל עם EM מסורתי. לאחר תיקון זחלי דג הזברה על פי פרוטוקול הטקסט, חתכו את ראשי הזחלים בצורה גברית למוח האחורי כדי להקל על חדירת האוסמיום. מניחים את הזחלים ב-1% אוסמיום טטרוקסיד, 1.5% אשלגן פרוציאניד, ב-0.1 נתרן קקודילאט מולארי ודוגרים על קרח למשך שעתיים.

לאחר מכן השתמש במים מזוקקים כפולים כדי לשטוף את העוברים שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. לפני ההטמעה, יש לייבש את הדגימות בסדרה של אתנול. כדי להטמיע את העוברים, לאחר הדגירה בשרף אפוקסי מדולל למשך הלילה על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את השרף המדולל והשתמש בשרף טהור כדי להחליף אותו.

דוגרים למשך 30 דקות, ואז מחליפים את השרף בפעם השנייה ודוגרים למשך 30 דקות נוספות. לאחר רענון השרף בפעם השלישית, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר מכן, דגרו בחום של 58 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לבסוף, דגרו בלחץ נמוך בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במחט או בקיסם כדי לכוון את הראשים בתבניות הטבעה שטוחות מסיליקון הזמינות מסחרית. לאחר מכן יש לפלמר את שרף האפוקסי בטמפרטורה של 58 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כאשר הדגימה מתקשה במלואה, השתמש בסכיני גילוח כדי לקצץ עודפי שרף מהבדל. כדי לזהות את המיקום הנכון, השתמש בסכין זכוכית או בסכין יהלום על אולטרה-מיקרוטום כדי לחתוך קטעי זחלים דקים למחצה עבור טולואידין כחול/פוקסין בסיסי. העבירו את החלקים הדקים למחצה לשקופיות מיקרוסקופיות על ידי הרמתם בעזרת פיפט פסטר מזכוכית שקצהו נסגר על ידי המסתו בלהבה.

יבש על פלטה חמה עד שלא נשארים מים. לאחר מכן, הניחו את הדגימות ב-1% טולואידין כחול במים ודגרו את החלקים על פלטה חמה למשך 10 שניות כדי להכתים אותם. לאחר מכן, לאחר שימוש במים לשטיפת החלקים, השתמש בפוקסין 05% בסיסי ב-1% נתרן טטרבוראט כדי לצבוע את הדגימות למשך 10 שניות נוספות.

עם מיקרוסקופ אור רגיל ב-10X עד 40X, בדוק את הדגימות. כאשר מגיעים לאתר או לכיוון המתאימים, השתמש במבנים אנטומיים הניתנים לזיהוי בקלות, כולל בורות ריח, עיניים או גבולות חומר אפור-לבן, כדי לזהות את אזור המוח המעניין במהלך חתך אולטרה-דק ולהתאים את זווית החיתוך כאשר הדגימה מוטה. המשך לחתוך את גוש שרף האפוקסי בעזרת סכין יהלום כדי לחתוך חלקים דקים במיוחד של 70 ננומטר.

התקן כל קטע על חריץ יחיד L2 על 1 בצורת רשת נחושת מקודדת כדי לאפשר רכישה ללא הפרעה על ידי פסי רשת. מילימטר מרובע עשוי להיראות קטן. זה פשוט ישתלב בפתח.

בדרך זו, אנו מונעים פסי רשת החוסמים את הדגימה שלנו. הבינו שכל חפץ שהוצג במדגם שלנו יתועד בהשוואה ל-EM מסורתי. השווה את הדגימות למתכות כבדות לפי פרוטוקול הטקסט ואחסן בקופסת רשת. כדי להרכיב את הדגימה במיקרוסקופ האלקטרונים הסורק, או SEM, הנח את הרשת מתיבת ההעברה עם הקטע במחזיק הדגימה של הרשת המרובה והעביר אותה לתא של ה-SEM.

לאחר יישור הגלאי בהתאם לפרוטוקול הטקסט, הקרין מראש את הדגימה על ידי התרחקות כך שהאזור השלם לסריקה יתאים לחלון התמונה. לאחר שינוי הצמצם ל-120 מיקרומטר וביטול המיקוד של התמונה, השתמש באפשרות סריקת השטח המצומצם כדי להפוך את האזור הסרוק לצפוף ככל האפשר. לאחר מכן, הגדר את קצב הפריימים לסריקת המסגרת תוך שנייה עד שתיים בערך.

לאחר מכן הגדל את התצוגה של פי 100 לפחות וסרוק אזור קטן למשך 10 שניות. אם הבהירות באזור עדיין משתנה, המשך בהקרנה מוקדמת. כאשר אזור זה אינו משנה את הבהירות בהשוואה לסביבתו, הקרנה מוקדמת מספיקה.

בזמן המיקוד, בחר את האזור או התכונה הבהירים ביותר והגדר את מהירות הסריקה כך שהפרטים יהיו גלויים. בתוכנת המיקרוסקופ, התאם את הבהירות והניגודיות על ידי התבוננות קפדנית בהיסטוגרמה כדי לשמור על כל הפיקסלים בטווח הדינמי. עשו את אותו הדבר עבור האזורים והתכונות הכהים ביותר.

חזור לאזור הבהיר ובדוק שוב כך שיהיה מקום משני צידי ההיסטוגרמה. עבור שלבים 4 6 עד 4 8, התאמת הבהירות והניגודיות צריכה להיעשות בזהירות רבה כך שכל האזור יהיה בטווח הדינמי. הקטינו את התצוגה כך שהאזור השלם לסריקה יתאים לחלון הדמיון והתחילו את תוכנית רכישת השטח הגדול.

לאחר מכן השתמש באפשרות האשף כדי להגדיר פסיפס על ידי בחירת אזור מהמסך. השתמש בגודל פיקסל של שניים עד חמישה ננומטרים, בהתאם לפרטים הדרושים, והגדר זמן שהייה של שלוש מיקרו-שניות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, או STEM. לחץ על אופטימיזציה כדי לבדוק את הגדרות המיקרוסקופ והזמן הדרוש יוצג.

לאחר מכן הפעל שוב את מחולל הסריקה החיצוני ולחץ על המשך. כדי לנתח את נתוני ה-STEM, פתח תוכנית להצגת קבצי EM בקנה מידה גדול ופתח את הקובץ שנקרא mosaic info, שיפתח את קבצי ה-tif באריחים. בחר באפשרות תפירה אוטומטית של כל הפסיפס ובחר את הפרמטרים הבאים:מצב חפיפה שווה לחצי, סף התפירה שווה ל-0.90 והפחתת רעש שווה לאוטומטית.

אם לא ניתן לעמוד בקריטריונים לתפירה, הגדל את התצוגה ומקם את האריח במקומו באופן ידני ולחץ על Continue As Is.ייצא את הנתונים כקובץ HTML או כקובץ יחיד. כללו את גודל הפיקסלים הסופי ואת שם הקובץ כדי לאפשר מדידות במועד מאוחר יותר, ולאחר מכן נתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, ננוטומיה של קטעי מוח בקרה חושפת מאפיינים אולטרה-מבניים אופייניים של רקמה עצבית של המוח הקדמי הרוסטרלי כולל צרורות סיבי ריח, גרעינים עצביים ותתי תאים עצביים כולל סינפסות.

כאן, מבנים תת-תאיים כוללים מורפולוגיות גרעיניות ומוקדים שונים בסוגי תאים ואברונים שונים כולל מנגנון גולגי, רשתית אנדופלזמית, מיטוכונדריה, שלפוחיות סינפטיות וצפיפות פוסט-סינפטית. באופן בלתי צפוי, גרעיני התאים המצפים את החדר צפופים מאוד באלקטרונים בהשוואה לתאים אחרים המפוזרים לרוחב יותר במוח. במיקרוגליה, הגרעינים מראים גם מוקדים כהים, אולי הטרוכרומטין, שנעדרים בתאים אחרים במוח.

תמונה זו מ-EM בקנה מידה גדול של חתך עטרה בזחל דג זברה שעובר אבלציה עצבית חושפת מיקרוגליה פגוציטית. בתאים אלה נמצאו גם מאפיינים האופייניים למיקרוגליה בתאי יונקים, כולל מנגנון גולגי בולט ותכלילים רבים כגון ליזוזומים. לאחר השליטה, ניתן לבצע רכישה תוך יום, כאשר EM מסורתי יעלה לך לפחות שבוע.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שמפעיל מיקרוסקופ ימלא תפקיד מכריע בהשגת תמונות באיכות גבוהה. זו לא רק טכניקה של לחיצת כפתור. כעת יישמנו ננוטומיה לא רק על מודל דג הזברה של ניוון עצבי, אלא גם השתמשנו בה לתיוג חיסוני של תאים ולחקר רקמות של זבובים, רקמות אנושיות ועוד.

טכניקה זו סוללת את הדרך לכל חוקר בכל תחום. הם יכולים לבקר שוב במערכי הנתונים באינטרנט nanotomy.org. לאחר מכן הם יכולים לחקור שינויים משוערים, החל מקנה מידה ננומטרי ועד מילימטר וכל המודלים שנבדקו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם ננו-טומיה על שאלת המחקר שלך ועל מערכת התאים או הרקמות שאתה חוקר. אל תשכח, רק איש מקצוע צריך לעשות הכנת דגימה בגלל הריאגנטים הרעילים והשיקול האתי, אבל כל אחד יכול לנסות את האתר nanotomy. בבית.