סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים שינויים בפרוטוקול CLARITY המקורי, שמניבים תוצאות עקביות וחסכוניות יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח, כגון מורפולוגיה תלת מימדית, וקישוריות במערכת העצבים המרכזית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא משפרת את עקביות הניקוי האופטי והמיקרוסקופיה במערכת העצבים המרכזית של העכבר.

בצורה חסכונית וניתנת לשחזור. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון שבניית תא ההדמיה מסובכת ואינה ברורה בקלות מתיאור כתוב.

השג רקמת מוח וחוט שדרה קבועה פרפורמלדהיד מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. חתכו את המוח על ידי הצבתו במטריצת מוח עכבר מפלסטיק וחיתוך לאורך קו האמצע בעזרת להב מטריצה. הוסף כל חצי כדור וחוט שדרה כדי להפריד צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

כל אחד מהם מכיל 40 מיליליטר תמיסת הידרוג'ל. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופורים. ולדגור את הצינורות המכילים דגימות והידרוג'ל בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין במשך שבעה ימים.

לאחר תקופת הדגירה השליכו 25 מיליליטר הידרוג'ל והשאירו את הדגימה וכ-25 מיליליטר הידרוג'ל בצינור הצנטריפוגה. לאחר מכן יש לנטרל את הדגימה על ידי הסרת המכסה, הנחת צינור הצנטריפוגה בצנצנת ייבוש וחיבור הצנצנת לוואקום. החל את הוואקום למשך 10 דקות לפחות.

לנער בעדינות כדי לעקור את בועות החמצן הנפלטות. לאחר 10 דקות, החליפו את הוואקום בצנצנת הייבוש בגז חנקן 100% במשך שתיים-שלוש דקות. לאחר שהלחץ משתווה וניתן לפתוח את החלק העליון של צנצנת הייבוש, יש לכסות במהירות את הצינור כדי למנוע החדרה מחודשת של חמצן.

לאחר מכן פילמרו את ההידרוג'ל על ידי הנחת הצינור עם הדגימה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות עד להשלמת הפילמור. לאחר שלוש שעות ההידרוג'ל הפולימרי יקבל עקביות דמוית ג'ל. השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה המפולימרית מצינור הצנטריפוגה ולאחר מכן חתוך את עודפי ההידרוג'ל מהדגימה.

לבסוף, הסר את ההידרוג'ל שנותר על ידי הנחת הדגימה על מגבון נטול מוך, ושפשוף עדין וגלגול הרקמה עליו, תוך השארת שכבה דקה בלבד של הידרוג'ל מפולימר על הדגימה. כדי להתחיל בתהליך הסרת השומנים, העבירו את הדגימה המפולימרית לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של מאגר פינוי, ודגרו ב-45 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך שבעה ימים. החלף את המאגר מדי יום במהלך תקופת שבעת הימים הראשונית הזו על ידי שפיכת מאגר הפינוי המשומש למיכל פסולת כימית.

והוספת 45 מיליליטר של חיץ פינוי טרי. לאחר שכל השומנים מסיסים והרקמה מגיעה לשקיפות, העבירו את הדגימה לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר מלא ב-45 מיליליטר PBST, ושטפו ארבע פעמים ב-40 מעלות צלזיוס בניעור עדין במהלך 24 השעות הבאות, כדי להסיר שאריות SDS. לאחר שטיפת ה-PBST האחרונה, העבירו את הדגימה לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מיליליטר מלא במיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI ו-1xPBST.

עוטפים בנייר כסף ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. למחרת יש לכבס שלוש פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר למשך שש שעות לפחות בכל כביסה. ואז המשך להתאמת מקדם שבירה.

כדי להתחיל בחלק זה של ההליך, העבירו את הדגימה לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מיליליטר מלא ב-2-2 תיודיתנול ו-1xPBS ב-PH 7.5 ודגרו כפי שמוצג על המסך. לקראת סוף הדגירה השנייה, צור והדמיה תא על ידי גלגול חתיכת דבק רב פעמי לתוך גליל בקוטר אחיד רק מעט גדול מעובי הדגימה. הניחו את הגליל בעיגול פתוח על צלחת תחתית זכוכית של 40 מילימטר.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה P1000 כדי ליצור אטימה בין הדבק הרב פעמי לזכוכית על ידי גלגולו סביב השפה החיצונית של הגליל. פיפטה כ-100 מיקרוליטר של 63% TDE על צלחת הזכוכית ופזר אותה סביב כדי לכסות את משטח הזכוכית בתוך מעגל הדבק הרב פעמי. לאחר מכן השתמש במרית כדי להניח בזהירות את הדגימה באמצע העיגול, תוך הקפדה לא ליצור בועות.

לאחר מכן, פיפטה נוספת של 100 מיקרוליטר של 63% TDE ישירות על הדגימה, והנח מיד זכוכית כיסוי עגולה של 40 מילימטר מעל הדבק הרב-פעמי. השתמש באצבע המורה, האמצעית והקמיצה של שתי הידיים כדי ללחוץ בזהירות סביב היקף העיגול עד שזכוכית הכיסוי יוצרת מגע עם הדגימה. כעת, הביאו לאט את צלחת הזכוכית התחתונה למצב זקוף מונח על משטח, ולאחר מכן הוסיפו 63% TDE עם פיפטה עד שהתמיסה מגיעה לפתח הקטן בחלק העליון.

השתמש במגבון נטול מוך כדי לייבש את קצה הפיפטה כך שהתמיסה לא תטפטף על הזכוכית. לבסוף, הוסף אלסטומר סיליקון לפתח הקטן כדי לסגור את המעגל וליצור תא סגור. המתן חמש דקות לייבוש ולאחר מכן המשך להדמיה.

הנח את תא ההדמיה עם הדגימה בפנים על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר. פתח את תוכנת ההדמיה, כדי להפעיל את לייזר עירור הארגון, לחץ על לשונית התצורה בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן על סמל הלייזר. סמן את התיבה שליד ארגון כדי להפעיל את הלייזר והעבר את סולם ההחלקה ל-30%חזור ללשונית הרכישה בחלק העליון.

בתיבת הגדרות נתיב האלומה, עבור אל תיבת ההגדרות לחיסכון בעומס, ובחר בתפריט הנפתח כדי לבחור את ערוץ אורך הגל המתאים לפליטת YFP. בתיבת הגדרות הערוץ, בחר את היעדים המתאימים להדמיה על-ידי לחיצה על ההיפר-קישור האדום המסומן באובייקט הנוכחי האובייקטיבי. השתמש במטרות עם מרחק עבודה גדול מעובי הרקמה.

וצמצם מספרי גדול כדי למקסם את רזולוציית התמונה המשולבת, ולמזער את עובי המקטע האופטי. בעמודה השמאלית של התפריטים הנפתחים פתח את חלון רזולוציית XY כדי להגדיר את מטריצת הרכישה, הנקראת פורמט ל-1024x1024 או ערך המתאים למגבלת הרזולוציה הרוחבית של המטרה. הגדר את גורם הזום נמוך ככל האפשר.

1.7 משמש כאן. באותו חלון הגדר פרמטרים של ממוצע שורה שמינית וממוצע מסגרת אחת על ידי הורדת התפריטים המסומנים בנפרד בהתאם. אתר את הדוגמה באמצעות פקדי ה-stage.

ברגע ששדה מייצג גלוי, הגדר את הרווח בין 760 ל-780, ואת ההיסט בין 1.0 ל-1.5 עבור YFP. בחר סריקת אריחים. ואז הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של מחסנית Z שיש לרכוש.

הגדר את עובי הקטע האופטי על סמך מגבלת הרזולוציה של הקטע האופטי של היעדים ולאחר מכן התחל את הרכישה. תמונה זו מציגה נוירונים חיוביים של YFP בקליפת המוח ובהיפוקמפוס שצולמו כהגדלה פי 5 ושוחזרו בתלת מימד. סרגל קנה המידה מייצג מילימטר אחד.

הקרנה בעוצמה מקסימלית זו של ערימת תמונות פי 10 של קליפת המוח מדגימה את ההפלה הדנדריטית של נוירונים פירמידליים בשכבה הקורטיקלית חמש. כאן סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרון. כאן ביטוי THY-1YFP מוצג בחוט שדרה צווארי וחזה שלם, מצולם בהגדלה פי 5 ומשוחזר בתלת מימד.

סרגל קנה המידה מייצג שני מילימטרים. לבסוף, הקרנה בעוצמה מקסימלית זו של ערימה מצולמת פי 10 של חוט השדרה, מדגימה אקסונים בודדים, פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרון. אם היא מבוצעת כראוי, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שבועיים עד ארבעה שבועות עבור חוט שדרה שלם, וארבעה עד שישה שבועות עבור מוחות חתוכים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון כימיה אימונו-היסטית על מנת לענות על שאלות הדורשות פנוטיפ ביוכימי מורכב יותר. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לנקות אופטית ולצלם מערכת עצבים מרכזית של עכבר. שימוש בבהירות פסיבית, ומיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר.