ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

תאים שנוצרו כוחות מכניים חיוניים לתפקוד תקין באיברים שונים בכל הגוף. בנוסף לשלפוחית השתן של המעיים, ללב ולאחרים. איברים אלה חייבים ליצור דפוסים יציבים של התכווצות תאים והרפיה, כדי לשמור על המצב המוסטטי הפנימי.

התכווצות לא תקינה של תאי שריר חלקה עלולה להוביל להתפרצות של הפרעות שונות, כולל דיסמוטיות מעיים המאפיינות דפוסים חריגים של מעיים עם התכווצות שרירים, כמו גם תנאים כמו שלפוחית השתן הפרוע או הלא פעילה. ובערכי הנשימה, כמה תאי שריר כי לכווץ כל דפוסים לא סדירים יכול לעורר תגובת יתר אסתמטית. ברור, מנגנוני התכווצות בתוך תאים ורקמות יכול להוביל למחלות הדורשות אפשרויות טיפול.

וכמו אלה יכולים תנאים נובעים ישירות התנהגויות התכווצות תפקודיות של תאים, זה הופך להיות הגיוני והכרחי כדי למדוד את תפקוד התכווצות התא עצמו, בעת סינון מועמדים פוטנציאליים לתרופה. בעקבות ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית מיקרו פיתחנו בדיקת מיקרו-לוחית ידידותית למשתמש המאפשרת מדידות כמותיות של התכווצות תא בודד. במאות אלפי תאים הנקראים flex, הידועים גם בשם משטחים אלסטומריים בעלי תווית פלואורסצנטית.

בגישה זו, אנו מטמיעים דפוסי מיקרו חלבון פלואורסצנטיים, וסרטים רכים כל כך, אשר מעוותים ומתכווצים כאשר תאים מפעילים עליהם כוחות גרירה. חשוב לציין, דפוסי מיקרו החלבון מגבילים את מיקום התא, הצורה ואזור ההתפשטות. תנאי הבדיקה האחידים מאפשרים מדידות פשוטות המבוססות רק על השינויים הממדיים שלהם.

בסך הכל, הפלטפורמה, הכוללת מודול ניתוח תמונה מבוסס דפדפן, מאפשרת ניתוח פשוט של כוח תא לצריף ללא צורך בהליכי טיפול עדינים או ברישום סמני נאמנות ויכולה להיות מופעלת על ידי כל חוקר עם תרביות תאים בסיסיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט עם הגדלה נמוכה. טכנולוגיה זו תוכננה תוך התחשבות במשתמש הקצה, ומטרתה להפחית את מחסום הכניסה לכל מדען מעבדה לחקור ביולוגיה של כוח תאי בגין על ידי הוספת 20 מיליליטר של מדיה לצינור כרוני, להשיג צלחת של 24 בארות שנועדה לבדוק התכווצות תאים. הגדר את הפיפטה שלך ל-500 מיקרוליטר וקבל מסננת תאים לפתוגן התא.

הסר את המכסה על צלחת 24-well, להחזיק את הצלחת כמו כך, ולאחר מכן להמשיך בעדינות להסיר את שכבת הפלסטיק על גבי הצלחת. בזהירות להגדיר את הצלחת בחזרה למטה. שאפו רק PBS בשכבה העליונה מכל באר כדי למנוע דליפה.

עכשיו, שורה אחת בכל פעם, להסיר את PBS הנותרים מהבאר ולמלא במהירות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה סלולרית. נענעו את הצלחת בעדינות והקשו על צידה כדי להבטיח שכל תחתית הבאר מכוסה בתמיסה. ברגע שכל הוולס היו מלאים במדיה, הגדר את הצלחת בצד.

בשלב זה, לאחזר את תרבית התא שלך מהחממה. אנחנו ננהל פרוטוקול אסוציאציה מוצק. מטרת הפרוטוקול הזה היא ליצור השעיה של 50,000 תאים למיליליטר.

לפני זריעת התאים הקפד לסנן את התאים שלך פעם אחת דרך המסננת, על מנת לשבור גושי תאים לתאים בודדים, בזהירות למקם 500 מיקרוליטרים של פתרון התא שלך לתוך כל באר. לאחר זריעת התא, חשוב לתת ללוחות לשבת במשך שעה, כך שהתאים יכולים להתיישב ישירות על הדפוסים. לאחר שחלפה שעה, הניחו את הצלחת באינקובטור למשך הלילה.

החלק השני של הניסוי מורכב מהוספת התרופות ללוחית 24 הבאר והדמיה פלואורסצנטית של הצלחת. עבור חלק זה של הפרוטוקול יש לנו שתי דרישות חשובות כדי להבטיח כדאיות תאים חזקים ותגובה. הראשון הוא כי הריכוז הסופי של DMSO בבארות עם תא הוא לא יותר מ 1% כלומר שאנחנו צריכים לעשות דילול מלא 100 ממניות התרופות שלנו.

השני הוא שאנחנו לא יכולים להוסיף DMSO כל כך ישירות לבארות כי זה יתרסק לתחתית של ערבוב זה, ולאחר מכן לפגוע בתאים עם ריכוז ברמה גבוהה. במקום זאת, עלינו ליצור פתרון ביניים של תרופות ומדיה DMS0, שנוכל לערבב ביסודיות יחד כדי למנוע חשיפה מקומית גבוהה DSSO לתאים. בפרוטוקול זה, אנו נעשה דילול של שישה שלבים שמונה כפולים המכסה טווח מ-40 מיקרומולרים עד ל-Nano טוחנת אחת צור את סדרת הדילול של ששת השלבים הכפולים על ידי העברת 30 מיקרוליטרים של תמיסת תרופות מלאי לנפחי 210 מיקרוליטר רצופים של DMSO וערבוב יסודי בין כל שלב העברה בניסוי שלנו, אנחנו נעריך את ההשפעה של ביביסטין.

על שלפוחיות אנושיות דרך תאי השריר. על מנת לעמוד בשתי הדרישות, ניצור תחילה תרופת ביניים DMSO ופתרון מדיה. זה מניב דילול של פי 16.7 של DMSO.

לאחר מכן נוסיף פתרון תרופת ביניים זה לתאים שלנו, תוך שימוש בפרופורציות המניבות דילול נוסף של שישה פי שניים, וכתוצאה מכך סך של 100 דילול מלא והריכוז הסופי של 1%DMSO כדי להשיג זאת, עבור כל פתרון תרופה במלאי, לערבב 30 מיקרוליטרים של סמים לתוך 470 מיקרוליטרים של מדיום תרבית התאים, ולאחר מכן להעביר 200 מיקרוליטרים של פתרון ביניים זה לבאר המתאימה על צלחת 24-well, המכיל 1000 מיקרוליטרים בכל באר. זה באופן קולקטיבי מניב ריכוז סופי של 1% של דגירה DMSO עבור פרק הזמן המתאים. בניסוי שלנו, אנחנו מדגרים במשך 30 דקות, כאשר אתה מוכן לדמיין להוסיף כתם גרעיני חי בכל רחבי הבארות שלך להוסיף אחד ל 10, 000 דילול מהמלאי.

אפשר לו לדגור במשך 15 דקות נוספות. כשתהיה מוכן לתמונה, תזדקק למיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד כדי לדמות את ערוצי הפלואורסצנט הן עבור גרעיני התא המסומנים והן עבור הצבע הפלואורסצנטי. דפוסי המיקרו מסומנים עם אשר בדוגמה שלנו הוא ערוץ tri C.

עכשיו, אנחנו נהיה גרעינים blebbistatin הדמיה פלואורסצנטית על מנת לזהות תאים בודדים, הקפד לדמיין את גרעיני תאי הכתם בדיוק באותו מיקום כפי שאתה רואה את דפוס המיקרו כך שהם יכולים להיות מיושרים במהלך הניתוח. העלה את התמונות שנרכשו למחשב שלך ודא שהתמונות מסומנות כראוי, כך שערוצי התבנית מסתיימים במקף תחתון PT. ותמונות בערוץ הגרעיני מסתיימות במקף תחתון דאפי. עכשיו, אנחנו נמיר את תמונות tif לתמונות PNG, באמצעות תמונה J פעם תמונה J פתוחה, לטעון בערוץ אחד בכל פעם.

תחילה נטען את ערוץ התבנית ולהתאים את הניגודיות, על מנת למקסם את האות ולמזער את הרקע. בנוסף, אנחנו נחליק את התמונה. לאחר שהתמונה שונתה לטעמנו, נשנה את סוג התמונה לשמונה סיביות.

לאחר מכן יצא את התמונה כסוג PNG. לאחר מכן סמן את התיבה, השתמש בתוויות פרוסה כשמות קבצים. צור תיקיה חדשה בשם PNGs.

לאחר מכן שמור את קבצי PNG שם, כדי לנתח את התמונות, לנווט אל Biodock נקודה AI, ליצור חשבון וליצור קשר עם המחברים כדי לקבל גישה חופשית למודול הניתוח. היכנס לאחר יצירת החשבון שלך. כאן תוכל להעלות תמונות חדשות.

נקרא לקבוצה החדשה הזו, נתוני ניסויי אינטרנט JoVE. עכשיו, אנחנו יכולים לייבא את התמונות על ידי גרירתם ולאחר מכן שחרורם, הקש OK.At נקודה זו, בחר את הנתונים שלך. לאחר מכן לחץ על נתח, גלול מטה אל מודול שכותרתו ניתוח התכווצות ולאחר מכן לחץ על בחר.

הגדר את ההגדלה לאותו ערך שבו השתמשת להדמיה לאחר השלמת הנתונים, לחץ עליו ואז נוכל לבחור נתוני הורדה. לאחר הורדת הנתונים, נוכל לראות זוגות תמונות בשכבת-על עבור כל תמונה שהוזנה. יש לנו גם גישה לסטטיסטיקה מסכמת שתעניק לנו את ההתכווצות הממוצעת עבור כל קבוצה של תאים.

יחידת המידה להתכווצות היא בפיקסלים. בהסתכלות על הנתונים אנו יכולים לראות כאן כי בבארות שטופלו ב- DMSO בלבד, הייתה התכווצות גבוהה בהרבה של תאים בהשוואה לאותם תאים שטופלו בבלביסטטין. יש לנו גם גישה לנתונים עבור כל דפוס, שזוהה בכל אחת מהתמונות.

זה נותן לנו מידע מפורט לגבי מיקום התמונה, מקור התמונה, סוג המיקום, מספר התאים, אפס אחד או יותר מאחד, גודל תבנית המיקרו והתכווצות המחושבת של התאים. שכבה זו מורכבת מכל דפוס מזוהה יחיד בתוך צלחת מיקרו. תבניות תא בודד מרשימה זו היו ממוצעות לחישוב ההתכווצות הממוצעת עבור תמונת PNG בקובץ האחר.

באפשרותך למיין ולנתח את נתוני התא הבודד לפי הצורך לצורך הניסוי שלך. עבור חלק זה של הסרטון, אנו נציג נתונים הניתנים לאיסוף מצלחת של 24 בארות המציגות את נתוני התגובה מתאי שריר חלקים בשלפוחית השתן שטופלו בשתי תרופות שונות. אלה תמונות של בארות שטופלו עם DMSO ו blebbistatin בהתאמה.

כאן, אנו יכולים לראות כי התאים שטופלו ב- DMSO בלבד, מציגים מספר רב של תבניות מיקרו חוזה אך תאים שטופלו בבלביסטן היו גדולים יותר ופתוחים לציין שיש פחות התכווצות. הנתונים בהיסטוגרמה זו מציגים את התכווצות תאי הווריאציה כתוצאה מהטיפולים השונים בתאים. מרכז ההפצה של תאים שטופלו בבלביסטין נמוך ממרכז ההפצה של תאים שטופלו ב- DMSO.

הדבר עולה בקנה אחד עם המידע המוצג בתמונות הקודמות. כי התאים שטופלו עם blebbistatin הפגינו התכווצות קטנה בהרבה. זה מציין כי טיפול עם blebbistatin מרגיע באופן משמעותי את התאים.

כל אחת מקבוצות הנתונים הללו תורמת לנקודה בעקומת תגובת המינון הניתנת לאיסוף מלוחית אחת של 24 בארות, בהתאם לפרוטוקולים המוצגים בסרטון. כאן, אנו יכולים לראות כי ציטוכלסין D הוא חזק יותר מאשר blebbistan כפי שמוצג על ידי הערכים הנמוכים יותר של התכווצות, בהתחשב בריכוזים הגבוהים יותר של סמים. אם ברצונך לשנות את קנה המידה המשמעותי של הניסויים שלך, קיימת גרסת לוחית באר 384, וניתן להשתמש בה עם אוטומציה כדי לשנות את קנה המידה הדרמטי של הניסויים.

נתונים אלה הוא אספנות מצלחת באר 384, במקום שיש שישה שלבי דילול עבור כל תרופה על צלחת 24-well, צלחת היטב 384 מאפשר לנו לנהל 20 שלבי דילול עבור כל תרופה עם שכפולים מרובים. טכנולוגיית פתיתי שלג היא ייחודית. זה מאפשר הדמיה של התכווצות תא יחיד באמצעות מיקרוסקופיה, אשר היה בלתי אפשרי עד כה.

אז, הטכנולוגיה מסתמכת על הצורה של מדדים כי הוא מעוצב עם חלבון שכותרתו פלואורסצנטית. דפוס שיטתי הוא ליצור עבור התכווצות התא ומאפשר מדידה מדויקת של אפנון של חוזה פנוטיפ על ידי כל תרופה נתונה. כמובן, טכנולוגיה זו עדיין מפותחת באופן פעיל עבור יישומים ואזורי מחלות רבים ושונים, כגון אסטמה, מחלות לב וכלי דם, אונקולוגיה חיסונית דלקתית, וכמובן, כל אינדיקציה המחלה שלנו שבו התכווצות תאית חריגה ממלאת תפקיד מרכזי בהתקדמות המחלה.

כפי שאנו מדגימים טכנולוגיה מבוססת דפוס מיקרו זו למדידת התכווצות תאים מציעה חלופה פשוטה למיקרוסקופיה של כוח המתיחה המסורתי, המספקת ניתוח אינטואיטיבי, צופה בדפוס מתכווץ ומספקת רזולוציית תא בודד באוכלוסיות תאים גדולות. שיקולים מסוימים, שיטה זו עשויה להציב אתגרים לשימוש בתאים קטנים מדי, כגון תאי T ונויטרופילים, או סוגי תאים שאינם דבקים. בנוסף תאים שנקשרים מדי שבוע, נקשרים זה לזה בעיקר או שאינם מתפשטים לחלוטין, לא ייצרו אותות התכווצות מדידים.

משתמשים בטכנולוגיה חייבים להעריך בקפידה ניסוחים בינוניים שונים של תרבית תאים אפשרית עבור סוג התא המסוים שלהם. כמו רכיבים שונים, גורמי גדילה, רמות סרום ורגישויות pH עשויים להניע התנהגויות משתנות. מיטוב הפרוטוקולים צריך להמשיך לשנות את קנה המידה של כל זרימות העבודה הניסיוניות.

בסופו של דבר, אם אין צורך ברזולוציית תא בודד, או אם לסוג תא היעד יש יכולת התפשטות מינימלית, ניתן להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות של כוח משיכה לניסויים כאלה. אחרת אנו מקווים שכלי זה מספק דרך נוספת לביולוגים של תאים לחקור התכווצות תאית ולבצע את מחקריהם.