הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip
21 באוקטובר 2013
פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.
המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח שבב עם מיקרו-ערוצים עגולי חתך בעומקים משתנים המכילים תאי אנדותל, המדמה את הגאומטריה התלת-ממדית של מיקרו-כלי דם in vivo, ופועל תחת זרימת פרפוזיה רציפה ומבוקרת. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור פוטוליתוגרפי של תבנית מאסטר עם רשת מיקרו-ערוצים בעלת חתך חצי-סמי-ספירלי, תוך שימוש בפוטו-רזיסט חיובי בעל יכולת זרימה (reflowable). השלב השני הוא שימוש בתבנית המאסטר לשכפול שני מיקרו-ערוצי poly dimethyl siloxane, יישורם והדבקתם ליצירת רשת מיקרו-ערוצים גלילית.
בשלב הבא, תאי אנדותל ראשוניים מווריד טביליות אנושי (human umbilical vein endothelial cells) מושקעים בתוך רשת המיקרו-ערוצים לפני גידול התאים תחת תנאים מבוקרים של פרפוזיה רציפה של מצע גידול למשך תקופה שבין ארבעה ימים לשבועיים. בסופו של דבר, מתפתח לאורך פני השטח הפנימיים של רשת המיקרו-ערוצים שכבה Ein-cell monolayer של תאים בהסנכרון (confluence), המזוהה תחת המיקרוסקופ על ידי ממברנות וגרעינים ניצבים, המאפשרת חישוב של מיקרו-כלי דם פונקציונליים שיכולים לספק פלטפורמה למחקר של תופעות וסקולריות מורכבות. עם זאת, בדיקות קונבנציונליות של מיקרו-כלי דם בודדים, כגון בדיקות נדידה של תאי אנדותל, בדיקות יצירת שפופיות ובדיקות טבעת אנדותל, מוגבלות ביכולתן לשחזר מיקרו-כלי דם בודדים ביחס לגאומטריה תלת-ממדית ובקרה של זרימה רציפה.
היתרון המרכזי של הטכניקות שלנו, שיטת המיקרו-פבריקציה הקיימת שלנו, הוא היכולת לייצר באופן קונבנציונלי רשת ערוצים מיקרו-פלואידיים בעומקים משתנים, המדמה את הגיאומטריות התלת-ממדיות המורכבות של כלי דם מיקרוסקופיים in vivo בעלי חתכים רוחביים מעגליים. היא מאפשרת גם לתכנן מערכות ביו-מגנטיות מיקרו-וסקולריות, המצייתות בקירוב לזרימה איטית יותר ושומרות על זרימת הנוזלים ברמה נדרשת, כך שההתנגדות הכוללת של הערוצים נמוכה והזרימה שמתקבלת היא אחידה יותר לאורך הרשת; את ההליך תדגים סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. הליך זה מתחיל ביצירת תבנית מאסטר מפוטורזיסט, המורכבת מערוצים מיקרוסקופיים בעל קטרים שבין 30 microns ל-60 microns כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט; בקצרה, העבירו את הפוטורזיסט להמסה (reflow) מהמקרר בטמפרטורה של 4 °C לחדר הנקי 24 שעות לפני השימוש, והמתינו שיגיע לטמפרטורת החדר.
התחילו בציפוי ספין (spin coating) של שכבת פוטורזיסט חיובי עם יכולת זרימה חוזרת (reflow) על מצע סיליקון שעבר ניקוי מוקדם, בהתאם לנוהל המופיע בטקסט. לאחר מכן, חשפו את הפוטורזיסט לאור UV דרך מסכה תבניתית לפני פיתוח מיקרו-תעלות התבנית. לבסוף, לאחר תהליך הזרימה החוזרת (reflow), צרו רשת מיקרו-תעלות בעלת חתך רוחבי חצי-סמי-סמי-עיגולי.
ברגע שתבנית המאסטר מוכנה, הכין תמיסת polymethyl siloxane או PDMS ביחס משקלי של 10 ל-1 בין הבסיס לסוכן הקישוי, וערבב אותה היטב באמצעות מיקסר צנטריפוגלי פלנטרי. יצוק את תמיסת ה-PDMS על תבנית המאסטר של הפוטורזיסט שעברה reflow. הנח את ה-PDMS היצוק במייבש (desiccator) למשך 15 דקות לצורך ניקוון (degassing).
השתמש בגז חנקן כדי להסיר בועות שנותרו, במידת הצורך. אפ את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך שלוש שעות כדי לאפשר לו להתקשות. לאחר מכן, הסר את שכבת ה-PDMS שהתקשתה מהתבנית המקורית.
השתמשו במנקב חד כדי ליצור חורי כניסה ויציאה על ידי ניקוב חורים ברשת הערוצים. נקו את פני השטח של ה-PDMS באמצעות גז חנקן. טפלו בשתי שכבות PDMS בפלזמה של חמצן למשך 30 שניות בתוך מכשיר לניקוי פלזמה בלחץ עבודה של 45 milato ובקצב זרימה של חמצן של 3.5 cubic feet per minute.
לאחר מכן, יישרו את משטחי ה-PDMS ידנית תחת מיקרוסקופ אופטי. השתמשו בטיפת מים במידת הצורך לשליטה טובה יותר ביישור. לבסוף, אפו את ההתקן בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות כדי להשיג הידבקות קבועה.
תאי אנדותל ראשוניים מווריד טבעתי אנושי או VE בתווך גידול עם L-glutamine מועשר ב-10%fetal bovine serum. יש לטפל במכשיר בפלזמת חמצן למשך חמש דקות בלחץ עבודה של 45 milit ובקצב זרימת חמצן של 3.5 cubic feet per minute. לאחר מכן, יש למלא את המכשיר במים דאיוניים ולטפל באור UV למשך שמונה שעות במנדף ביו-בטיחות למינרי לצורך עיקור.
יום אחד לפני שהתאים מוכנים, יש לשטוף את המכשיר עם phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS ולאחר מכן לצפות אותו בפיברונקטין. יש להדגיר במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. לאחר שהתאים הגיעו למצב של התמסגרות (confluency), יש לקצור אותם על ידי שטיפת התאים תחילה בתמיסת HEPES buffered saline, ולאחר מכן טיפול בתאי ב-trypsin EDTA לאחר הוספת trypsin.
דגרו את התאים למשך שתי עד שש דקות ב-37 °C. לאחר השלמת תהליך הטרייפסינציה, נטרלו את ה-trypsin EDTA באמצעות תמיסת נטרול טרייפסין. ספרו את התאים, ולאחר מכן סבבו אותם בצנטריפוגה לפני הריסספנזיה.
שימוש במדיום תרבית עם 8% dextrin נועד להעלות את צמיגות המדיום כדי לסייע להשבחה של השקעת התאים והיצמדותם לאחר ציפוי ה-FI enc ENC. שטפו את ההתקן עם XPBS אחד, ולאחר מכן טענו את ההתקן במדיום תרבית לפני הדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, טענו להתקן תאים במדיום תרבית עם 8% Dextrin בריכוז של 3 עד 4 מיליון תאים ל-milliliter.
הנח טיפה של 20 µL של תאים באחד מפתחי הכניסה של ההתקן והטה אותו כדי להחדיר את התאים לערוץ המיקרופלואידי. לאחר 15 עד 20 דקות, התאים יתחילו להיבטות לדפנות הערוצים. סובב את ההתקן מדי 15 דקות כדי ליצור התפלגות אחידה יותר של התאים.
במידת הצורך, ניתן לבצע טעינה נוספת. לאחר חמש עד שש שעות של תרבית סטטית, התאים הנצמדים יתחילו להיפרש באופן מלא. הגדירו פרפוזיה לטווח ארוך באמצעות מערכת משאבת מזרקים בשליטה מרחוק עם זרימה קבועה של 10 µL לשעה; ניתן להתאים את הפרפוזיה לקצב זרימה גבוה יותר, והיא יכולה להימשך לתקופה של בין ארבעה ימים לשבועיים.
כאשר התאים מגיעים למצב של התמזגות (confluence) בתוך ההתקן, ראשית, שטפו את ההתקן ב-XPBS אחד כדי להסיר לחלוטין את המצע. לאחר מכן, טענו את ההתקן בצבע אדום מדולל, ולאחר מכן הדגירו את ההתקן בחושך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ההתקן במצע תרבית כדי להפסיק את הצביעה.
דגירה ממושכת של הצבע עלולה לגרום לרעילות תאית ולהיפרדות מהמצע. לאחר מכן, טענו את המכשיר בצבע כחול מהול ב-one XPBS ודגרו בחושך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, לפני שטיפה יסודית של המכשיר ב-one XPBS. בחנו את צביעת התאים תחת מיקרוסקופ אורוכי הפוך.
אם הצביעה תקינה, טענו את המיקרו-תעלות בתווך קיבוע, לאחר מכן טבלו את ההתקן בתווך קיבוע וכסו אותו לחלוטין בנייר אלומיניום. אחסנו את ההתקן במקרר בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס כדי למנוע מההתקן להתייבש ולהבהיר. ההתקן המקובע מוכן כעת לדימות קונפוקאלי, שניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר, מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת ומיקרוסקופיה אופטית. אלו שימשו לאפיון הפוטו-רזיסט לאחר ה-reflow ואת תעלת ה-PDMS המשוכפלת לפני ואחרי תהליך ה-reflow.
המאפיינים הגיאומטריים של רשת מיקרו-הערוצים מ-PDMS אופיינו והוצגו כאן. חתכים רוחביים מעגליים של תבניות ה-PDMS מראים את ממדי הערוצים בכל רמת פיצול. התוצאות מראים כי טכניקת זרימת מחדש (reflow) של הפוטורזיסט יכולה ליצור רשתות ערוצים מסועפות בעומקים שונים בגישה נוחה יותר, ומאפשרת תכנון של מערכות ביומימטיות של מיקרו-כלי דם המצייתות בקירוב לחוק מורי (Murray's law); המוצגות כאן הן תמונות מיקרוסקופיות המשתמשות בצבע פלואורסצנטי לממברנת התא באדום ובצבע גרעין התא בכחול.
מבטי חתך רוחביים מעגליים גילו כי ה-VE ריפאה את המשטח הפנימי של רשת מיקרו-תעלות גלילית באזורי הסתעפות שונים. בשל הגאומטריה המורכבת של מיקרו-כלי דם in vivo, ניטור בזמן אמת של כלי דם קטנים אלו הוא קשה. השבב המבוסס על PDMS שפותח מציע תכונות אופטיות טובות ומאפשר הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת של מיקרו-תעלות אנדותלליות, כפי שניתן לראות בסרטון קונפוקלי זה של ריפוי התאים לאורך רשת התעלות המעגלית.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ייצור הזרימה החוזרת (reflow) עבור מצב מסה זה. צרו רשת מיקרו-ערוצים מ-PDMS בעלי חתך רוחבי מעגלי, טענו תאי endo לתוך ההתקנים, והקימו מערכת לפרפוזיה ארוכה של מצע גידול. לסיכום, מיקרו-ערוצים סדרתיים של endo שפותחו על שבב מספקים גישה מהירה וניתנת לשחזור ליצירת רשמי מיקרו-ערוצים בעלי חתך רוחבי מעגלי ובעומקים מרובים, המדמים את הגאומטריה של כלי דם זעירים InVivo.
הליך זה מדגים את השימוש ביכולות ייחודיות בייצור מיקרו-מתקדם ובטכנולוגיות מיקרו-פלואידיקה כדי ליצור מודל מיקרו-וסקולרי עם בקרת פרפוזיה רציפה לטווח ארוך, וכן יכולת דימוי בזמן אמת ובאיכות גבוהה, לאור התועלת הגוברת של ערוצים מיקרו-פלואידיים עבור יישומים בביולוגיה של התא, בהנדסת רקמות ובביוהנדסינג. השבב בעל ערוצים מיקרו-סריאליים אנדו-תאיים מהווה כלי פוטנציאלי למחקר מיקרו-וסקולרי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמה של מיקרו-תעלות על שבב (microchannels-on-a-chip) המדמה את הגאומטריה התלת-ממדית של מיקרו-כלי דם in vivo. הפלטפורמה מאפשרת זרימת פרפוזיה רציפה ומבוקרת והדמיה איכותית בזמן אמת, מה שהופך אותה למתאימה למחקר של מיקרו-כלי דם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה של כלי דם
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- מחקר של מיקרו-כלי דם הוא חיוני להבנת תופעות כלי דם מורכבות.
- בדיקות קונבנציונליות נכשלות לעיתים קרובות בשחזור הגאומטריה התלת-ממדית והזרימה הרציפה של מיקרו-כלי דם.
- תאי אנדותל ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד ובבריאות של כלי דם.
- טכניקות מיקרו-פבריקציה יכולות לשפר את חקר מערכות כלי הדם.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה מיקרופלואידית המדמה באופן מדויק מיקרו-כלי דם in vivo.
- מתן אפשרות לדימות בזמן אמת ולפרופוזיה מבוקרת לצורך מחקרים וסקולריים.
- אספקת שיטה מהימנה לתרבית של תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית (3D).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור פוטוליתוגרפי של תבנית מאסטר עבור מיקרו-ערוצים.
- שכפול התבנית באמצעות PDMS ליצירת רשת המיקרו-ערוצים.
- זריעה של תאי אנדותל ראשוניים מווריד טנילי אנושי בערוצים.
- פרפוזיה רציפה של מצע גידול לשמירה על תנאי תרבית התאים.
תוצאות עיקריות
- שכבה חד-שכבתית (monolayer) רציפה של תאי אנדותל פותחה בתוך המיקרו-ערוצים.
- הפלטפורמה דמה בהצלחה את המבנה התלת-ממדי של מיקרו-כלי דם.
- דימות בזמן אמת הדגים את התפקוד של תאי האנדותל.
- המערכת מאפשרת לחקור תופעות כלי דם מורכבות תחת תנאים מבוקרים.
מסקנות
- פלטפורמת המיקרו-תעלות על שבב היא כלי בעל ערך למחקר כלי דם.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות תאי אנדותל בהקשר תלת-ממדי.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל פלטפורמה זו כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה של מיקרו-כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים מיקרו-וסקולריים הניתנים לשחזור in vitro הם קריטיים לשלבים מוקדמים של גילוי תרופות, שכן הם מאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון חיזוי במחקרי ביולוגיה של כלי דם. פלטפורמה זו של מיקרו-ערוצים אנדותליאליים על שבב, בעלת חתך רוחבי מעגלי ובעומקים משתנים, נותנת מענה למגבלות של בדיקות קונבנציונליות על ידי שחזור גאומטריה תלת-ממדית הדומה לתנאי in vivo ותמיכה בפרפוזיה רציפה. המערכת משפרת את הרציפות התרגומנית ותומכת בתיקוף יעילים של מטרות עבור פורטפוליים המתמקדים בכלי דם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות בביולוגיה של כלי דם בסביבה מיקרוסקופית תלת-ממדית רלוונטית פיזיולוגית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שמירה של שכבות מונו-שכבה של תאי אנדותל תחת זרימה מבוקרת.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על תגובות אנדותליאליות למשתנים ניסיוניים.
- משפר את רמת הוודאות החזויה עבור מטרות וסקולריות על ידי חיקוי של ארכיטקטורת מיקרו-כלי דם in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכה כמותית של התנהגות תאי אנדותל.
- תומכת בפיתוח מערכי בדיקה באמצעות פרפוזיה רציפה ויכולות דימות בזמן אמת.
- מאפשרת הכנה של מערכות מיקרו-וסקולריות מאושרות לסריקת תרכובות בשלבים הבאים.
- מקלות על סקביליות ושימוש חוזר בפלטפורמה תחת תנאים ניסויים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים כליים הרלוונטיים למחלה עבור מחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- שומר על רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בתרבית פרפוזיה לטווח ארוך.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אספקת נתונים רלוונטיים פיזיולוגית על תפקוד מיקרו-וסקולרי.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון עבור טיפולים המכוונים למערכת כלי הדם.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פלטפורמה מיקרופלואידית זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קלניโดยst enabling בדיקת השערות, קריאות כמותיות ומודלים תרגומיים של מערכות מיקרו-וסקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מניפולציה מבוקרת של משתנים ותצפית בזמן אמת.
- סריקה: מספק תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות בהקשר אנדותליאלי תלת-ממדי.
- אנליטיקה: מספקת דימות ברזולוציה גבוהה ומדידה כמותית של היווצרות ותפקוד של שכבה אנדותליאלית אחת (monolayer).
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי שכפול של גאומטריה וזרימה מיקרו-וסקולרית הדומים למצב in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה עבור יישומים מגוונים של מחקר וסריקה וסקולרית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי יעדים וסקולריים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מידול מיקרו-וסקולרי באמצעות פרוטוקולי ייצור ותרבית הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל הוני עבור תוכניות וסקולריות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים המכוונים לכלי דם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-פבריקציה (microfabrication), מיקרופלואידיקה ותרבית תאי אנדותל.
- דורש גישה לתשתיות של פוטוליתוגרפיה, ליתוגרפיה רכה והדמיה קונפוקלית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית כדי להבטיח ייצור מכשירים וזריעה של תאים הניתנים לשחזור.
- ניתן להתאמה למקורות שונים של תאי אנדותל ולתנאים ניסיוניים משתנים.
- מוגבל בשל הצורך ביישור (alignment) והדבקה מדויקים של מיקרו-ערוצי PDMS.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
3:10
Soft Lithography Fabrication of PDMS Microchannel Network
4:34
HUVEC Culture and Seeding in the Chip
7:03
Cell Staining and Microscope Characterization
8:10
Results: Multi-depth Microchannel Networks Mimic the Complex 3D Geometries of In vivo Microvessel
9:35
Conclusion
2:22
Photolithography Fabrication of Photoresist Master Mold
