פיתוח ואפיון של במבחנה כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca ^{2 +}] _i וייצור Nitric Oxide

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מכשיר מיקרופלואידי, המאפשר לתאי אנדותל לגדול תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית, ולמדוד את השינויים הנגרמים על ידי אגוניסט בייצור הסידן ותחמוצת החנקן שלהם. מסר זה יכול לעזור לקדם את העתיד של מחקר המיקרו-כלי דם, על ידי אימות מודל המיקרו-כלי במבחנה וגישור על הפערים בין מחקרי in vivo למחקרי מבחנה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם העיצוב הרב-תכליתי של המיקרו-ערוצים כדי לחקות כלי דם שונים והם משפרים את סביבת תרבית התאים הקרובה יותר ל-in vivo מאשר הסטטי המותנה לאותה תרביות מקוריות.

מי שידגים את הנהלים יהיו סוליי ושיאנג, השניים מהמעבדה שלי. לפני שתתחיל, השתמש בפוטוליתוגרפיה סטנדרטית כדי ליצור תבנית מאסטר וליתוגרפיה רכה כדי לייצר את התקני המיקרו-ערוצים של PDMS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את התקני המיקרו-ערוצים, יש לכסות תחילה את הכניסה והיציאה בחתיכה דקה של PDMS ולהניח את המכשיר בתוך צלחת פטרי עם טישו רטוב.

לאחר מכן, עטפו את המנה ב-Parafilm ועיקרו את המכשיר תחת אור UV למשך שלוש שעות לפחות. השלב הבא הוא מריחת הפיברונקטין. ראשית, הניחו טיפה של 30 עד 50 מיקרוליטר PBS בכניסה.

צור ואקום בשקע כדי לשטוף את המכשיר. לאחר מכן, הניחו טיפה של 100 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין בכניסה. צור ואקום ביציאה כדי לטעון את תמיסת הפיברונקטין.

לאחר מכן, כסו את הכניסה והיציאה. עטפו שוב את המנה בפרפילם ודגרו את המכשיר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו ידנית את המכשיר עם PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, טען אותו ב-30 עד 50 מיקרוליטר של מצע תרבית תאים וחמם את המכשיר בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. התחל בערבוב HUVECs לתוך מצע תרבית HUVEC עם שמונה אחוז דקסטרן בשניים עד ארבעה מיליון תאים למיליליטר. הדקסטרן נחוץ כדי להגביר את הצמיגות ובכך לשפר את זריעת התאים.

לאחר מכן, הניחו 10 עד 20 מיקרוליטר תאים מעל הכניסה והכניסו אותם באמצעות כוח הכבידה או באמצעות פעולה נימית מפיפטה פסטר זכוכית ביציאה. לאחר מכן, דגרו את המכשיר למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, בדוק את מצב הזריעה במיקרוסקופ.

במידת הצורך, טען תאים נוספים כדי להשיג צפיפות תאים רצויה. לאחר טעינת מספיק תאים, שטפו בעדינות את המכשיר במדיום תרבית תאים רגיל וחם כדי להסיר את הדקסטרן. לאחר מכן, תרבית המכשיר ללא כל זלוף מדיה למשך שש שעות.

לאחר מכן, הגדר את חיבורי הצינורות לזלוף לטווח הארוך. הדביקו את המכשיר לצלחת פטרי ואז חברו את צינור הכניסה למזרק בעזרת מחט. הכנס צינורות הן לכניסה והן לשקע של המכשיר.

חבר את צינור השקע לקולט פסולת. כעת, הניחו את מיכל הכלים והפסולת בחממה. חבר את המזרק עם צינור כניסה ארוך למשאבת זלוף חיצונית העוברת דרך דלת החממה.

לאחר מכן, הגדר את קצב הזלוף בהתאם לתכנון הניסוי. עם זלוף מבוקר היטב, ניתן לשמור על התרבית ברשת המיקרו-כלי עד שבועיים. לכן, ניתן להרחיב אותו למחקרים ארוכי טווח המחקים את הסביבה התאית וההמודינמית על המצב הפיזיולוגי והפתולוגי השונה.

כדי להתחיל את הצביעה החיסונית, כגון תיוג VE-cadherin, יש לתקן תחילה את התאים על ידי החדרה של שני אחוזים פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר סדרה של זלוף כדי לחסום, לחלחל ולהכתים בנוגדנים, שמור את המכשיר בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיית התאים. כדי לדמות את ריכוז הסידן בתאים, יש להחדיר את המכשיר עם 10 מיליגרם למיליליטר אלבומין בתמיסת רינגר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש להחדיר את המכשיר בחמישה מיקרו-מולארי Fluo-4 AM למשך 40 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את ה-Fluo-4 AM הקשור בלומן עם צלצולי אלבומין למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל את המערכת הקונפוקלית להדמיית רמת סידן בין-תאית עם Fluo-4 AM. רכוש תמונות של המיקרו-ספינות העמוסות ב-Fluo-4.

אסוף את התמונות הבסיסיות למשך 10 דקות. לאחר מכן, החדרו את המכשיר ברציפות עם 10 מיקרו-מולרי ATP ורשמו את השינויים בעוצמת הקרינה למשך 20 דקות. כדי לדמות ייצור תחמוצת החנקן בתאים, יש להחדיר את המכשיר עם צלצולי אלבומין למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש לחלחל את התאים עם 5 DAF-2 DA מיקרו-מולארי למשך כ-35 עד 40 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הגדר את מערכת ההדמיה הקרינה כדי למדוד ייצור תחמוצת חנקן המושרה על ידי ATP. הקלט את קו הבסיס למשך 5 דקות, ולאחר מכן הטמע את המכשיר ב-10 מיקרו-מולרי ATP ואסוף את התמונות במשך 30 דקות במרווחים של דקה אחת.

למדידת תחמוצת החנקן בתא, חשוב להבין שמתאם הניתוק לפרופיל העוצמה מייצג ייצור מצטבר של תחמוצת החנקן עם הזמן ולא ריכוז תחמוצת החנקן. בחר באופן ידני את אזור העניין מתוך התמונות שנאספו ברמת התא הבודד. כל החזר ROI מכסה את השטח של תא של אדם אחד שניתן לציין על ידי מתאר floresense.

כמת את השינויים המושרים על ידי ATP בסידן אנדותל ותחמוצת החנקן. על ידי חישוב השינויים בעוצמת הפלור-סנס של Fluo-4, פחות רקע הרקמה. כמת את קצב ייצור תחמוצת החנקן על ידי ביצוע ההמרה הדיפרנציאלית הראשונה של עוצמת ה-floresense של DAF-2 לאורך זמן.

לדפוס המיקרו-ערוצים במכשיר יש רשת הסתעפות בת שלוש רמות. בוצעה סימולציה מספרית תלת מימדית כדי להעריך את התפלגות מתח הגזירה בקצב זרימה של 0.35 מיקרוליטר לדקה. תאי אנדותל זרעו לתוך הרשת כפי שתואר.

לאחר מכן, F-אקטין וגרעינים סומנו. באופן דומה, גם VE-cadherin היה מוכתם. התוצאות היו דומות לביטוי VE-cadherin בווריד שלם.

לאחר מכן, נבדקו עליות הנגרמות על ידי ATP בייצור הסידן ותחמוצת החנקן התוך-תאי. רמות הסידן נבדקו באמצעות Fluo-4 AM כמתואר בסעיף הפרוטוקול. ייצור תחמוצת החנקן נוטר באמצעות DAF-2 DA כמתואר בסעיף הפרוטוקול.

התוצאות היו דומות לאלו שנגזרו עם ורידים שלמים שהוחדרו בנפרד. המתקדמים היו קלים ומבוקרים היטב בתנאים ביולוגיים ובסביבות נוזלים דינמיות, מה שלא היה אפשרי בטכניקות מיקרו-מיומנות קונבנציונליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לייצר את המכשיר, ולבצע מדידות סידן ותחמוצת החנקן.

לאחר שטכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים, לא רק לחקור את האגוניסט הבסיסי המושרה אלא גם לפתוח יישומים רחבים יותר למחקר ביו-רפואי.