השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות את הוויסות הזמני הקריטי הדרוש לדפרנציאציה של קרדיומיוציטים בתאי גזע עובריים של עכבר. מטרה זו מושגת תחילה על ידי יצירת גופי עובריים (EBs) בלוחית של 96 בארות בעלת תחתית עגולה כדי להנפיק תהליך סטנדרטי של יצירת EB כשלב שני. מודולטורים חלבוניים או כימיים מתווספים ל-EBs לאורך מסלול זמן שנקבע מראש, מה שיאפשר בקרה זמנית על המסלולים הנבדקים.

בשלב הבא, EBS פועים נספרים ידנית כדי לקבוע את יעילות ההשראה של סכמות שונות של אפנון אותות. התוצאות המתקבלות מראות את הדרישות הזמניות של מסלולי איתות חיוניים להבחנה של cardiomyocyte, בהתבסס על אחוז ה-EBS הפועים שנוצרו ואישור באמצעות שיטת הטיפה התלויה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיפות תלויות, הוא שהיא סטנדרטיזציה ומפשטת הליך עתיר עבודה ומאפשרת קריאה ישירה לצורך כימות.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון זיהוי מסלולי איתות חיוניים המכוונים את הדיפרנציאציה לעבר סוג התא הרצוי. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תאי גזע עובריים של עכבר בצלחות תרבית תאים של 10 סנטימטר, במצע גידול לתאי ES של עכבר המועשר ב-leukemia inhibitory factor. כאשר תאי ה-ES מגיעים ל-50% עד 70% התמזגות (confluence), הם מוכנים לשימוש.

הסיר את מצע ה-ES ושטוף את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי. הוסף שתי מיליליטר של 0.05% tripsin EDTA לכל צלחת, ודגור את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, בטל את פעולת ה-tripsin EDTA על ידי הוספת שלוש מיליליטר של מצע ES לכל צלחת, והעבר את התאים לשפופרת צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

סבב ב-1000 סל"ד למשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגציה, הסר את הנוזל העליון ותלה את משקע התאים בכמות הרצויה של מצע EB. ספור את מספר התאים ולאחר מכן דלל את התאים ל-5×10³ תאים למילליליטר.

באמצעות פ pipette רב-ערוצית, העבירו 100 µL של מצע EB המכיל תאים לכל באר של פלטת מיקרוטיטר בעלת 96 באערים עם תחתית עגולה. מספר פלטות ה-96 באערים הנדרש יהיה תלוי במספר התנאים ובנקודות הזמן של הניסוי. הניחו את פלטות המיקרוטיטר עם 96 הבאערים בעלות התחתית העגולה בתוך אינקובטור לח עם 37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לזהות חלונות זמן קריטיים של מסלולי סיגנלינג מרכזיים עבור קרדיוגנזה (cardio genesis).

מוסיפים לתאי ה-ES מודולטורים של מסלולי איתות ספציפיים. בתוך פלטות 96 בארות בעלות תחתית עגולה, מוסיפים לכל באר את המודולטור של האיתות, המדולל במצע, בנקודות זמן שונות. מחצית מהבארות בכל פלטה של 96 בארות משמשות עבור כל נקודת זמן התחלה של הטיפול.

ביקורת רכב (vehicle control) מתווספת ל-48 הבארות האחרות עבור כל נקודת זמן. בנקודות עצירה שונות, נשטוף את מווסתי האיתות (signaling modulators) מכל בארה על ידי החלפת המצע; יש לנקוט זהירות רבה בעת ביצוע פעולה זו כדי למנוע פגיעה בגופי העובריים (embryonic bodies). בנקודות זמן עצירה שונות, שטפו את המווסתים על ידי החלפת מצע ה-EB בבארות. הטו את פלטת 96 הבארות בזווית של כ-10 מעלות והסירו בעדינות את המצע מהבאר באמצעות פיפט רב-ערוצי.

לאחר מכן, עבור כל טיפול שנמשך מעל 48 שעות, הוסיפו בחזרה לכל באר מצע EB ללא מודולטור. החליפו את מצע ה-EB המועשר במודולטורים טריים מדי יומיים עד לזמן הסיום הרצוי. שבעה ימים לאחר השראת ה-EBS, שבוצע באמצעות העברת תאי ES לפלטות של 96 בארות, בחנו את התכווצות ה-EB תחת מיקרוסקופ.

סמנו את הבארים עם EBS המתכווצים כחיוביים כדי לקבל את אחוזי ה-EBS המתכווצים עבור כל מהלך זמן של טיפול שונה. ניתן לאמת את חלונות הזמן של האיתות עבור קרדיוגנזה (cardio genesis), שזוהו בניסויי פלטת 96 הבארים, ב-EBS שהוכנו בשיטת טיפות תלויות כדי ליצור טיפות EB תלויות. ראשית, הכינו את פטריות הפטרי על ידי הוספת שלושה עד ארבעה מיליליטרים של PBS כדי למנוע עיוות של הטיפות בהמשך.

בשלב הבא, תרחיף תאי ES שהוכן בריכוז סופי של 2.5 times 10 to the four תאים למיליליטר נשפך לתוך צלחת בקטריאלית לצורך גישה נוחה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, טפטפו 20 µL של תאי ES על המכסים ההפוכים של צלחוני הפטרי. יש להקפיד שהטיפות הבודדות לא יגעו זו בזו.

בדרך כלל, מכסה אחד יכול להכיל עד 80 טיפות. לאחר מכן, הפכו את המכסה בחזרה על גבי צלחת הפטרי המכילה PBS והדגירו למשך 48 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לאפשר את היווצרות ה-EB. לאחר 48 שעות, שטפו את ה-EBS שהיווצרו מהטיפות התלויות מכל מכסה באמצעות 3 mL של מדיום EB.

העבירו שני מכסי EBS לצ그러ת פטרי חדשה. דגרו את צ그러ת הפטרי למשך ארבעה ימים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%carbon dioxide. ביום הרביעי, העבירו את ה-EBS בתרחיף אל פלטות של שישה בארות המצופות ב-0.2%Gelatin באופן כללי. 30 EBS מועברים לכל בארה. דגרו מודולטורים של אותות למשך פרק הזמן שזוהה בניסויי פלטות 96 הבארות, שבעה ימים לאחר יצירת טיפות התליה.

בחן את ה-EBS תחת המיקרוסקופ לאיתור התכווצות EB. תאי ES הגדלים בבארים בעלות קרקעית עגולה של פלטה בעלת 96 בארים יגבשו EBS, כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו של EB שנוצר ביום הרביעי. נקודות הזמן הקריטיות עבור קרדיוגנזה של ES הן חלונות הזמן הכוללים את האחוז הגבוה ביותר של EBS מתכווצים שטופלו במודולטורים של אותים, בהשוואה לבקרת הרכב הנשא (vehicle control). מוצג כאן מוקד התכווצות ספונטנית של קרדיומיוציטים שנוצרו מתאי ES שטופלו במורפין דורסלי ביום 10 להביהה בפלטת מיקרוטיטר בעלת 96 בארים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של האופן שבו ניתן לזהות ביעילות ויסות זמני קריטי וחלונות זמן של מסלולי איתות מרכזיים בתהליך ה-cardio genesis של תאי ES.