Name: קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למד אוטורדיוגרפיה של קולטנים לוויזואליזציה וכימות של קולטני אנגיוטנסין II במוח העכברוש. שיטה זו מאפשרת זיהוי אזורי מוח המושפעים מהורמון, עם יישומים במחקר נוירודגנרטיבי וקרדיובסקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant HL-113905

הנהלים כל חיה שהתקיימו לצורכי מחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של נובה אוניברסיטת מזרח בהסכמה עם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, 8 מהדורה עשירית (סוכנות הידיעות האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 2011 ). 1. סעיפי רקמות הכנות לקראת קולטן autoradiography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקרבה, רקמות המוח הקציר טרי, ועוטפים בנייר אלומיניום ומכניסים -20 ° C במקפיא בהקדם האפשרי. כדי לשמור על הצורה הנכונה, למקם את המוח בתוך תבנית המוח המדמה את החלק הפנימי של הגולגולת, לעטוף בנייר אלומיניום ומכניסים - 20 ° C במקפיא. לאחר 30 דקות, רקמות מקום בתוך שקית אחסון במקפיא סגר ולעבור במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את דגימת רקמות הקפואה של עניין מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס, ולהעביר cryostat להגדיר עד למינימום של 10 מעלות צלזיוס לכל היותר -18 ° C, כדי למנוע הפשרה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הדגימה על מרקמם הר עם גליקול ובינוני הטבעה מבוססת שרף, הטמעה רק חלק קטן של הדגימה לתוך המדיום. עבור מוח, המוח הוא רכוב אנכי כדי לאפשר חתך במישור העטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת הר על microtome בתוך cryostat והדק במקומו. ודא צד שמאל וימין של המוח נמצאים באותו הקואורדינטות אנטרו-postero, וכי הציר dorso- הגחון הוא בניצב אטלסים המוח נפוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך ב לעובי הרצוי (20 מיקרומטר מומלץ) ולהפשיר הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי יש שטח פנים גדול יותר של שטח בשקופית. אסוף חלקים על גבי שקופיות בסטים רציפים של חמש, כלומר את הסט הראשון של שקופיות מסומנים 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, ו 1-5 (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מילוי קבוצה של שקופיות עם קטעים, לאפשר שקופיות לייבוש באוויר עד שעה 1, ולאחר מכן למקם את SLIdes בתיבת שקופיות פלסטיק בשקית אחסון במקפיא עצמית איטום, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. קולטן autoradiography זהירות: רדיואקטיביות. השתמש לבוש מגן לטפל רדיואקטיביות. המיועדת לסילוק תלוי ממסד, והן חייב לציית להנחיות להירקב כמו שצריך (זמן מחצית חיים 60 ימים) או להיות נטל על ידי חברה מוסמכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את &quot;-1&quot; ו &quot;-2&quot; שקופיות של עניין מהמקפיא -20 ° C ו הר לתוך אוחז שקופיות (איור 5). הר השקופיות &quot;-1&quot; יחד לטיפול &quot;הלא ספציפי&quot;, ואת השקופיות &quot;-2&quot; לטיפול &quot;הכולל&quot;. &#39;שאינן ספציפיות &quot;צנצנות תכלנה 10 מיקרומטר ריכוזיות סופי של PD123319 AT 2 אנטגוניסט R, ו Losartan AT 1 אנטגוניסט R, במאגר בינוני assay (AM5) (טבלה 1), את&#39; הכוללים &#39;צנצנות מחייב תכלנה רק 10 מיקרומטר PD123319 ב AM5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את השקופיתאוחז למקם את השקופיות לתוך צנצנות Coplin מראש הדגירה מלאים 35-40 מ&quot;ל של AM5, ומעכבי בהתאמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התחל סטים עוקבים באמבט טרום הדגירה שלהם ב 4 מרווחי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר שקופיות מפתרון הדגירה מראש כדי הדיוורים שקופיות הדגירה, המכיל 10 מ&quot;ל של AM5, בתוספת ריכוז קבוע מראש של 125 I-SI-אנג השנייה (מחושב באיור 4) עם מעכבי בהתאמה, עבור 60-90 דקות ב חדר טֶמפֶּרָטוּרָה. אם יש radioligand מספיק, 10 מגלשות ניתן למקם (BACK TO BACK) ב אוחז שקופיות שונה וטופחו עם 125 I-SI-אנג השנייה בצנצנות Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק בחזרה לתוך אוחז שקופיות (במידת הצורך), כתם, ולשטוף ידי מתערבל בעדינות במשך 1-2 שניות ב -400 מ&quot;ל מים מזוקקים בשני מיכלים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות ברצף לארבע צנצנות Coplin המכיל 35-40 מ&quot;ל של AM5 בדיוק 1 דקות כל אחד (כפי שמודגם באיור 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה 1 דק &#39;האחרון, בעדינות מערבולת בסעיפים 1-2 שניות בארבעה שינויים של מים מזוקקים קרים כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את השקופיות עם אוויר קריר (זהירות: אוויר חם volatizes במתחם רדיואקטיבי) באמצעות ארבעה מייבשי שיער להגדיר מזוויות שונות למשך 4 דקות (איור 5), עד שכל החלקים יבשים, ואז למקם על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות עם רקמות פונות כלפי מעלה על גבי קרטון עבור פרד לסרטו רנטגן באמצעות סרט דו צדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אחד לפחות, כיול יוד 125 שקופית סטנדרטית על כל קרטון (איור 6). הערה: סטנדרטים כיול מורכב להדביק המוח מעורב באופן יסודי עם 125 יוד חייב תרכובת המכילה טבעת פנול, נדחס על ידי צנטריפוגה בתוך מזרק טוברקולין 1 מ&quot;ל, כי הם cryostat מחולק באותו עובי כמו חלקים במוח להפשיר רכוב על גבי מיקרוסקופ שקופיות. לחלופין, 125 תקנים כיול לי בשרף פלסטיק מחולק על 20 עובי מיקרומטר ניתן להשיג באופן מסחרי. שרף הפלסטיק בתקנים אלו חלקית מגן הסרט מן הקרינה כזו כי שקילות רקמות של ~ 40% צריכות להיות בחשבון את הכיול. </li></ol> חשיפת קולנוע 3. ופיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חושך עם סרט קלטת autoradiography רצועת גב רנטגן. פתח את הקלטת ומקום הקרטון עם מגלשות בפנים (איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את האור ולהדליק את safelight. בזהירות לפתוח את קופסא סרט X-Ray, להסיר סרט אחד, ומניח את צד מבריק סרט מעלה (עם הקצה המשונן על בפינה הימנית התחתונה) על גבי שקופיות הקלטת. בזהירות לסגור את הקלטת, ולסובב את סורגי הנעילה לאטום את האור (איור 6). לחשוף את השקופיות עבור מספר ימים עד מספר שבועות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר החושך, לפתוח את הקלטת ולהמשיך עם proc מפתח הסרטESS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את השקופיות במגשים ברציפות; יזם למשך 2 דקות, מים המכילים חומצה אצטית קרחונית 5% למשך 30 שניות, ו מסדר למשך 5 דקות. הסרטים הם מכניסים מגש עם מים זורמים במשך 20 דקות, ולאחר מכן להציב לתוך Photoflo לא יותר מ -10 שניות ותלה. הערה: זמן החשיפה נקבע באופן אמפירי יכול לערב סרטים מרובים עם זמני חשיפה שונים: מספיק זמן כדי לקבל אותות מדידים מאזורים עם נמוך מחייב, אבל לא כל עוד להרוות את הסרט לפי תחומים עם גבוה מחייב. לאחר מתקבלות חשיפות מקובלות, ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. </li></ol></li></ol> 4. היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את הכתם thionin ריאגנטים מכתים (טבלה 2, איור 7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות &quot;-3&quot; במעמד שקופיות, והעברת בסדר רציף החל מים ללא יונים 1 דקות, ואז thionin פתרון כתם במשך 10 דקות ולאחריה שלושה מטבלים לתוך Deionמי ized, לשטוף אחד 30 שניות במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות המים, מניחים את מתלה להחליק לתוך שוטף אתנול כדלקמן; 50%, 70%, ו -90% למשך 30 שניות, ואחריו שני שוטף אתנול ב -100% עבור 1 דקות כל אחד. לבסוף, הניחו את מתלה להחליק לתוך קסילן במשך 3 דקות, ולאחר מכן להעביר לידי פתרון קסילן השני במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית אחת בכל פעם מאמבטית קסילן האחרונה, ולכסות את הקצה העליון של השקופית עם בסיס שרף במדיום הרכבה ממס אורגני, ומקום coverslip 24 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ לשקופית. אפשר שקופיות יבשות מספיק עבור ~ 48 שעות ולאחר מכן סרוק למחשב ב- 2400 בגווני אפור dpi. </li></ol> 5. ניתוח תמונה densitometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צד מבריק סרט למטה, עם הקצה המשונן על הפינה השמאלית התחתונה ולסרוק באמצעות סורק קניינית מסוגל לשדר את מידע צפיפות סרט ללא כל עיוות במחשב מערכת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את sys הדמית הקנייניםTEM ולנצל הסורגים כיול לקבוע כללים כיול לניתוח densitometric העתיד של התמונות על הסרט (איורים 9 - 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזורי מידה של עניין או על ידי הקמת תבנית או אמפירי אשר מתווה את תחומי העניין. נתונים נאספו והפרידו מבוסס על סרט, או שליטה או סוג בר (פסק), ובאזור. הקפד לכלול צפיפות (fmol / g), אזור הסריקה, ואזור היעד הכולל במדידות (איור 9). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ברי אזור סריקה ידי והבטיח כי האזור של עניין נופל בין פרמטרים של הדגשה (איור 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא לתוך גיליון אלקטרוני (לוח 4). הכפל את פעמי הצפיפות באזור היעד הכולל, ולאחר מכן חלק את אזור הסריקה על מנת לקבל את הערך עבור המחייב כי אזור מסוים. ברגע שזה נעשה לכל הערכים שנמדדו, למצע לדגמים הקיימים שאינם ספציפיים ממניין להניב הספציפי מחייב pלְהִתְרַעֵם. ממוצעים עשויים גם להתבצע על ערכים אלה. </li></ol></li></ol>

רוברט ספת' העניק רישיון לנוגדנים לקולטני אנגיוטנסין II לספק מסחרי ומקבל תמלוגים ממכירת הנוגדנים האמורים. לכותבים האחרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של &#39;הכולל&#39; ו &#39;הלא ספציפי &quot;מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioligand. הנהלים התואר בתוך הפרוטוקול פשוטים הניתוח הוא קריטי עבור בפירוש תוצאות כראוי. 20 מיקרומטר העובי היה נחוש בדעתו להיות אופטימלי; אם הסעיף עבה מדי הלא ספציפי המחייב יגדל, ולכן קשה לפתור את...

מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) 2-8. ראס הוא המערכת ההורמונלית, כי הוא מופעל כאשר תאים juxtaglomerular של הכליה להפריש רנין לתוך זרם הדם בתגובה וירידה בלחץ דם, גדל sympatגירוי hetic, או ירידה בזרימת נתרן ידי Densa המקולה. רנין חילוף החומרים angiotensinogen (מסונתז בכבד) כדי ליצור אנגיוטנסין I (אנג לי). אנג לי עובר מטבוליזם מכן על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין (ACE), גידול ectoenzyme בצד luminal של תאי האנדותל של כלי הדם, בעיקר הריאות והכליות, כדי ליצור אנגיוטנסין II (אנג II), הפפטיד מפעיל הראשי של RAS. אנג II הוא מסוגל הפעלת שתי תת קולטן; הקולטן מסוג 1 (AT 1 R) לבין הקולטן מסוג 2 (AT 2 R), הן המסדירות את מערכת הלב וכלי הדם, לשמור על הומאוסטזיס נוזלים ואלקטרוליטים ו נחשבים כיום להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי ומחלות ניווניות מעבדת 8,9. RAS מקומי, מוח ספציפי מדווח באופן עצמאי לסנתז אנג שנייה. בשנת המוח, angiotensinogen חלבון מבשר הוא מסונתז astroglia 10 מומר אנג לי על ידי אנזים רנין דמוי 3, ואולי כבול prorenin לקולטן prorenin11, ולאחר מכן להמיר אנג השנייה על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין אשר מבוטא בשפע על פני השטח התאיים של נוירונים במוח 12. Intrabrain זה שנוצר אנג II הוא אגוניסט למוח AT 1 ו- AT 2 קולטנים מבודדים השנייה אנג שמקורן בדם. בעוד AT 1 R ממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב, זה ידוע יותר עבור אפקטים pathophysiological שלה בכל הגוף, המשפיעים על מערכת הלב וכלי הדם בעיקר והכליות (איור 2). כאשר אנג II נקשר R 1 AT, שהיא גורמת vasoconstriction; הגדלת התנגדות לזרימת דם והעלאת לחץ דם. זה גם מקדם סינתזה הפרשת אלדוסטרון ווסופרסין, שמוביל נתרן מוגברת החזקת מים. תופעות אלה יכולים גם לגרום נזק מוחי איסכמי וליקויים קוגניטיביים והיא צמודה מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ואת diabetes, כמו גם להיות זיהו באחרונה להשפיע למידה וזיכרון 13-15. יש לולאת משוב בשכונת ראס באותה AT 1 R על תאי juxtaglomerular בכליות מעכב הפרשת רנין. מעניין לציין, כי R AT 2 בדרך כלל נגד מווסת את הפעולה של AT 1 R, גרימת התרחבות, תולדה neurite, התחדשות axonal, אנטי התפשטות, cerebroprotection בקרב רבים אחרים 16-20. ה- R AT 2 גם זוהה כיעד אנטי יתר לחץ דם ולאחרונה, תרופות אנטי-סרטני 21. קביעת לוקליזציה הצפיפות של קולטנים אנג השניים בתוך רקמות שונות וכיצד הם מושפעים טיפולים שונים ומצבי המחלה באמצעות autoradiography קולטן densitometric כמותית יעזור לחשוף את התפקיד RAS משחק במחלות ספציפיות. autoradiography קולטן שימש במשך למעלה מ -30 שנה כשיטה יעילה עבור המעידים על נוכחות של אנגיוטנסין Iאני קולטנים ורכיבים אחרים של RAS במוח וברקמות אחרות של חולדה, עכבר, שרקן, הכלב האנושי תחת מגוון רחב של תנאי הניסוי 22-34. החשיבות של איתור קולטנים השני אנג בתוך המוח היא שאפשר להחיל הנוירואנטומיה פונקציונלי לפעולות של אנג השנייה במוח, למשל, הנוכחות של R AT 1 בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) מציעה פונקציה של אנג שני במוח כדי לעורר וזופרסין, אוקסיטוצין או שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH) שחרור, או הפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית. לכן, תרופות החוסמות את R AT 1 עשויות להקטין כמה תופעות PVN בתיווך אלה הקשורים על פעילות של RAS המוח. תוצרת בעיבוד מראה שהשימוש של AT 1 יריבי R יכול להקטין הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) שחרור -induced של CRH ו לשפר את הסימפטומים של PTSD (Hurt et al., שהוגש לפרסום). PVN, subfornicalהאיבר (SFO), ו האמיגדלה ידוע להסדרת הומאוסטזיס, תיאבון / צמא, שינה, זיכרון, תגובות רגשיות, והם בתחומי היעד של מחקר הפגנה הזאת. אזורים אלה נבחנו על ידי איסוף חלקי עטרה של מוח על שקופיות מיקרוסקופ, וטיפול הקטעים עם מעכבים ספציפיים יחד עם radioligand ספציפי לקולטניים אנג השני. במחקר זה, כל החומרים ריאגנטים יחד עם ספקים הציעו מפורטים, יוד-125 שמשו radiolabel אנטגוניסט לקולטן אנג השנייה, sarcosine 1, isoleucine 8 אנג שני (SI אנג II), אשר היה מטוהר אז כמו שאני מוניתי 125 -SI אנג II באמצעות שיטות HPLC כפי שתואר לעיל 35. השימוש radioligand פעילות ספציפית גבוהה זה מאפשר הדמיה של תחומי צפיפות קולטני נמוך, בינוני וגבוה לאחר חשיפה של חלקים רדיואקטיבי כדי הסרט רנטגן. על ידי כיול הסרט לתקני רסק מוח המכילים לסכומים ידועים של יוד-125, הסכום המבוקששל קולטן אנג השני מחייב בשטח ניתן לכמת. במחקרים ניסיוניים, הקולטן אנג השנייה מחייב במוחם של הנבדקים הניסוי ניתן בהשוואה לזו במוחם של נבדקים בריאים. זה יכול לציין אם הפעולות של אנג שנייה הם שינו בתגובת מחלה גנטית, נורמליות פנוטיפי, מצב מחלה או טיפול תרופתי. ידע זה יכול להיות מיושם על הפיתוח של טיפולים לטיפול במחלות הקשורות חוסר ויסות של RAS. טכניקות חלופיות המזהות קולטן אתרי קישור, אבל עם רזולוציה אנטומיים מופחתת, מחייבות מבחנים המשתמשות הכנות קרום רקמות נגזרות homogenates רקמות, אשר מודגרת עם radioligand על פני טווח של ריכוזיים להעריך זיקה מחייבת radioligand כמו הקבוע דיסוציאציה (K D ) וקיבולת מחייב מקסימלי (מקסימום B) של הרקמה של עניין. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות שבור למטה לתוך 5 שיתוף גדולmponents: הכנת סעיפי רקמות עבור קולטן autoradiography; קולטן autoradiography; חשיפה לקולנוע פיתוח; היסטולוגיה; ניתוח תמונה densitometric.

<table><tbody><tr><td>500 מ"ל כוסות פלסטיק</td><td>פישר</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 מ"מ x 60 מ"מ כיסויים</td><td>פישר</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>סרט הדמיה אוטורדיוגרפיה 24 מ"מ x 30 ס"מ</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (מ- Bacillus licheniformis)</td> <td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>גיליון קרטון 8 x 11</td><td>לוח איור סהר #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>צנצנות קופלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>מייבשי שיער מסחריים</td><td>Conair</td><td>דגם SD6X</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית חד פעמיים</td><td>פישר</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (מלח דיסודיום, דיהידרט)</td> <td>תאגיד USB</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תחליף נוסחאות לצלמי מפתחי D-19</td><td>Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>פישר</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep / OCT</td><td>פישר</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>מתקן סרטים</td><td>קודאק</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>צילום פלו</td><td>קודאק</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>לוסרטן</td><td>פישר / טוקריס</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&סחר; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>אחיזת שקופיות Peel-A-Way</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות טעונות פרימיום, שקופיות</td><td>מיקרוסקופ Premiere Edge Fine</td> Ground <td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I ליגנדים</td><td>פרקין אלמר</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון</td><td>רדיו-יוד על ידי ד"ר ספת'</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיילרס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דו-בסיסי פוספט נטול מים (Na2PO4)</td> <td>פישר</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט (נטול מים)</td><td>פישר</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>תיונין&nbsp;</td><td>פישר</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>קלטת רנטגן (10 x 12)</td><td>תאגיד ספקטרוניקס</td><td>ארבע מרובעות</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין ii רצפטורים

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic. דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת 125 I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: &quot;הלא ספציפיות מחייבים&quot; (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT 1 תת סוג קולטן אנג השני (AT 1 R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו &#39;סה&quot;כ מחייב &quot;ללא AT אנטגוניסט R 1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT 2 אנג השנייה (AT 2 R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל 125 I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT 1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות &#39;סה&quot;כ מחייב&#39; שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם 125 I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור &#39;להסתכם מחייב&#39;, ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה &#39;שוטף&#39; חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית. היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.

בראייה כוללת של המסלול מהטבולים של מערכת רנין-אנגיוטנסין מוצגת באיור 1 והפוקוס הישיר על תת קולטן אנגיוטנסין II (AT 1 R ו- AT 2 R) מתואר באיור 2. איור 3 מציג את העברת מוח עטרה חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ, אשר לאחר מכן מנוהלים באמצעות הליך autoradiography הקולטן באמצעות ריכוז קבוע מראש 125 I-סיאנג השנייה כפי שניתן לראות באיור 4. איור 5</str...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיאור לוקליזציה של קולטני אנגיוטנסין II מסוג 1 במוח החולדה על ידי אוטורדיוגרפיה כמותית, דנסיטומטרית, קולטן במבחנה באמצעות אנלוגי יוד-125 של אנגיוטנסין II.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאתר באופן אנטומי ולכמת את הביטוי של קולטני Angiotensin II בחתכי מוח, תוך שימוש ב-Receptor Autoradiography ובזיהוי היסטולוגי של מבני המוח. שיטה זו מזהה את אזורי המוח שבהם Angiotensin II משפיע על ההתנהגות, על התפקוד הקוגניטיבי ועל מערכת הלב וכלי הדם, ובכך מספקת תובנות לפיתוח טיפולים חדשניים למחלות ניווניות של מערכת העצבים ומחלות לב וכלי דם. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם היותה כמותית ואיכותית, והיא מאפשרת זיהוי של קולטנים תפקודיים עבור Angiotensin II בספציפיות גבוהה יותר מאשר שיטות אחרות.שיטה זו יכולה לאפיין גם את התפקוד של מערכות קולטני הורמונים אחרות ברחבי הגוף, כגון קולטנים הקשורים לסמי drugs of abuse. מיד לאחר הקצירה, מקמו את רקמות המוח בתבניות מוח המדמות את פנים הגולגולת ועטפו את התבניות בנייר אלומיניום לאחסון בטמפרטורה של -20 °C. לאחר 30 דקות, העבירו את הרקמות לשקית אחסון אטומה למקפיא ואחסנו את השקית בטמפרטורה של -80 °C.לפני החיתוך, הוצא בעדינות את המוח מתבנית המוח. כדי לחתוך את רקמת המוח, העבר את הדגימה הרלוונטית לקריוסטט המכוון לטמפרטורה שבין 10- ל-18- מעלות צלזיוס. לאחר שהרקמה הגיעה לשיווי משקל עם הטמפרטורה החדשה, השתמש בתווך המבוסס על גליקול ושרף כדי להטמיע אנכית חלק קטן מהדגימה בתוך תושבת רקמה (tissue mount) כדי לאפשר חיתוך של המישור הקורונלי.טענו את הרקמה למיקרוטום והדקו היטב את התושבת במקומה, לאחר מכן התחילו בחיתוך המוח בעובי הרצוי, ולאחר מכן העבירו את החתכים למשקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי כדי להשכיב שטח פנים גדול יותר של הרקמה על המשקופית. אספו את החתכים בסטים רצופים של חמישה. כאשר כל החתכים נאספו, הניחו למשקופיות להתייבש באוויר למשך עד שעה אחת.לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתוך קופסת סליידרים מפלסטיק בתוך שקית הקפאה עם סגירה עצמית לאחסון בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לצורך סימון רדיואקטיבי של הדגימות, הוציאו את הסליידרים הראשון והשני מכל קבוצה של חמישה והרכיבו אותם בתוך תפסני סליידרים זמינים מסחרית או מודפסי תלת-ממד. הסליידרים המסומנים ב-1 מיועדים לקבוצת הטיפול לא-ספציפי, והסליידרים המסומנים ב-2 מיועדים לקבוצת הטיפול הכולל.הפוך את השקופיות לתוך 35 עד 40 מיליליטר של AM5 בטמפרטורת החדר בתוספת המעכבים המתאימים להם, בתוך צנצנות קופלין (Coplin jars) מתאימות להקדמה. עבודה עם מספר רב של סטים של שקופיות עלולה להיות מכבידה. לכן, קריטי ביותר להניח את השקופיות בצנצנות ההקדמה במרווחים של ארבע דקות, כדי להבטיח שלא תהיה חפיפה במהלך שלב הייבוש.לאחר 30 דקות, העבירו את השקופיות למגשי דגירה לשקופיות המכילים 10 milliliters של AM5 מועשר בריכוז המתאים של I125 SI Angiotensin II ובמעכבים של קבוצת הטיפול הרלוונטית למשך 60 עד 90 דקות בטמפרטורת החדר. קביעת הריכוז המדויק של 125I SI Ang II היא קריטית כדי לאפשר השוואה של קולטני Angiotensin II מיום ליום. בסיום הדגירה, החזירו את השקופיות לתפסני השקופיות, חסמו את השקופיות, וסובבו אותן בעדינות למשך שנייה אחת עד שתיים בשני מכלים נפרדים של 400 milliliters של מים מזוקקים.לאחר שטיפת המים השנייה, שטפו את השקופיות בארבעה שטיפות רצופות של דקה אחת ב-30 עד 40 milliliters של AM5. לאחר השטיפה הרביעית, סובבו בעדינות את הנגדים למשך אחת עד שתיים שניות בארבעה החלפות של מים מזוקקים קרים מאוד. לאחר מכן, השתמשו בארבעה מייבשי אוויר המכוונים בזוויות שונות כדי לייבש את השקופיות באוויר קר למשך ארבע דקות.כאשר כל החתכים יבשים, העבירו את השקופיות למגבת נייר. לאחר מכן, השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי להצמיד את השקופיות, כאשר צד הרקמה פונה כלפי מעלה, לחתיכת קרטון עבור סרט רנטגן במיקום הכולל לפחות שקופית תקן כיול של iodine 125 אחת לכל קבוצה. כדי לחשוף את החתכים לסרט, הניחו בחדר חשוך את השקופיות שעל הקרטון בתוך קסטת רנטגן עם רצועת הידוק (strap back) וכבו את האורות.הדליקו את תאורת הבטוח ופתחו בזהירות קופסת סרטי רנטגן. הניחו סרט אחד, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מעלה והקצה המשונן נמצא בפינה הימנית התחתונה, מעל השקופיות בתוך הקסטה. לאחר מכן, סגרו בזהירות את הקסטה תוך סיבוב מוטות הנעילה כדי למנוע חדירת אור, ואחסנו את הקסטה בטמפרטורה של minus 20 degrees celsius.לאחר תקופת החשיפה המתאימה, העבירו את הסרט לתמיסת מפתח למשך שתי דקות, לאחר מכן למשך 30 שניות לאמבט עצירה, מים מזוקקים פעמיים עם חומצה אצטית, ולאחר מכן למשך חמש דקות לתמיסת מקבע. שטפו את הסרט במגש של מים זורמים למשך 20 דקות. העבירו אותו לחומר פעילי שטח למשך כ-10 שניות ותלו את הסרט לייבוש.לצורך ניתוח היסטולוגי של חתכי רקמת המוח, הפשיתו את שלושת החתכים במעמד לשקפיות. לאחר מכן, שטפו את החתכים במים דה-יוניים למשך דקה אחת, ולאחר מכן בצעו אינקובציה של 10 דקות בתמיסת צבע thionin ושלוש טבילות במיכל של מים דה-יוניים. השקיעו את השקפיות לשטיפה נוספת של 30 שניות במים דה-יוניים.לאחר מכן, שטפו את השקופיות בשטיפות אתנול רצופות כפי שצוין. לאחר שטיפת ה-100% ethanol האחרונה, שטפו את השקופיות בשני מכלים של xylene למשך שלוש וחמש דקות בהתאמה. בסיום שטיפת ה-xylene השנייה, כסו את הקצה העליון של כל שקופית בנפרד באמצעות resin base, מדיום קיבוע מבוסס ממס אנאורגני.הצמידו לוחות כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר לסליידים והניחו לסליידים להתייבש במשך 48 שעות. לאחר מכן, סרקו את הסליידים ואת הסרטים למחשב ברזולוציה של 2400 DPI בגווני אפור. כדי לנתח את הסרט באמצעות דנסיטומטריה, לאחר הסריקה, סמנו באופן אמפירי את האזורים הרלוונטיים בכל סרט.זוהי תמונת פסאודו-צבע שנוצרה לאחר פתיחת הסרט הסרוק בתוכנה לניתוח תמונות. יש לכלול את הדנסיטי, שטח הסריקה ושטח המטרה הכולל במדידות. התאם את סרגלי שטח הסריקה כדי להבטיח שכל אזור עניין נמצא בתוך הפרמטרים של ההדגשה.לאחר מכן, ייצאו את הנתונים לגיליון אלקטרוני כדי לקבוע את הקישור הספציפי הקיים עבור כל דגימה. יחידות סטנדרט הכיול לצורך כימות נקבעות על סמך התאריך שבו בוצע המבחן. לאחר סריקת הסרטים, נעשה שימוש בערכי הכיול כדי להפיק עקומה המבוססת על ריכוזים משתנים של סטנדרטים של iodine 125 עבור אותו סרט ספציפי.ערכי הכיול והסטנדרט נרשמים בשלוש חזרות להבטחת הדיוק. ההבדלים בין הקשירה הבלתי ספציפית לקבוצות הכוללות, כמו גם סימוני הרקמות, נקבעים על ידי שיוך כל סט נתונים לתתי-הקבוצות המתאימות. יש להגדיר ערך סף גבוה יותר על ידי התאמת הפרמטרים מאדום לשחור, בעוד שערך הסף הנמוך יותר צריך להיקבע קרוב לאפס כדי לאפשר מדידה מדויקת יותר של כל אזור העניין שנסרק.לדוגמה, כאן מושווים השטחים הסופיים שנמדדו בגרעין הפראוונטריקולרי של ההיפותלמוס בקבוצות של קישור כולל לעומת קישור לא ספציפי, לחתך שנצבע בתיונין לצורך אישור אנטומי. קישור לא ספציפי הוא כמות הרדיוליגנד שנקשרה לקולטנים שאינם קולטני אנגיוטנסין בנוכחות של ריכוז רווי של ליגנד לא רדיואקטיבי לקולטן אנגיוטנסין I, בעוד שקישור כולל הוא כמות הרדיוליגנד שנקשרה בהיעדר ליגנד לא רדיואקטיבי לקולטן אנגיוטנסין I. ניתן לאחר מכן להחסיר את ערכי הקישור הלא ספציפי מערכי הקישור הכולל כדי לקבל את ערכי הקישור הספציפי עבור קולטני אנגיוטנסין I.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים את שלב האוטורדיוגרפיה של הרצפטורים בערך בארבע שעות, בעוד ששלב פיתוח הסרט אורך כ-30 דקות לכל סרט. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעקוב אחר הזמן כדי להבטיח שכל השקופיות יעברו אינקובציה, שטיפה וייבוש למשך פרק זמן מדויק ואחיד. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לערוך מחקרים נוספים של מורפולוגיית המוח כדי להעריך את השינויים בגודלן של האזורים המבטאים Angiotensin II Receptor.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרמקולוגיה של רצפטורים לקביעת האופן שבו אזורי מוח שונים מושפעים מנוירוהורמונים, נוירוטרנסמיטורים ותרופות שונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן הביצוע המוצלח של בדיקת אוטורדיוגרפיה של רצפטורים, הכנת שקופיות צבועות היסטולוגית, והערכת אוטורדיוגרמות לצורך מיקום רצפטורים באזורי מוח ספציפיים. זכרו כי עבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון נאות, בלימה, ניטור חשיפה ופינוי, כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי.

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לייעל את זיהוי immunofluorescent של קולטן אסטרוגן α (ERα) על פרוסות עכברוש pial עורקים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי immunofluorescent.

הדמיה של קולטן אסטרוגן α ב Arterioles Pial עכברוש באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי Immunofluorescent

הביקוש לאלקטרונים הפוכים ביואורתוגונליים Diels-Alder נרתמה ליצירת אסטרטגיית הדמיית PET יעילה ומודולרית לסרטן. בפרוטוקול זה, השלבים של מתודולוגיה זו מתוארים בהקשר של מערכת מודל המשתמשת בנוגדנים ממוקדים לסרטן המעי הגס huA33 ורדיוליגנד 64Cu.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

כתב יד זה מתאר את השימוש העכברים הטרנסגניים הכתב ואת נתיבי ממשל שונים של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II-induced יתר לחץ דם באמצעות מיקרוסקופ וידאו intravital של כלי הדם כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים שלהם היכולת לגלגל, לדבוק אנדותל.

להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

אינטגרין3 α βvהוא סוג של חלבון אדהזיה מתבטאת במיוחד בתאי אנדותל מופעל שעברו אנגיוגנזה. לכן, הערכת שלמות אינטגרין הוא עניין רב באונקולוגיה. כאן, אנחנו מציגים שיטה להכין 68התווית על-ידי Ga radiopeptides, שיטה להערכת יעילותו ביולוגי.

הכנת אספרטט גליצין התווית על-ידי Ga ארגינין (RGD) 68-פפטיד של אנגיוגנזה

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור  אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למדידת איזולבוגלנדינים ברקמות על ידי אימונופלואורסנציה באמצעות נוגדן ScFv D11 מצומד אלקליין פוספטאז. מודלים של יתר לחץ דם הן בעכברים והן בבני אדם משמשים כדי להסביר את ההליכים שלב אחר שלב ואת עקרונות היסוד הקשורים למדידת איזולבוגלנדין בדגימות רקמות.

זיהוי ישיר של איזולבוגלנדינים ברקמות באמצעות חלבון היתוך D11 scFv-אלקליין פוספטאז ואימונופלואורסנציה

במאמר זה, נבחן את המתודולוגיה שיקולים רלוונטיים פרוטוקול ה-FDA אישר טיפול בדיכאון באמצעות מכשיר NeuroStar Neuronetics TMS.

התקן TMS NeuroStar: ניהול ה-FDA פרוטוקול מאושר לטיפול דיכאון

וידאו השמעה היא טכניקה בשימוש נרחב התנהגות בעלי חיים. יצרנו תוכנית והערכה כי חל מבוססת כללים, השמעה אינטראקטיבית של 3-D אנימציות מחשב בתגובה בזמן אמת, נתונים אוטומטיים על התנהגות הנושא.

ניגון אוטומטי של וידאו אינטראקטיבי ללימודי תקשורת של בעלי חיים

למד אוטורדיוגרפיה של קולטנים לוויזואליזציה וכימות של קולטני אנגיוטנסין II במוח העכברוש. שיטה זו מאפשרת זיהוי אזורי מוח המושפעים מהורמון, עם יישומים במחקר נוירודגנרטיבי וקרדיובסקולרי.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

גלה סרטונים נוספים