קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקם ולכמת אנטומית את ביטוי קולטן אנגיוטנסין II בחלקי מוח באמצעות אוטורדיוגרפיה של קולטן וזיהוי היסטולוגי של מבני מוח. שיטה זו מזהה את אזורי המוח שבהם אנגיוטנסין II משפיע על ההתנהגות, התפקוד הקוגניטיבי ומערכת הלב וכלי הדם, ומספקת תובנות לפיתוח טיפולים חדשים לטיפול במחלות ניווניות ומחלות לב וכלי דם. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא כמותית, איכותית ומאפשרת זיהוי קולטנים פונקציונליים לאנגיוטנסין II עם ספציפיות רבה יותר משיטות אחרות.

שיטה זו יכולה גם לאפיין את הפונקציונליות של מערכות קולטני הורמונים אחרות בכל הגוף, כגון קולטנים הקשורים לתרופות להתעללות. מיד לאחר הקציר, הניחו את רקמות המוח בתבניות מוח המדמות את פנים הגולגולת ועטפו את התבניות בנייר אלומיניום לאחסון של מינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, העבירו את הרקמות לשקית אחסון מקפיא אטומה ואחסנו את השקית במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לפני החיתוך, הסר בעדינות את המוח מתבנית המוח. כדי לחתוך את רקמת המוח, העבירו את הדגימה המעניינת לסט קריוסטט בין מינוס 10 למינוס 18 מעלות צלזיוס. כאשר הרקמה מאוזנת לטמפרטורה החדשה, השתמש במדיום מבוסס גליקול ושרף כדי להטמיע אנכית חלק קטן מהדגימה לתוך תושבת רקמה כדי לאפשר חתך של מישור העטרה.

טען את הרקמה על המיקרוטום והדק היטב את התושבת במקומה, ואז התחל לחתוך את המוח בעובי הרצוי, ולאחר מכן הרכיב את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ בכיוון אנכי כדי להחיל שטח פנים גדול יותר של הרקמה על השקופית. אסוף את המקטעים בקבוצות עוקבות של חמישה. לאחר איסוף כל החלקים, הניחו למגלשות להתייבש באוויר עד שעה.

לאחר מכן הניחו את הדגימות בקופסת שקופיות מפלסטיק בשקית מקפיא אטומה עצמית לאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לתייג את הדגימות, הסר את השקופיות הראשונה והשנייה מכל סט של חמש והרכיב לאחיזות שקופיות זמינות מסחרית או מודפסות בתלת מימד. שקופיות המקף מיועדות לקבוצת הטיפול הלא ספציפית ושתי המגלשות המקיפות מיועדות לקבוצת הטיפול הכוללת.

הפוך את השקופיות ב-35 עד 40 מיליליטר של AM5 בטמפרטורת החדר בתוספת המעכבים שלהן בצנצנות קופלין המתאימות לפני הדגירה. הפעלת סטים מרובים של שקופיות יכולה להיות מכריעה. לכן זה קריטי ביותר למקם את השקופיות בצנצנות לפני הדגירה במרווחים של ארבע דקות כדי לוודא שאין חפיפה בשלב הייבוש.

לאחר 30 דקות, העבירו את השקופיות לדיוור שקופיות דגירה המכילים 10 מיליליטר של AM5 בתוספת ריכוז מתאים של I125 SI Angiotensin II ומעכבי קבוצת הטיפול המתאימים למשך 60 עד 90 דקות בטמפרטורת החדר. קביעת הריכוז המדויק של 125I SI Ang II היא קריטית כדי לאפשר להשוות את קולטני האנגיוטנסין II מיום אחד למשנהו. בתום הדגירה, החזירו את המגלשות לאחיזת המגלשות, חסמו את המגלשות וסובבו אותן בעדינות למשך שנייה עד שתיים בשני מיכלים נפרדים של 400 מיליליטר מים מזוקקים.

לאחר שטיפת המים השנייה, שטפו את המגלשות בארבע שטיפות רצופות של דקה אחת ב-30 עד 40 מיליליטר של AM5. לאחר הכביסה הרביעית, סובבו בעדינות את החלקים למשך שנייה עד שתיים בארבעה החלפות של מים מזוקקים קרים כקרח. לאחר מכן השתמש בארבעה מייבשי שיער המוגדרים בזוויות שונות כדי לייבש את המגלשות באוויר קריר למשך ארבע דקות.

כאשר כל החלקים יבשים, העבירו את השקופיות על מגבת נייר. לאחר מכן השתמש בסרט דו צדדי כדי להרכיב את השקופיות, עם צד הרקמה כלפי מעלה, על פיסת קרטון לסרט רנטגן במיקום וכולל לפחות שקופית סטנדרטית אחת של כיול יוד 125 לכל קבוצה. כדי לחשוף את החלקים, בחדר חשוך, הנח את שקופיות הקרטון בתוך קלטת רנטגן אחורית וכבה את האורות.

הפעל את האור הבטוח ופתח בזהירות קופסה של סרט רנטגן. הניחו סרט אחד, הצד המבריק כלפי מעלה עם הקצה המשונן בפינה הימנית התחתונה על גבי השקופיות בקלטת. לאחר מכן סגור בזהירות את הקסטה כשמוטות הנעילה מעוותים כדי לאטום את האור ולאחסן את הקסטה במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר תקופת החשיפה המתאימה, העבירו את הסרט לתמיסת מפתח למשך שתי דקות ולאחר מכן 30 שניות באמבט עצירה, מים מזוקקים פעמיים עם חומצה אצטית ולאחר מכן חמש דקות בתמיסת קיבוע. שוטפים את הסרט במגש מים זורמים למשך 20 דקות. העבירו אותו למשטח למשך כ-10 שניות ותלו את הסרט לייבוש.

לניתוח היסטולוגי של חלקי רקמת המוח, הפשירו את לוח המחוונים שלושה חלקים במתלה שקופיות. לאחר מכן, שטפו את החלקים במים נטולי יונים למשך דקה אחת ולאחר מכן דגירה של 10 דקות בתמיסת כתמי תיונין ושלוש טבילות במיכל מים נטול יונים אחד. טבלו את המגלשות לשטיפת מים נטולת יונים נוספת של 30 שניות.

לאחר מכן שטפו את השקופיות בשטיפות אתנול ברצף כפי שמצוין. לאחר שטיפת האתנול האחרונה של 100%, שטפו את השקופיות בשני מיכלי קסילן במשך שלוש וחמש דקות ברציפות. בסוף שטיפת הקסילן השנייה, מכסים את הקצה העליון של שקופית אחת בכל פעם בבסיס שרף, מדיום הרכבה ממס אנאורגני.

הרכיבו כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר על המגלשות והניחו למגלשות להתייבש במשך 48 שעות. לאחר מכן סרוק את השקופיות והסרט למחשב בגווני אפור של 2400 DPI. לנתח את הסרט לפי דנסיטומטריה, לאחר סריקה, לשרטט באופן אמפירי את תחומי העניין בכל סרט.

זוהי התמונה הפסאודו-צבעונית שנוצרת לאחר פתיחת הסרט הסרוק בתוכנית ניתוח התמונה. כלול את הצפיפות, שטח הסריקה ושטח היעד הכולל במדידות. התאימו את סרגלי אזור הסריקה כדי להבטיח שכל אזור עניין נמצא בין הפרמטרים של הסימון.

לאחר מכן ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני כדי לקבוע את הכריכה הספציפית הקיימת עבור כל דגימה. יחידות תקן כיול לכימות נקבעות על סמך תאריך ביצוע הבדיקה. לאחר סריקת הסרטים, ערכי הכיול משמשים ליצירת עקומה המבוססת על הריכוזים המשתנים של יוד 125 תקנים עבור אותו סרט ספציפי.

הכיול והערכים הסטנדרטיים נרשמים בשלושה עותקים לדיוק. ההבדלים בין הקישור הלא ספציפי לסך הקבוצות כמו גם תוויות הרקמות נקבעים על ידי הקצאת כל סט נתונים לתת-הקבוצות המתאימות. יש להגדיר ערך סף גבוה יותר על ידי התאמת הפרמטרים מאדום לשחור ואילו את ערך הסף התחתון יש להגדיר קרוב לאפס כדי לאפשר מדידה מדויקת יותר של כל אזור העניין הסרוק.

לדוגמה, כאן משווים את האזורים הנמדדים הסופיים של הגרעין הפרה-חדרי של ההיפותלמוס בסך הכל לעומת קבוצות הקישור הלא ספציפיות לקטע מוכתם בתיונין לאישור אנטומי. קשירה לא ספציפית היא כמות הרדיו-ליגנד הקשור לקולטנים שאינם אנגיוטנסין בנוכחות ריכוז רווי של ליגנד קולטן אנגיוטנסין I לא רדיואקטיבי, בעוד שקישור כולל הוא כמות הרדיו-ליגנד הקשור בהיעדר ליגנד קולטן אנגיוטנסין I שאינו רדיואקטיבי. לאחר מכן ניתן להפחית את ערכי הקישור הלא ספציפיים מסך ערכי הכריכה כדי לקבל את ערכי הקישור הספציפיים עבור קולטני אנגיוטנסין I.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את שלב האוטורדיוגרפיה של הקולטן תוך כארבע שעות, בעוד ששלב פיתוח הסרט אורך כ-30 דקות לסרט. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעקוב אחר הזמן כדי להבטיח שכל המגלשות מודגרות, נשטפות ומיובשות לאותו פרק זמן בדיוק. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מחקרים נוספים של מורפולוגיה מוחית כדי להעריך את השינויים בגודל האזורים המציגים ביטוי קולטן אנגיוטנסין II.

השיטה הזו סללה את הדרך לחוקרים שחוקרים פרמקולוגיה של קולטנים כדי לקבוע כיצד אזורים שונים במוח מושפעים על-ידי נוירו-הורמונים, נוירוטרנסמיטורים ותרופות שונות. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע בהצלחה בדיקת אוטורדיוגרפיה של קולטנים, שקופיות מוכתמות היסטולוגית, ולהעריך אוטורדיוגרמות למיקום קולטנים לאזורים מסוימים במוח. זכור שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון מיגון נאות, הכלה, ניטור חשיפה וסילוק כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי.