פיתוח ואפיון של

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח התקן מיקרופלואידי המאפשר לתאי אנדותל לגדול תחת זרימה גזירה רלוונטית פיזיולוגית, ולמדוד את השינויים בייצור הסידן והחנקן החד-חמצני (nitric oxide) המונחים על ידי אגוניסטים. מסמך זה עשוי לסייע בקידום מחקרי כלי דם זעירים בעתיד, על ידי תיקוף מודל כלי דם זעירים in vitro וגישור על הפערים בין מחקרי in vivo למחקרי in vitro. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם העיצוב הגמיש של המיקרו-תעלות המאפשר חיקוי של מערכות כלי דם שונות, ושיפור סביבת תרבית התאים כך שתהיה קרובה יותר למצב in vivo מאשר התנאים הסטטיים של תרביות מקוריות.

סולי ושיאנג, שניים מהמעבדה שלי, ידגימו את הפרוצדורות. לפני התחלת העבודה, השתמשו בפוטוליתוגרפיה סטנדרטית ליצירת תבנית מאסטר ובליתוגרפיה רכה לייצור התקני המיקרו-ערוצים מ-PDMS, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להכין את התקני המיקרו-ערוצים, כסו תחילה את הכניסה והיציאה בחתיכה דקה של PDMS והניחו את ההתקן בתוך צלח פטרי עם טישיו רטוב.

לאחר מכן, עטפו את הצלחת ב-Parafilm וסטריליזציה של המכשיר תחת אור UV למשך שלוש שעות לפחות. השלב הבא הוא יישום הפיברונקטין. ראשית, הניחו טיפה של 30 עד 50 microliters של PBS בכניסה.

צרו ואקום בפתח היציאה כדי לשטוף את המכשיר. לאחר מכן, הניחו טיפה של fibronectin בריכוז 100 µg/mL בפתח הכניסה. צרו ואקום בפתח היציאה כדי להזרים את תמיסת ה-fibronectin.

בשלב הבא, כסו את הפתח לכניסה והיציאה. עטפו שוב את הצלחת ב-Parafilm והדגירו את המכשיר למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו ידנית את המכשיר עם PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, טענו את המכשיר ב-30 עד 50 µL של מצע גידול תאים וחממו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות לפחות. התחילו בערבוב של HUVECs לתוך מצע גידול HUVEC עם שמונה אחוזים Dextran בריכוז של שני עד ארבעה מיליון תאים ל-mL. ה-Dextran דרוש כדי להעלות את הצמיגות ובכך לשפר את זריעת התאים.

בשלב הבא, הניחו 10 עד 20 µL של תאים מעל פתח הכניסה והחדירו אותם באמצעות כוח הכבידה או באמצעות פעולת נימיות בעזרת פיפט פסטור מזכוכית בפתח היציאה. לאחר מכן, דגרו את המכשיר למשך 15 עד 20 דקות. לבסוף, בדקו את מצב הזריעה תחת מיקרוסקופ.

במידת הצורך, טענו תאים נוספים כדי להגיע לצפיפות התאים הרצויה. לאחר טעינת מספיק תאים, שטפו בעדינות את המכשיר עם מצע תרבית תאים רגיל וחם כדי להסיר את ה-Dextran. לאחר מכן, דגרו את המכשיר ללא פרפוזיה של מצעים למשך שש שעות.

בשלב הבא, הכינו את חיבורי הפצצות עבור הפרפוזיה לטווח ארוך. הדביקו את המכשיר לפטרי dish ולאחר מכן חברו את צינור הכניסה למזרק עם מחט. הכניסו צינורות הן לכניסה והן ליציאה של המכשיר.

חבר את צינור היציאה למכל איסוף פסולת. כעת, מקם את הצלחת ואת מכל הפסולת בתוך אינקובטור. חבר את המזרק, הכולל צינור כניסה ארוך, למשאבת פרפוזיה חיצונית העוברת דרך דלת האינקובטור.

לאחר מכן, הגדירו את קצב הפרפוזיה בהתאם לתכנון הניסוי. באמצעות פרפוזיה מבוקרת היטב, ניתן לשמר את התרבית ברשת כלי הדם המיקרוסקופיים למשך עד שבועיים. לפיכך, ניתן להרחיב את השיטה למחקרים ארוכי טווח המדמים את הסביבה התאית וההמודינמית בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

כדי להתחיל בצביעה אימונו-היסטוכימית, כגון סימון VE-cadherin, קבע תחילה את התאים על ידי פרפוזיה עם 2% פראפורמאלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר סדרת פרפוזיות לחסימה, לחדירה (permeabilization) ולצביעה עם נוגדנים, שמור את המכשיר בטמפרטורה של 4°C עד לצילום התאים. כדי לצלם את ריכוז הסידן בתאים, בצע פרפוזיה למכשיר עם 10 mg/mL אלבומין בתמיסת רינגר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C.

בשלב הבא, בצעו פרפוזיה של המכשיר ב-5 µM Fluo-4 AM למשך 40 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, שטפו את ה-Fluo-4 AM הקשור ללומן באמצעות albumin Ringers למשך 15 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, הפעילו את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקאלי עבור דימוי רמות סידן תוך-תאיות באמצעות Fluo-4 AM. רכשו תמונות של המיקרו-כלי דם הטעונים ב-Fluo-4.

אסוף תמונות בסיס (baseline) למשך 10 דקות. לאחר מכן, בצע פרפוזיה רציפה למכשיר עם 10 micromolar ATP והקלט את השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה למשך 20 דקות. כדי לדמות את ייצור תחמוצת החנקן (nitric oxide) בתאים, בצע פרפוזיה למכשיר עם albumin Ringers למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לתאים עם 5 micromolar DAF-2 DA למשך כ-35 עד 40 דקות ב-37 degrees Celsius. בשלב הבא, הגדירו את מערכת הדמיית הפלואורסצנציה למדידת ייצור nitric oxide המושרה על ידי ATP. רשמו את קו הבסיס למשך 5 דקות, ולאחר מכן בצעו פרפוזיה למכשיר עם 10 micromolar ATP ואספו את התמונות למשך 30 דקות במרווחים של דקה אחת.

עבור מדידת תחמוצת החנקן בתאים, חשוב להבין שהמתאם המנתיק עבור פרופיל העוצמה מייצג ייצור מצטבר של תחמוצת חנקן לאורך זמן ולא ריכוז של תחמוצת חנקן. בחרו ידנית את אזורי העניין (ROI) מהתמונות שנאספו ברמת התא הבודד. כל ROI מכסה את השטח של תא בודד אחד, שניתן לזהותו על ידי מתאר הפלואורסצנציה.

כמת את השינויים בסידן ובחנקן חמצני באנדותל המושרים על ידי ATP. זאת על ידי חישוב השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה של Fluo-4, בניכוי הרקע של הרקמה. כמת את קצב ייצור תחמוצת החנקן על ידי ביצוע גזירה ראשונה של עוצמת הפלואורסצנציה של DAF-2 לאורך זמן.

תבנית המיקרו-ערוצים במכשיר כוללת רשת הסתעפות בעלת שלושה רמות. בוצע סימולציה נומרית בתלת-ממד כדי להעריך את התפלגויות מאמץ הגזירה תחת קצב זרימה של 0.35 microliters per minute. תאי אנדותל נזרעו לתוך הרשת כפי שתיאור.

לאחר מכן, בוצע סימון של F-actin וגרעינים. באופן דומה, בוצע גם צביעה של VE-cadherin. התוצאות היו דומות לביטוי של VE-cadherin בווריד קטן (venule) שלם.

בשלב הבא, נבחנו עליות בייצור של סידן תוך-תאי וחמצן ניטריק המושרות על ידי ATP. רמות הסידן נבחנו באמצעות Fluo-4 AM כפי שמתואר בחלק הפרוטוקול. ייצור חמצן ניטריק נוטר באמצעות DAF-2 DA כפי שמתואר בחלק הפרוטוקול.

התוצאות היו דומות לאלו שהתקבלו באמצעות פרפוזיה של ונואלים שלמים בנפרד. המערכת הייתה קלה לשליטה ובקרה הדוקה בתנאים ביולוגיים ובסביבות נוזליות דינמיות, דבר שלא היה אפשרי בטכניקות מיקרו-כירורגיות קונבנציונליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ייצור ההתקן וביצוע מדידות של סידן וחנקן חמצני.

לאחר מכן, טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים לא רק לחקור את המנגנונים הבסיסיים המושרים על ידי אגוניסטים, אלא גם לפתוח יישומים רחבים יותר למחקר ביו-רפואי.