Name: פיתוח ואפיון של במבחנה כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל Ca 2 + i וייצור Nitric Oxide (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למדו לפתח התקן מיקרו-זרימה לגידול תאי אנדותל תחת זרימת גזירה פיזיולוגית ולמדוד שינויים ביוני סידן וייצור חנקן חמצני בתגובה ל-ATP. שיטה זו מאמתת מודל מיקרו-כלי דם במבחנה ומקדמת מחקר כלי דם קטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מעניק HL56237, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מכון DK97391-03, הקרן הלאומית למדע (NSF-1,227,359 והרווח למניה-1,003,907).

<ol><li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+modulation+at+the+cell%2C+microvessel%2C+or+whole+organ+level%3A+towards+closing+gaps+in+our+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li>
<li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li>
<li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li>
<li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response%2C+nitric+oxide+and+%5BCa2%2B%5DI%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797(2015).</li>
<li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4%2C5-diaminofluorescein+diacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li>
<li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li>
<li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li>
<li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+%5BCa2%2B%5Di+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li>
<li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-activating+factor+increases+endothelial+%5BCa2%2B%5D+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li>
<li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+%5BCa2%2B%5Di+and+venular+microvessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li>
<li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li>
<li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li>
<li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li>
<li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional%2C+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li>
<li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated%2C+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly%28dimethylsiloxane%29-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li>
<li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+C%22%5BJournal%5D)">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li>
<li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li>
<li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioadaptation%3A+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li>
<li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li>
<li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li>
<li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+%3A+alters+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li>
<li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li>
<li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators%3A+diaminofluoresceins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li>
<li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28iBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).</li>
<li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li>
<li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li>
<li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים שום אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים לחשוף.

<html> במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לפיתוח רשת microvessel התרבותי, האפיון של צמתי EC ו cytoskeleton הפצת F- תקטין, ואת מדידות כמותיות של EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור באמצעות מכשיר microfluidic. מכשיר microfluidic perfused מספק מודל במבחנה המאפשר סימולציה קרובה של גיאומטריות כלי דם vivo פנימה תנאי זרימת גזירה. מאז רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו יכולה לשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצד פתולוג...

תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי 1,2. טכנולוגית מיקרופלואידיקה מאפשרת נוזל לשלוט באופן מדויק באמצעות microscale המוגבל גיאומטרי ערוצים (תת מילימטר) 3, אשר מספק את ההזדמנות עבור תאים בתרבית, במיוחד עבור כלי דם ECS, לגדול בתנאי זרימה רצויות. תכונות אלו הופכות את תנאי תרבית תאים קרובים in vivo מ בתרביות תאי 2D הקונבנציונליות, סטטי. הם מאוד חשובים כאשר מכשירי microfluidic משמשים מודל סוגים שונים של vasculatures וללמוד תגובות EC גירויים מכאניים ו / או כימיים. למרות היתרונות שמפגינים רשת microchannel על תרבית תאים סטטי, העיבוד ויישום של מיקרופלואידיקה ב- F ביוield להישאר מוגבל. דווח ע&quot;י בדיקה שנערכה לאחרונה, רוב הפרסומים בתחום זה (85%) עדיין בכתבי עת הנדסה 4. הביצועים של מכשירי microfluidic לא היו מספיק משכנע עבור רוב הביולוגים לעבור טכניקות נוכחיות כגון assay Transwell ואת מנת תרבות מאקרו בקנה המידה / זכוכית שקופית למכשיר מיניאטורי זה. מיקרופלואידיקה הוא שדה רב תחומי, המחייב שיתוף פעולה בינתחומי לנוע בתחום זה קדימה. מטרת מאמר טכני זה היא לצמצם את פערי הידע בין דיסציפלינות ולבצע את הליכי הייצור מובנים על ידי ביולוגים, תוך מתן יישום ביולוגי ואימות פונקציונלית של microvessels microfluidic. הפרוטוקולים הניסיונות דמיינו כוללים ייצור של שני מכשירים microfluidic והמקודדים הביולוגיים שלהם, אשר מייצג שיתוף פעולה הדוק בין מהנדסים וביולוגים. אנחנו דיווחנו לאחרונה כמהיישומים ביולוגיים באמצעות רשת microvessel במבחנה עם המכשיר microfluidic 5. על מנת לעצב את הממדים כראוי של רשת microchannel ולהחיל את לחץ הגזירה הרצוי, מודל מספרים נבנה עם תוכנה הידרודינמיקה חישובית להעריך את פרופיל הזרימה מקרוב. תאי אנדותל טבור וריד אדם מן המעלה הראשון (HUVECs) כי היו זורעים לתוך microchannels הגיע למפגש, כלומר כיסו את המשטחים הפנימיים כולו של microchannel, בתוך 3-4 ימים עם זלוף הרציף. היווצרות המחסום הנאותה הודגמה על ידי מכתים VE-cadherin בהשוואה לאלו שנוצרו בתנאי תרבית תאי סטטי ב microvessels ללא פגע. על ידי יישום פרוטוקולי הניסוי שפותח microvessels שלמים perfused בנפרד 6-8, אנחנו כמותית למדוד את השינויים EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בתגובה אדנוזין אדנוזין (ATP) עם ניאוןdicators ו confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. העליות נגרמות אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור דווחו כאותות תאיים הכרחיים עקב השפעות מתווך דלקת בחדירות microvessel 6-15. למרות שמחקרים קודמים הראו כמה תמונות של DAF-2 DA מכשירי microfluidic טעונים 16,17, ניתוח ברזולוציה ונתונים המתאים טרם השיג 18. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מדגים את מדידות כמותיות הראשונות של שינוי הדינמי הנגרמת אגוניסט ב האנדותל [Ca 2 +] i ו NO microfluidic ניצול ייצור מערכת מבוססת. יש טכניקות microfabrication את הגמישות לפברק למטה microchannels כדי מיקרונים אחדים ולאפשר פיתוח של תבניות מורכבות לחקות את הגיאומטריות של microvasculature in vivo. כאן הצגנו רשת microchannel טיפוסית עם שלוש רמות של הסתעפות. זֶהרשת הוא מפוברק על ידי השילוב של photolithography אשר מתבצע חדר נקי microfabrication ו ליתוגרפיה רכה.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה אגרוף</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>תמצית מוח בקר (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עיזים IgG (H+L) נוגדנים משניים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (צביעת גרעינים)&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטר זכוכית</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזיר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES תמיסת מלח חוצצת</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>מרכיב</td><td></td><td></td><td></td>תמיסת רינגר יונקים</tr><tr><td>NaCl (132 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 מ"מ)</td><td>פישר Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O (1.2 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז (5.5 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5.0 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>מלח הפס (9.1 מ"מ)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>חומצת הפס (10.9 מ"מ)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 טכנולוגיות חיים בינוניים של תרבית</td><td></td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr>מדעי <td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>של פרפורמלדהיד</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין (צביעת F-actin)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש</td><td>טייפ 3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>מפתח SU-8</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מנטרל טריפסין</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין/EDTA (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Cole-Parmer</td><td>צינורות מיקרו PTFE, 0.012 אינץ' מזהה x 0.030 אינץ' OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם הציוד</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות/תיאור</</td></tr><tr><td>חזק>בטיחות ביולוגית מכסה מנוע למינרי</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, סוג A2</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>תנור איזוטמפ</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>ליטוגרפיה ספסל</td><td>קארל סוס</td><td>MA6 ליתוגרפיה</td><td></td>מגע</tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & תריס דיאפוד 300</td><td></td></tr><tr><td>למצלמת CCD</td><td>מכשיר סאטר</td><td>למבדה 10-2</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>PVA TePla/Harrick פלזמה</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי ספין</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>מערכת משאבת מזרק</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם התוכנה</חזק></td><td><חזק> חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD סימולציה תוכנה</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>תמונות רוכשות ומנתחות ללא ייצור&nbsp;</td><td>הדמיה אוניברסלית</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור nitric oxide

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי. למרות הפיתוח של מכשירי microfluidic כבר אומץ על ידי מהנדסים למעלה משני עשורים, היישומים הביולוגיים שלהם יישארו מוגבלים. מודל microvessel במבחנה רלוונטי יותר פיסיולוגי אומת על ידי יישומים ביולוגיים חשוב לקדם את התחום ולגשר על הפערים בין in vivo ו במבחנה. כאן, אנו מציגים נהלים מפורטים לפיתוח רשת microvessel בתרבית באמצעות מכשיר microfluidic עם יכולת זלוף לטווח ארוך. אנחנו גם מדגימים ושימושיה מדידות כמותיות של שינויים המושרה אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בזמן אמת באמצעות confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. רשת microvessel נוצרהעבודה עם זלוף הרציף הראתה צמתים מפותחות בין ECS. VE-cadherin הפצה היה קרוב יותר לזה שנצפה microvessels השלם מ monolayers EC בתרבית באופן סטטי. ATP-induced עלייה זמנית EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור נמדדו כמותית ברמות תאים בודדות, אשר תוקפות את הפונקציונליות של microvessels התרבותי. מכשיר microfluidic זה מאפשר ECS לגדול תחת זרם רלוונטי מבוקר היטב, מבחינה פיזיולוגית, מה שהופך את סביבת תרבית תאים קרוב in vivo מזה בתרבויות 2D הקונבנציונליות, סטטי. עיצוב רשת microchannel הוא תכליתי מאוד, ותהליך הייצור הוא פשוט דיר. המכשיר ניתן לשלב בקלות למערכת המיקרוסקופית confocal או קונבנציונלית המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. והכי חשוב, כי רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו תשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצדפתולוגית מרכיבי דם שינו ממדגמים חולים להשפיע ECS אדם ולספק תובנה בנושאים קליניים. כמו כן ניתן לפתח כפלטפורמת הקרנת סמים.

סעיף זה מציג כמה מהתוצאות שהושגו עם רשת microvessel בתרבית שפותחה עם פרוטוקול זה. דפוס microchannel הוא רשת הסתעפות שלוש רמות (איור 1 א). בתכנון זה, סניפי ערוץ אמא רחבים 159 מיקרומטר לשתי 126 מיקרומטר ערוצים רחבים, וענפים שוב לארבעה 100 מיקרומטר ערוצי בת רחבים. סימולצית נומרית 3D בוצעה על מנת להעריך את הפצות לחץ גזירה תחת קצב הזרימה של 0.35 μl / min (איור 1 ב &#39;), אשר מציין שלוש רמות שונות של מאמץ גזירה בתוך רשת...

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח התקן מיקרופלואידי המאפשר לתאי אנדותל לגדול תחת זרימה גזירה רלוונטית פיזיולוגית, ולמדוד את השינויים בייצור הסידן והחנקן החד-חמצני (nitric oxide) המונחים על ידי אגוניסטים. מסמך זה עשוי לסייע בקידום מחקרי כלי דם זעירים בעתיד, על ידי תיקוף מודל כלי דם זעירים in vitro וגישור על הפערים בין מחקרי in vivo למחקרי in vitro. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם העיצוב הגמיש של המיקרו-תעלות המאפשר חיקוי של מערכות כלי דם שונות, ושיפור סביבת תרבית התאים כך שתהיה קרובה יותר למצב in vivo מאשר התנאים הסטטיים של תרביות מקוריות.סולי ושיאנג, שניים מהמעבדה שלי, ידגימו את הפרוצדורות. לפני התחלת העבודה, השתמשו בפוטוליתוגרפיה סטנדרטית ליצירת תבנית מאסטר ובליתוגרפיה רכה לייצור התקני המיקרו-ערוצים מ-PDMS, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להכין את התקני המיקרו-ערוצים, כסו תחילה את הכניסה והיציאה בחתיכה דקה של PDMS והניחו את ההתקן בתוך צלח פטרי עם טישיו רטוב.לאחר מכן, עטפו את הצלחת ב-Parafilm וסטריליזציה של המכשיר תחת אור UV למשך שלוש שעות לפחות. השלב הבא הוא יישום הפיברונקטין. ראשית, הניחו טיפה של 30 עד 50 microliters של PBS בכניסה.צרו ואקום בפתח היציאה כדי לשטוף את המכשיר. לאחר מכן, הניחו טיפה של fibronectin בריכוז 100 µg/mL בפתח הכניסה. צרו ואקום בפתח היציאה כדי להזרים את תמיסת

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים.  מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

הוצג פרוטוקול לבידוד ותרבות ראשונית של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) מרקמת מוח של עכברים יילודים, במטרה ליצור מודל עמיד במבחנה לחקר תפקוד מחסומי דם-מוח בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

בידוד ותרבות של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח העכבר

למדו לפתח התקן מיקרו-זרימה לגידול תאי אנדותל תחת זרימת גזירה פיזיולוגית ולמדוד שינויים ביוני סידן וייצור חנקן חמצני בתגובה ל-ATP. שיטה זו מאמתת מודל מיקרו-כלי דם במבחנה ומקדמת מחקר כלי דם קטנים.

פיתוח ואפיון של

גלה סרטונים נוספים