השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות את הוויסות הטמפורלי החיוני הנדרש להתמיינות קרדיומיוציטים בתאי גזע עובריים של עכברים. זה מושג על ידי יצירת גופים עובריים תחילה בלוח תחתון עגול 96 כדי לתקנן את היווצרות ה-EB כשלב שני. חלבונים או מודולטורים כימיים מתווספים ל-EBS במהלך זמן קבוע מראש, מה שיאפשר בקרה זמנית על המסלולים הנבדקים.

לאחר מכן, EBS מנצח מכומת באופן ידני כדי לקבוע את יעילות האינדוקציה של תוכניות אפנון אותות שונות. מתקבלות תוצאות המראות דרישות זמניות של מסלולי איתות חיוניים להתמיינות קרדיומיוציטים על סמך אחוז הפעימות של EBS שנוצר ואישור בשיטת הטיפה התלויה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיפות תלויות, הוא שהיא מתקנת ומפשטת הליך עתיר עבודה ומאפשרת קריאה פשוטה לכימות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון זיהוי קרישת איתות חיונית המכוונת את ההתמיינות לעבר סוג התא הרצוי כדי להתחיל בהליך זה. תאי גזע עובריים של עכבר גרו בצלחות תרבית תאים של 10 סנטימטר עם מדיום תאי ES של עכבר בתוספת גורם מעכב לוקמיה. כאשר תאי ה-ES נמצאים במפגש של 50 עד 70%, הם מוכנים לשימוש.

הסר את אמצעי ה- ES ושטוף את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר PBS סטרילי. הוסף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA לכל צלחת, ודגר את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הרוו את הנסיעות ב-EDTA עם שלושה מיליליטר של מדיה ES לכל צלחת והעבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

סובב ב -1000 סיבובים לדקה למשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופינט והשהה מחדש את גלולת התא עם הכמות הרצויה של מדיה EB. ספור את מספר התא ולאחר מכן דלל את התאים לחמש פעמים 10 לשלושה תאים למיליליטר.

במדיה EB באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה EB המכילה תאים לכל באר של צלחת מיקרוטיטר באר תחתונה עגולה של 96. מספר 96 לוחות הבאר הנדרשים יהיה תלוי במספר התנאים ונקודות הזמן של הניסוי. הנח את 96 לוחות המיקרוטיטר התחתונים העגולים לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני לח של 37 מעלות צלזיוס 5% כדי לזהות חלונות זמן קריטיים של מסלולי איתות מרכזיים ליצירת לב וכלי דם.

מודולטורים של מסלולי איתות ספציפיים מתווספים לתאי ה-ES. ב-96 לוחות הבאר התחתונים העגולים מוסיפים את מאפנן האיתות, המדולל במדיה לכל באר בנקודות זמן שונות. מחצית מהבארות בכל צלחת 96 בארות משמשות לכל נקודת זמן התחלה של טיפול.

בקרת רכב מתווספת ל-48 הבארות האחרות לכל נקודת זמן בנקודות עצירה שונות, אנו הולכים לשטוף את מאפנני האיתות מכל באר על ידי החלפת המדיה ויש לנקוט בזהירות רבה בעת ביצוע פעולה זו כדי למנוע שיבוש הגופים העובריים בנקודות זמן עצירה שונות. שטפו את המודולטורים על ידי החלפת מדיית ה-EB עבור הבארות. הטה את צלחת 96 הבאר בזווית של כ -10 מעלות והסר בעדינות את המדיום מהבאר בעזרת פיפטה רב ערוצית.

לאחר מכן הוסף בחזרה מדיית EB ללא אפנון לכל באר לכל טיפול למשך יותר מ-48 שעות. החלף את מדיית ה-EB בתוספת מודולטורים טריים כל יומיים עד לזמן העצירה הרצוי. נקודות שבעה ימים לאחר השראת EBS על ידי העברת תאי ES ל-96 לוחות באר בוחנות את התכווצות ה-EB במיקרוסקופ.

ציין את הבארות עם הידבקות ב-EBS כחיוביות כדי לקבל אחוזים של הידבקות ב-EBS עבור כל מהלך זמן טיפול שונה. ניתן לאמת את חלונות הזמן של איתות ליצירת לב שזוהו על ידי ניסויי 96 לוחות באר ב-EBS העשויים מטיפות תלויות ליצירת טיפות EB תלויות. ראשית הכינו מנות פטרי על ידי הוספת שלושה עד ארבעה מיליליטר PBS לסטייה מונעת של הטיפות מאוחר יותר.

לאחר מכן, תרחיף תאי ES שהוכן בצפיפות סופית של 2.5 פעמים 10 לארבעת התאים למיליליטר מוזג לכלי חיידקים לגישה נוחה. בעזרת פיפטה רב-ערוצית מוסיפים 20 טיפות מיקרוליטר של תאי ES על המכסים ההפוכים של צלחות הפטרי. אל תאפשר לטיפות הבודדות לגעת זו בזו.

בדרך כלל, מכסה אחד יכול להכיל עד 80 טיפות. לאחר מכן הפוך את המכסה בחזרה על צלחת הפטרי המכילה דגירה PBS למשך 48 שעות באינקובטור פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% כדי לאפשר היווצרות EB. לאחר 48 שעות, שטפו את ה-EBS שנוצר מטיפות תלויות מכל מכסה עם שלושה מיליליטר של חומר EB.

משוך שני מכסים של EBS לתוך צלחת פטרי חדשה. דגרו את צלחת הפטרי במשך ארבעה ימים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני ביום הרביעי, העבירו את EBS בתרחיף על שש צלחות באר מצופות ג'לטין 0.2% באופן כללי. 30 EBS מועברים לכל מודולטורים של איתות דגירה בפרק הזמן שזוהה מניסויי 96 לוחות הבאר שבעה ימים לאחר ביצוע הטיפות התלויות.

התבונן ב-EBS תחת המיקרוסקופ עבור התכווצות EB תאי ES הגדלים בבארות התחתונות העגולות של צלחת 96 בארות יהוו EBS כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו של EB שנוצר ביום הרביעי. נקודות הזמן הקריטיות ליצירת לב ES הן חלונות הזמן המכילים את האחוז הגבוה ביותר של התכווצות EBS המטופל על ידי מודולטורים של איתות בהשוואה לבקרת הרכב. מוצג כאן מוקד התכווצות ספונטני של קרדיומיוציטים שנוצרו מתאי ES שטופלו במורפיום גבי ביום 10 של התמיינות על צלחת מיקרוטיטר 96 באר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ביעילות ויסות זמני קריטי, חלונות של מסלולי איתות מרכזיים ביצירת לב ES.