Name: פיתוח של במבחנה Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: למדו להעריך את יכולת ההתכווצות של תאים מזנכימליים לאחר מעבר אפיתל-מזנכימל (EMT) באמצעות מבחן התכווצות ג'ל. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת ציטוקינים דלקתיים על תאי ריאה אנושיים A-549 ללא ציוד מיוחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר טדאשי קויאמה על העזרה הטכנית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; מענק לקבוצת המחקר לאי ספיקת נשימה ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן; מענק למחקר על מחלות אלרגיות ואימונולוגיה, יפן.

תכשירי 1. והתרבות של תאי אפיתל הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי אפיתל ריאה אנושית A549 תרבות (שורת תאים חסיד) ב בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 100 IU / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק תקשורת תרבית תאים מן מנת התרבות, ולשטוף פעם עם 5 - 10 מיליליטר של בופר פוספט (PBS). לאחר הכביסה, מיד לשאוב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל טריפסין / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.05%) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 דקות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף את התא המנותק צינורות צנטריפוגה המכילים בינוני תרבית תאים, צנטריפוגה הצינורות ב RT במשך 4 דקות ב g 150 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים גלולה ב 2 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים ולהסיר מדגם עבור ספירת תאים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer עם כתם כחול Trypan לבדוק כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי A549 זרע על10 ס&quot;מ קלקר צלחות בצפיפות של 0.5 - 1.0 × 10 6 תאים / תבשיל עם 10 מ&quot;ל של מדיום עבור assay התכווצות ג&#39;ל. זרעים התאים על 6 צלחות קלקר גם בצפיפות של 0.5 - 1.0 × 10 5 תאים / היטב עם 2 מ&quot;ל של מדיום לאישור EMT. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. </li></ol> נוהל EMT 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של-β1 TGF (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו -10 μl של-α TNF (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לצלחת עבור assay התכווצות ג&#39;ל זורעים בשלב 1.6. הוסף 2 μl של-β1 TGF (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו -2 μl של-α TNF (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לצלחת לאישור EMT זורעים בשלב 1.6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li></ol> 3. אישור של נוהל EMT ידי PCR ו המערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר שינוי במורפולוגיה (מאבן דמוי חלוק כדי ציר צורה) של תאים שטופלו באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. הערה: נורםיש תאי A549 אל חלוק אבן דמוית ומראה בצורה משולש היא מאפיין של תאי אפיתל, אך לאחר גירוי עם-β1 TGF ו-α TNF, התאים להופיע ארוכים ציר בצורה דומה תאי mesenchymal 14,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הביטוי של סמן אפיתל, כגון E-cadherin, וסמנים mesenchymal כגון N-cadherin, vimentin, אקטין שריר α-חלקה באמצעות PCR או המערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ RNA הכולל את התאים באמצעות ערכת חילוץ RNA 16 לסנתז cDNA באמצעות transcriptase הפוכה 17 על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ביטוי של רמות ה- mRNA באמצעות מערכת בזמן אמת PCR 18 וערכת PCR לצבוע cyanine monomeric פי הוראות היצרנים. פריימרים ספציפיים עבור GAPDH (glyceraldehyde dehydrogenase 3-פוספט), ACTA2 (אלפא-אקטין 2), CDH1 (cadherin-1; E-cadherin), ו VIM (vimentin) מוצגים בלוח 1 </stרונג&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את התאים באמצעות חיץ תמוגה (טבלה 2) תמיסה המכילה קוקטייל מעכב 1% פרוטאז. למדוד את כל ריכוזי חלבון מדגם באמצעות ערכת assay חלבון 19,20, ולהחיל אותן כמויות של חלבון ג&#39;ל polyacrylamide. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע-ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS והעביר חצי יבש של חלבוני קרום PVDF 21. דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים בחסימת המאגר עבור 1 - שעות 2. לאחר דגירה, לשטוף פעמים הממברנה עם חיץ לשטוף דגירת hr קרום 1 עם נוגדנים שניים. הערה: עיין חומרים / ציוד שולחן עבור נוגדנים דילולים שימוש במחקרים אלה. ראה טבלה 2 עבור רכיבי חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם חיץ לשטוף פעמיים. צלם תמונות של הקרום עם ערכת זיהוי המערבית סופגת 22 באמצעות 11,23 מצלמת CCD קר. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Assay התכווצות ג&#39;ל EMT הערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מותנה מספינת תרבית תאים, ולשטוף היטב עם 5 - 10 מ&quot;ל של PBS להסיר תאים מתים. לאחר הכביסה, מיד לשאוב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 דקות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים מנותקת צינורות צנטריפוגה המכיל DMEM בתוספת מעכב טריפסין (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), צנטריפוגה צינורות ב RT במשך 4 דקות ב 150 × גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים סוג 1 ג&#39;ל קולגן עם מים מזוקקים, ו -4 × מרוכזים DMEM להתאים את הכרכים כדי להשיג ריכוז הקולגן של 1.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 1 × ריכוז DMEM. הקפד לשמור המדיום ג&#39;ל על הקרח במהלך שלב זה. הערה: כדי להפוך 6 מ&quot;ל של מדיום ג&#39;ל, ומערבבים היטב 3.5 מ&quot;ל של ג&#39;ל קולגן מסוג 1 (3 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 1.5 מ&quot;ל של 4 × מרוכזים DMEM, ו 1ml של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS ולהסיר מדגם עבור ספירת תאים. לספורמספר התאים באמצעות hemocytometer עם כתם כחול trypan לבדוק כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני ג&#39;ל להתאים את הכרכים להשיג צפיפות התאים של 3.0 × 10 5 תאים / טוב (6.0 × 10 5 תאים / מ&quot;ל) בעדינות אך במהירות לערבב אותו על ידי pipetting ללא gelation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 0.5 מיליליטר של התערובת לבאר כל צלחת 24 גם שאינם מטופלים במהירות ובזהירות לעשות בצורה גלילית מסודרת. היזהר שלא לאפשר כל בועות אוויר לזהם את הג&#39;לים (איור 1 א). הערה: בינוני ג&#39;ל המכיל את התאים הוא צמיג ויכול ג&#39;ל טופס סהר צורה בקלות הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת במשך 15 דקות בתוך חממת תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות 95% להגליד לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק ג&#39;לים מהצלחת בלי לשבור על ידי הזזת מרית מעוקרת באופן לצייר היקף בכיוון אחד. בעזרת מרית, להעביר את הג&#39;לים בעדינות תרבות מנות 60 מ&quot;מ רקמההמכיל 5 מ&quot;ל של FBS% DMEM / 1 עם או בלי-β1 TGF (5 ng / ml) ו-α TNF (10 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הכלים כדי להבטיח ג&#39;לים צף על המדיום. מדגירים את תא חממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות 95%. </li></ol> מדידת 5. ג&#39;ל גודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את גודל ג&#39;ל קולגן לאחר 0, 24, 48, ו -72 שעות באמצעות מערכת ניתוח תמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת תיעוד ג&#39;ל (איור 2 א), ולשים מנות לתוך ארון מגן אור. ואז מסירים את המכסה של הצלחות בארון הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה לניתוח ג&#39;ל קשורה. לחץ על &quot;כפתור רכישת תמונה&quot; בבר-התפריט כדי להציג את התמונה של הג&#39;לים בקבינט. לאחר מכן, לחץ &quot;לרכוש&quot; בשורת התפריטים כדי לצלם את ג&#39;לים (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;כפתור זיהוי&quot; בשורת התפריטים (איור 2 ג) ולהתאים באזור המדידה (i עיגול צהובn איור 2C) על ידי גרירת העכבר. לאחר מכן, לחץ על &quot;איתור אוטומטי כפתור&quot; בשורת התפריטים (ראה כפתור באיור 2D). התוכנה מזהה אוטומטית את הג&#39;לים מראים מפת חום (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;אישור&quot; כדי לחלץ את קווי המתאר של ג&#39;ל על ידי עיבוד תמונה ולחשב אזורים המוקפים המתאר (האיור 2E). אחרי השטח חושב, באזור המחושב מוצג חלון מוקפץ נפרד. הערה: אם את הג&#39;לים חופפים זה לזה במהלך ההדמיה, להעביר ג&#39;לים בעדינות בעזרת קצה פיפטה סטרילית. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

הפרוטוקול שפותח במחקר זה כולל שני שלבים. השלב הראשון מתבצע על מנת לגרום EMT, ואילו השלב השני הוא assay התכווצות ג&#39;ל. מאז חשוב לאשר תאים עברו EMT, שלב 2 מספק השלמה מצוינת שינויי ביטוי מורפולוגיים גן. מחקרים קודמים הראו כי EMT של תאי A549 הושר על ידי TGF-β1 רק 24; עם זאת, כפי שכבר דווח בעבר 10, טיפול-α TNF משפרים EMT ורכישת סמני תא mesenchymal. הוא חשב כי מנגנוני EMT TGF-β בתיווך הוא הסמאד תלוי 25. TNFα משפר EMT-induced TGF-β1 שמוביל שיפור של התכ...

פיברוזיס מעורב בפתוגנזה של מחלות פרוגרסיבי שונות כרוניות, כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית, סיסטיק לב, שחמת כבד, אי ספיקת כליות סופנית, טרשת מערכתית, ומחלות אוטואימוניות מחלה 1. בין מחלות ריאה אינטרסטיציאלית פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) הוא מחלה מתקדמת כרונית ומראה פרוגנוזה גרועה. סימן היכר הפתולוגי של IPF הוא הפיתוח של מוקדי fibroblastic המורכבים פיברובלסטים מופעל myofibroblasts המשויכים הפרוגנוזה. מקורותיה של פיברובלסטים ריאתי כאלו מוצעות לנבוע מכמה תאים mesenchymal, כולל fibroblasts ריאות תושב במקור ומדחסים fibrocytes ממח העצם. לאחרונה, מעבר mesenchymal-אפיתל (EMT) הוצע להיות מזוהה עם ההיווצרות של תאי mesenchymal 2, ולתרום בפתוגנזה של פרעות fibrotic. הוא חשב כי EMT משחק תפקידים חשובים בתהליך של התפתחות עוברת, ריפוי פצעים, והתקדמות של סרטן, כולל חדירת גידול וגרור 3. בעקבות התהליך של EMT, תאי אפיתל להשיג את היכולת של תאי mesenchymal ידי אובדן של סמנים אפיתל, כגון E-cadherin, ועל ידי ביטוי של סמני mesenchymal, כגון vimentin, יקטין שריר α-חלקה (SMA) 4,5. מחקרים קודמים הראו הראיות כי תהליך EMT כבר קשור להתפתחות של סיסטיק רקמות הכליה 6 וריאות 7. בנוסף, דלקת כרונית מקדמת fibrotic מחלת 8; יתר על כן, ציטוקינים דלקתיים כגון חבר superfamily גורם גידול נמק 14 (TNFSF14; LIGHT), tumor necrosis factor (TNF) -α, ו- interleukin-1β, הוכחו לשפר EMT 9-12. assay התכווצות ג&#39;ל קולגן, assay התכווצות תא מבוסס קולגן, אשר פיברובלסטים מוטבעים מהסוג Iקולגן ג&#39;ל תלת ממדית, הוא אידיאל במודל חוץ גופית לצורך הערכה של התכווצות. התכווצות היא אחת הפונקציה האופיינית של פיברובלסטים ותורמת תיקון פצע נורמלי סיסטיק 13. ב assay זה, הוא חשב כי את הקובץ המצורף של פיברובלסטים Type I קולגן באמצעות מנגנוני integrin תלוי אמור לייצר מתח מכאני בתנאים מסוימים, וכתוצאה מכך להוביל להתכווצות רקמות. כאן, בפיתוח של assay התכווצות ג&#39;ל מדווח להיות מותאם על מנת להעריך את רכישת פונקצית התכווצות בתאים שעברו EMT. דו&quot;ח זה מדגים כי assay שונה זו מתאימה להערכת contractility בתאי mesenchymal שעברו EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>עבור A549 בינוני</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה טרנספורמטיבי-ובטא; 1, אנושי, כימיקלים רקומביננטיים</td><td>של מעבדת וואקו</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>TNF-ואלפא אנושיים רקומביננטיים;</td><td>מו"פ D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10)</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> ארנב mAb#<td>3195</td><td>1:3,000 דילול</td></tr><tr><td>וימנטין (D21H3)</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> ארנב mAb#<td>5741</td><td>1:3,000 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-&אלפא;-נוגדן טובולין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T9026</td><td>1:10,000 דילול</td></tr><tr><td>חד-שבטי אנטי-אקטין, &אלפא;-נוגדן שריר חלק& נ.ב.פ;</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' A5228</td><td>1:10,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן נגד N-cadherin</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>IgG נגד עכברים, כבשים שלמות מקושרות HRP (נוגדן משני)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20,000 דילול</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP מקושר לחמור בטן שלם (נוגדן משני)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20,000 </td></tr><tr><td>ריאגנט חסימת</td> דילול <td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% ב-TBS-T</td></tr><tr><td>6 צלחת תרבית תאים מולטי-באר שקופה עם תחתית שטוחה TC, עם מכסה</td><td>קורנינג</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 100 מ"מ</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, טכנולוגיות חיי אבקה</td><td></td><td>12100-046</td><td>ל-4 פעמים; DMEM</td></tr><tr><td>סוג 1 קולגן ג'ל</td><td>ניטה ג'לטין</td><td>Cellmatrix סוג I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 באר צלחת תרבית תאים</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תיעוד ג'ל&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel imager</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח ג'ל</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>תוכנת ניתוח המצורפת ל-AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), Penol Red</td><td>Life Technologies</td><td>25300054-24</td><td></td></tr><tr><td>Well Plates, לא מטופל</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>טרנסקריפטאז הפוך</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR ערכת PCR ירוקה</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל (100x)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת</td> <td>PVDFערכת</td> בדיקת חלבון ATTO <td>2392390</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ביו-ראד</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל פוליאקרילאמיד</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>מגיב זיהוי כתמים מערבי</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD קרה</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture מעכב</td> טריפסין MG / ST <td></td></tr><tr><td></td><td>סיגמה אולדריך</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאורט</td><td>Wako מעבדה כימיקלים</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן (9) אוקטיניל אתר</td><td>Wako כימיקלים מעבדתיים</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיברוזיס מעורב לעתים קרובות בפתוגנזה של מחלות מתקדמות כרוניות שונות כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית. סימן ההיכר הפתולוגי הוא היווצרות מוקדים פיברובלסטיים, הקשורים לחומרת המחלה. תאים מזנכימליים המורכבים מהמוקדים הפיברובלסטיים מוצעים להיגזר ממספר מקורות תאים, כולל פיברובלסטים תוך-ריאתיים ששוכנים במקור ופיברוציטים במחזור ממח העצם. לאחרונה, תאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) אמורים גם הם לתרום לפתוגנזה של פיברוזיס. בנוסף, ניתן לגרום ל-EMT על ידי שינוי גורם הגדילה β, וניתן לשפר את ה-EMT על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כמו גורם נמק גידול α. בדיקת התכווצות הג'ל היא מודל אידיאלי במבחנה להערכת התכווצות, שהיא אחת הפונקציות האופייניות לפיברובלסטים ותורמת לתיקון פצעים ופיברוזיס. כאן מודגמת התפתחות של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת יכולת ההתכווצות של תאים מזנכימליים שעברו EMT.

במהלך EMT, תאי אפיתל לאבד סמנים אפיתל, כמו E-cadherin, ולהשיג ביטוי של סמנים mesenchymal, כגון vimentin ו α-שריר חלק אקטין 4,5. דגירה של תאי אפיתל ריאה האנושית A549 עם-β1 TGF ו- TNF-α גורמת EMT. הופעתו של תאי A549 נורמלים הם אבן חלוק כמו צורה וצורה משולשת היא מאפיין של תאי אפיתל (איור 3 א), אלא לאחר מגורה עם TGF-β1 ו- TNF-α, את המראה השתנה לצורתו ציר הארוכה דומה mesenchymal תאים (איור 3). <p class="j...

כאן, אנו מתארים את הפיתוח והיישום של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת תפקוד התכווצות בתאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההתכווצות של תאים מזנכימליים שעברו מעבר מזנכימלי אפיתל המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים במבחנה, או EMT. מזנכימלי זה הוא וריאציה של תפקוד התא הבסיסי לאחר EMT הנגרמת על ידי תגובות חיסוניות דלקתיות כגון במהלך פיברוזיס ריאתי אידיופטי או, עיצוב מחדש של דרכי הנשימה באסתמה חמורה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת מכשירים ספציפיים ושהיא מדגימה תוכן גבוה Demontrating ההליך יהיו סטודנטים לתארים מתקדמים של Hideyuki Takeshima ו- Kosuke Makita מהמעבדה שלי.התחל בשטיפת תרבית של תאי אפיתל ריאה אנושיים A-549 עם חמישה עד עשרה מילילטר של PBS. לאחר מכן, נתק את התאים הדבקים עם שני מילילטר של טריפסין-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר שלוש דקות, העבירו את תרחיף התאים לצינורות חרוטיים המכילים מדיום תרבית תאים וסובבו את התאים בצנטריפוגה.השעו מחדש את הכדורים בשני מילילטרים של מדיום תרבית תאים, ושמרו רהוט קטן לספירה. לאחר מכן זרעו 0.5 עד 1 כפול 10 לתאים השישיים בעשרה מילילטרים של צלחת פוליסטרן בינונית לעשרה סנטימטר ודגרו על תרביות התאים למשך 24 שעות. לאינדוקציה של EMT, למחרת, יש לטפל בתאים ב -10 מיקרוליטר של TGF בטא 1 ו- TNF אלפא, ולהחזיר את הצלחות לחממה למשך 48 שעות נוספות.ביום הרביעי, שטפו את התרביות המושרות על ידי EMT עם חמישה עד עשרה מילילטרים של pbs, ולאחר מכן נתקו תאים עם טריפסין-EDTA כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, סובב את תרחיפי התאים ב-DMEM בתוספת מעכב טריספסין והשהה מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של pbs. לאחר מכן ספרו את התאים, והוסיפו מדיום ג'ל מוכן טרי לצפיפות של 3 פעמים 10 לתאים החמישיים לבאר, ערבבו בעדינות אך במהירות את התמיסה על ידי פיפטה לפני הג'לציה.מייד, אך בזהירות, מחלקים 0.5 מילילטר של תאים לכל באר של צלחת 24 בארות שלא טופלה בצורות גליליות מסודרות. לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית תאים למשך 15 דקות. כאשר הג'ל התמצק לחלוטין, הזיזו מרית מעוקרת במעגל סביב החלק החיצוני של כל ג'ל בכיוון אחד, כדי לנתק את הג'לים מהצלחות מבלי להישבר.כשמסירים את הג'ל, היזהרו לא להזיז את המרית קדימה ואחורה בבאר. לאחר מכן השתמש במרית כדי להעביר בעדינות את הג'לים לצלחות תרבית רקמה בודדות של 16 מילימטר המכילות חמישה מילילטרים של DMEM בתוספת אחוז אחד FBS, עם או בלי TGF בטא 1 ו-TNF אלפא. לבסוף, יש לנער בעדינות את הכלים כדי לוודא שהג'לים צפים על המדיום, ולהחזיר את הג'לים לחממת תרבית התאים.תאי a541 לא מטופלים מציגים מראה דמוי אבן מרוצפת וצורת משולש, האופייני לתאי אפיתל. עם זאת, לאחר הגירוי שלהם עם TGF beta 1 ו-TNF alpha, התאים מפגינים צורת ציר ארוכה, בדומה לזו שנצפתה עבור תאים מסינכרמליים. QRTCPR של ביטוי סמני האפיתל והסינכמלי לפני ואחרי EMT מגלה שתאי A541 שטופלו בציטוקינים דלקתיים במשך 48 שעות מציגים ביטוי מופחת משמעותית של CDH1 וביטויים מוגברים משמעותית של VIAM ו-ACTA2.יתר על כן, גירוי עם ציטוקינים אלה מחליש את ביטוי E-cadherin כפי שנקבע על ידי ניתוח דם מערבי, בעוד שהביטויים של וימנטין N-cadherin ואקטין שריר חלק אלפא מושרים. בבדיקת התכווצות ג'ל, לאחר 48 שעות, הג'לים המכילים תאים שטופלו ב-TGF בטא 1 ו-TNF אלפא קטנים יותר מהג'לים המבוקרים המכילים תאים שטופלו ב-PBS. ואכן, לאחר 72 שעות, גודל הג'לים המכילים את הג'לים המטופלים בציטוקינים מצטמצם משמעותית, בהשוואה לג'לים המבוקרים כפי שנמדדו על ידי מנתח ג'ל.כפי שנצפה, ניתן להשלים את שלבי התכווצות הג'ל תוך שלוש שעות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאשר שה-EMT הושרה בהצלחה לפני ביצוע בדיקת כיווץ הג'ל. לאחר התבוננות, טכניקה זו מספקת דרך לשינוי תהליך ה-EMT במצב דלקתי כגון פיברוזיס או שיפוץ ריאות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפלוט תאים שיש להם EMT, לסוג של cuagenter ולהקציף אותם במדיום.

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

כאן, אנו מתארים שיטות לבידוד תאי אפיקרדיאלים ראשוניים של עכבר על ידי בדיקת תרבית צמיחה והערכת הנדידה התפקודית של תאים שמקורם באפיקרדיאלים (EPDC) באמצעות מערכת תרבית לב ex vivo. פרוטוקולים אלה מתאימים לזיהוי מודולטורים גנטיים וכימיים של מעבר אפיתל אפיקרדיאלי למזנכימלי (EMT) ותנועתיות.

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.

תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

אנו מתארים שיטות לחקור TGF-β2-induced EndMT בתאי אנדותל על ידי התבוננות בשינויים במורפולוגיה של התא ובחינת הביטוי שינויי סמן הקשורים EndMT באמצעות כתמי כשל חיסוני. עריכת גנים CRISPR/Cas9 תוארה ושימשה לרוקן את חילזון קידוד הגנים כדי לחקור את תפקידה ב- EndMT הנגרמת על ידי TGF-β2.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

עבודה זו מציגה פרוטוקול גמיש לשימוש בטכנולוגיית משטחים אלסטומריים (FLECS) בעלי תווית פלואורסצנטית בפורמט מיקרווול לכימות פשוט יותר של כוחות התכווצות של תאים חד-תאיים המבוססים על תזוזות חזותיות של מיקרופטרנים של חלבון פלואורסצנטי.

ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

פרוטוקול זה מספק שיטות ליצירת רקמות שרירי לב ושלד מהונדסות-תלת-ממדיות ומתאר את השימוש בהן בשיטות סינון תרופות פרה-קליניות. השיטות המתוארות משתמשות במערכת חישה מגנטית כדי להקל על הערכה בו זמנית של 24 רקמות במקביל.

בדיקות פרה-קליניות של תרופות ברקמות שריר מהונדסות תלת-ממדיות ניתנות להרחבה

למדו להעריך את יכולת ההתכווצות של תאים מזנכימליים לאחר מעבר אפיתל-מזנכימל (EMT) באמצעות מבחן התכווצות ג'ל. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת ציטוקינים דלקתיים על תאי ריאה אנושיים A-549 ללא ציוד מיוחד.

פיתוח של

גלה סרטונים נוספים