פיתוח של במבחנה Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההתכווצות של תאים מזנכימליים שעברו מעבר מזנכימלי אפיתל המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים במבחנה, או EMT. מזנכימלי זה הוא וריאציה של תפקוד התא הבסיסי לאחר EMT הנגרמת על ידי תגובות חיסוניות דלקתיות כגון במהלך פיברוזיס ריאתי אידיופטי או, עיצוב מחדש של דרכי הנשימה באסתמה חמורה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת מכשירים ספציפיים ושהיא מדגימה תוכן גבוה Demontrating ההליך יהיו סטודנטים לתארים מתקדמים של Hideyuki Takeshima ו- Kosuke Makita מהמעבדה שלי.

התחל בשטיפת תרבית של תאי אפיתל ריאה אנושיים A-549 עם חמישה עד עשרה מילילטר של PBS. לאחר מכן, נתק את התאים הדבקים עם שני מילילטר של טריפסין-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר שלוש דקות, העבירו את תרחיף התאים לצינורות חרוטיים המכילים מדיום תרבית תאים וסובבו את התאים בצנטריפוגה.

השעו מחדש את הכדורים בשני מילילטרים של מדיום תרבית תאים, ושמרו רהוט קטן לספירה. לאחר מכן זרעו 0.5 עד 1 כפול 10 לתאים השישיים בעשרה מילילטרים של צלחת פוליסטרן בינונית לעשרה סנטימטר ודגרו על תרביות התאים למשך 24 שעות. לאינדוקציה של EMT, למחרת, יש לטפל בתאים ב -10 מיקרוליטר של TGF בטא 1 ו- TNF אלפא, ולהחזיר את הצלחות לחממה למשך 48 שעות נוספות.

ביום הרביעי, שטפו את התרביות המושרות על ידי EMT עם חמישה עד עשרה מילילטרים של pbs, ולאחר מכן נתקו תאים עם טריפסין-EDTA כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, סובב את תרחיפי התאים ב-DMEM בתוספת מעכב טריספסין והשהה מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של pbs. לאחר מכן ספרו את התאים, והוסיפו מדיום ג'ל מוכן טרי לצפיפות של 3 פעמים 10 לתאים החמישיים לבאר, ערבבו בעדינות אך במהירות את התמיסה על ידי פיפטה לפני הג'לציה.

מייד, אך בזהירות, מחלקים 0.5 מילילטר של תאים לכל באר של צלחת 24 בארות שלא טופלה בצורות גליליות מסודרות. לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית תאים למשך 15 דקות. כאשר הג'ל התמצק לחלוטין, הזיזו מרית מעוקרת במעגל סביב החלק החיצוני של כל ג'ל בכיוון אחד, כדי לנתק את הג'לים מהצלחות מבלי להישבר.

כשמסירים את הג'ל, היזהרו לא להזיז את המרית קדימה ואחורה בבאר. לאחר מכן השתמש במרית כדי להעביר בעדינות את הג'לים לצלחות תרבית רקמה בודדות של 16 מילימטר המכילות חמישה מילילטרים של DMEM בתוספת אחוז אחד FBS, עם או בלי TGF בטא 1 ו-TNF אלפא. לבסוף, יש לנער בעדינות את הכלים כדי לוודא שהג'לים צפים על המדיום, ולהחזיר את הג'לים לחממת תרבית התאים.

תאי a541 לא מטופלים מציגים מראה דמוי אבן מרוצפת וצורת משולש, האופייני לתאי אפיתל. עם זאת, לאחר הגירוי שלהם עם TGF beta 1 ו-TNF alpha, התאים מפגינים צורת ציר ארוכה, בדומה לזו שנצפתה עבור תאים מסינכרמליים. QRTCPR של ביטוי סמני האפיתל והסינכמלי לפני ואחרי EMT מגלה שתאי A541 שטופלו בציטוקינים דלקתיים במשך 48 שעות מציגים ביטוי מופחת משמעותית של CDH1 וביטויים מוגברים משמעותית של VIAM ו-ACTA2.

יתר על כן, גירוי עם ציטוקינים אלה מחליש את ביטוי E-cadherin כפי שנקבע על ידי ניתוח דם מערבי, בעוד שהביטויים של וימנטין N-cadherin ואקטין שריר חלק אלפא מושרים. בבדיקת התכווצות ג'ל, לאחר 48 שעות, הג'לים המכילים תאים שטופלו ב-TGF בטא 1 ו-TNF אלפא קטנים יותר מהג'לים המבוקרים המכילים תאים שטופלו ב-PBS. ואכן, לאחר 72 שעות, גודל הג'לים המכילים את הג'לים המטופלים בציטוקינים מצטמצם משמעותית, בהשוואה לג'לים המבוקרים כפי שנמדדו על ידי מנתח ג'ל.

כפי שנצפה, ניתן להשלים את שלבי התכווצות הג'ל תוך שלוש שעות אם הם מבוצעים כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאשר שה-EMT הושרה בהצלחה לפני ביצוע בדיקת כיווץ הג'ל. לאחר התבוננות, טכניקה זו מספקת דרך לשינוי תהליך ה-EMT במצב דלקתי כגון פיברוזיס או שיפוץ ריאות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפלוט תאים שיש להם EMT, לסוג של cuagenter ולהקציף אותם במדיום.