הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מיקרו תעלות מיקרו של אנדותל חתך מעגלי רב עומק על שבב, המחקה את הגיאומטריה התלת מימדית של in vivo, מיקרו-כלי דם ופועל תחת זרימת שפע רציפה מבוקרת. זה מושג על ידי ייצור ליטוגרפי ראשון של תבנית מאסטר עם רשת מיקרו-ערוצים חצי עגולה באמצעות התנגדות צילום חיובית הניתנת לזרימה חוזרת. השלב השני הוא להשתמש בתבנית המאסטר כדי לשכפל שני מיקרו-ערוצים של פולי דימתיל סואן, ליישר אותם ולחבר אותם ליצירת רשת מיקרו-ערוצים גלילית.

לאחר מכן, תאי האנדותל הראשוניים של וריד הטבור האנושי יושבים בתוך רשת המיקרו-ערוצים לפני תרבית התאים בתנאי זלוף בינוני רציף מבוקר לפרק זמן שבין ארבעה ימים לשבועיים. בסופו של דבר, חד-שכבת תא מפגש המסומנת על ידי עמידת הממברנה וגרעינים העומדים מתחת למיקרוסקופים מפותחת לאורך המשטח הפנימי של רשת המיקרו-ערוצים חישוב כלי מיקרו פונקציונליים בהם יכול לספק פלטפורמה לחקר תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מבחני מיקרו כלי דם בודדים קונבנציונליים כגון מבחני נדידת תאי אנסו, וכך שתי מבחני היווצרות, ומבחני הטבעת הימנית והמוזיקלית מוגבלים לשחזור כלי מיקרו בודדים ביחס לגיאומטריה תלת מימדית ובקרת זרימה רציפה.

היתרון העיקרי של הטכניקות שלנו, שיטת המיקרו-ייצור הקיימת שלנו, הוא שהיא יכולה לייצר באופן קונבנציונלי רשת תעלות מיקרופלואידיות מרובות עומק המחקה את הגיאומטריות התלת-ממדיות המורכבות של כלי מיקרו in vivo בעלי חתכים מעוגלים. זה גם מאפשר לתכנן מערכות ביומגנטיות מיקרו-וסקולריות, שמצייתות בערך לאט יותר ושומרות על זרימת הנוזל ברמה הנדרשת כך שעמידות התעלה הכוללת נמוכה והזרימה שאיבדנו אחידה יותר בכל הרשת המדגימה את ההליך יהיה סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. הליך זה מתחיל בייצור תבנית מאסטר פוטו-רזיסט המורכבת מתעלות מיקרו בקוטר שבין 30 מיקרון ל-60 מיקרון כמפורט בפרוטוקול הטקסט, מעביר בקצרה את התנגדות הצילום החוזרת מהמקרר בארבע מעלות צלזיוס לחדר הנקי 24 שעות לפני השימוש, ומאפשר לו להתחמם לטמפרטורת החדר.

התחל בציפוי ספין של שכבת ההתנגדות לתמונות הזרימה החיובית על מצע סיליקון נקי מראש בהתאם להליך בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן חשוף את הפוטו-רזיסט לאור UV דרך מסכה מעוצבת לפני פיתוח תעלות המיקרו המעוצבות. לבסוף, לאחר הזרמה מחדש, צור רשת מיקרו-ערוצים חצי עגולה.

לאחר שתבנית המאסטר מוכנה, הכינו תמיסת פולימתיל סואן או PDMS ביחס משקל של 10 לבסיס אחד לחומר ריפוי וערבבו אותה היטב באמצעות מערבל צנטריפוגלי פלנטרי. יצוק את תמיסת ה-PDMS על תבנית המאסטר של ההתנגדות לצילום שהוזרמה מחדש. הנח את ה-PDMS היצוק בחומר ייבוש למשך 15 דקות לדגה.

השתמש בגז חנקן כדי להסיר את כל הבועות שנותרו במידת הצורך. אופים את ה-PDMS בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לאפשר לו להחלים. לאחר מכן הסר את שכבת ה-PDMS המתרפאת מתבנית המאסטר.

השתמש באגרוף מושחז כדי ליצור חורי כניסה ויציאה על ידי ניקוב חורים ברשת הערוצים. נקה את פני השטח של ה-PDMS באמצעות גז חנקן. טפל בשתי שכבות PDMS עם פלזמת חמצן למשך 30 שניות בתוך מנקה פלזמה בלחץ פעולה של 45 מילטו וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל מעוקב לדקה.

לאחר מכן יישר את משטחי ה-PDMS באופן ידני תחת מיקרוסקופ אופטי. השתמש בטיפת מים במידת הצורך לשליטה טובה יותר ביישור. לבסוף, אופים את המכשיר בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג תרבות מליטה קבועה.

תאי אנדותל ראשוניים של וריד הטבור האנושי או VE במדיום תרבית עם L-גלוטמין בתוספת סרום בקר עוברי 10%. טפל במכשיר בפלזמת חמצן למשך חמש דקות בלחץ הפעלה של 45 מיל וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל מעוקב לדקה. לאחר מכן טען את המכשיר במים נטולי יונים וטפל באור UV למשך שמונה שעות במכסה מנוע למינרי לבטיחות ביולוגית לעיקור.

יום אחד לפני שהתאים מוכנים, שטפו את המכשיר עם מי מלח או PBS עם פוספט אחד ולאחר מכן מצפים בפיברונקטין. דוגרים במקרר בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שהתאים מתלכדים, קצרו אותם על ידי שטיפת התאים תחילה בתמיסת מלח חוצצת, ולאחר מכן טיפול בתאים בטריפסין EDTA לאחר הוספת טריפסין.

דגרו על התאים במשך שתיים עד שש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הטריפסין, יש לנטרל את הטריפסין EDTA עם תמיסת נטרול טריפסין. ספרו את התאים, ואז צנטריפוגה אותם לפני ההחייאה.

השעיה במדיום תרבית עם דקסטרין דקסטרין 8% משמשת להגברת הצמיגות הבינונית כדי לסייע בישיבה וחיבור טובים יותר של התאים בעקבות ציפוי FI enc ENC. שטפו את המכשיר עם XPBS אחד ואז טענו את המכשיר במדיום תרבית לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן נטענים למכשיר תאים במדיום תרבית דקסטרין 8% בריכוז של שלושה עד 4 מיליון תאים למיליליטר.

הניחו טיפה של 20 מיקרוליטר של תאים בכניסה אחת של המכשיר והטו אותה כדי להכניס את התאים לתעלה המיקרופלואידית. לאחר 15 עד 20 דקות, התאים יתחילו להיצמד לדפנות התעלות. סובב את המכשיר כל 15 דקות כדי ליצור פיזור אחיד יותר של תאים.

במידת הצורך ניתן לבצע טעינה נוספת. לאחר חמש עד שש שעות של תרבית סטטית, התאים המחוברים יתחילו להתפשט במלואם. הגדר זלוף לטווח ארוך באמצעות מערכת משאבת מזרק בשלט רחוק עם זרימה קבועה של 10 מיקרוליטר לשעה, ניתן לכוונן את הזלוף לקצב זרימה גבוה יותר ויכול להימשך פרק זמן בין ארבעה ימים לשבועיים.

כאשר התאים מגיעים למפגש בתוך המכשיר, ראשית, שטפו את המכשיר עם XPBS אחד כדי להסיר היטב את המדיום. לאחר מכן טען את המכשיר בצבע אדום מדולל לאחר הדגירה של המכשיר בחושך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים אותו עם מדיום תרבות כדי לעצור את הכתמים.

דגירה ארוכה של הצבע עלולה לגרום לרעילות תאית ולחוסר הידבקות. לאחר מכן טען את המכשיר בצבע כחול מדולל באחד XPBS דגירה בחושך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפה יסודית של המכשיר עם XPBS אחד. בדוק את צביעת התא תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך.

אם הצביעה טובה, טען את המיקרו-ערוצים במדיום קיבוע, ואז טבל את המכשיר במדיום קיבוע וכסה אותו לחלוטין בנייר אלומיניום. אחסן את המכשיר במקרר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע מהמכשיר להתייבש ולהלבין המכשיר הקבוע מוכן כעת להדמיה קונפוקלית, שניתן לעשות זאת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ומיקרוסקופ אופטי. שימשו לאפיון הפוטו-רזיסט של הזרימה החוזרת וערוץ ה-PDMS המשוכפל לפני ואחרי התקדמות הזרימה מחדש.

המאפיינים הגיאומטריים של רשת PDMS Microchannel אופיינו והוצגו כאן. חתכים עגולים של תבניות PDMS מראים את מידות הערוץ בכל רמת הסתעפות. התוצאות מראות כי טכניקת הזרימה החוזרת של התנגדות הצילום יכולה ליצור רשתות תעלות מסתעפות מרובות עומק בגישה נוחה יותר על ידי טכניקות זרימה חוזרת של פוטו-רזיסט ולאפשר תכנון של המערכות הביומימטיות המיקרו-וסקולריות, אשר מצייתות בערך לחוק מוריי המוצגות כאן הן תמונות מיקרוסקופיה המשתמשות בצבע קרום תא פלואורסצנטי באדום וצבע גרעיני תאים בכחול.

תצוגות החתך המעגליות חשפו כי ה-VE ריפד את המשטח הפנימי של רשת מיקרו-ערוצים גלילית באזורי הסתעפות שונים. בגלל הגיאומטריות המורכבות של מיקרו כלי דם in vivo, ניטור בזמן אמת של כלי הדם הקטנים הללו קשה. השבב המבוסס על P DM S שפותח מציע תכונות אופטיות טובות ומאפשר הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת של תעלות המיקרו אנדותל כפי שמוצג בסרטון קונפוקלי זה של רירית התא לאורך רשת הערוצים המעגלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר את הזרימה מחדש למצב המוני זה. צור רשת מיקרו ערוצים PDMS בחתך מעגלי, טען את תאי התא האנדו לתוך המכשירים והגדר שפע מדיה לטווח ארוך. לסיכום, המיקרו-ערוצים האנדו-סדרתיים שפותחו על שבב מספקים גישה מהירה וניתנת לשחזור ליצירת רשתות מיקרו-ערוצים מרובות עומקים מעגליים, המחקה את הגיאומטריה של כלי מיקרו InVivo.

הליך זה ממחיש את השימוש ביכולות ייחודיות בטכנולוגיות מיקרו-מזון מתקדמות ליצירת מודל מיקרו-וסקולרי עם בקרת זלוף רציפה לטווח ארוך, כמו גם איכות גבוהה ויכולת הדמיה בזמן אמת עם התועלת הגוברת של תעלות מיקרו-מזון לביולוגיה של התא, הנדסת רקמות ויישומי ביו-הנדסה. תעלות המיקרו הסדרתיות האנדו על שבב הן חיבור פוטנציאלי למחקר מיקרו-וסקולרי.