Name: סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו שיטת CLARITY פסיבית לניקוי אופטי של מערכת העצבים המרכזית בעכבר. הפרוטוקול המשופר מספק תוצאות עקביות וחסכוניות לחקר מורפולוגיה תלת-ממדית וקישוריות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על בנדיבות על ידי המכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NIH / NINDS) מענק 1R01NS086981 וקרן הילטון קונרד נ. אנו מודים לד&quot;ר לורן בן-טולילה וד&quot;ר מתיו Schibler על עזרתם שלא יסולא בפז עם מיקרוסקופיה confocal. אנו מודים לאלה שתרמו בפורום CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). אנחנו במיוחד להודות לד&quot;ר קרל דייזרות עבור פתיחת המעבדה שלו ללמד טכניקה המרתק הזה. המחברים מודים על התמיכה הנדיבה של מינהל המחקר הרפואי למיפוי המוח, קרן תמיכה למיפוי המוח, פירסון-לאבלייס קרן, קרן Ahmanson, קרן הצדקה של חברות קפיטל גרופ, וויליאם מ ולינדה ר Dietel פילנתרופית קרן, קרן Northstar . מחקר מדווח בפרסום זה גם מומן בחלקו על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר על ידי משרד המנהל של האומההמכונים אל הבריאות תחת מספרי הפרס C06RR012169, C06RR015431, ו S10OD011939. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות. Thy1-YFP, PLP-EGFP ו- PV-tdTomato עכברים ששימשו בניסויים אלה, אבל כל בעכברים המבטאים חלבוני ניאון ניתן לפנות בהצלחה צילמו. 1. רקמות הכנה זהירות: Paraformaldehyde (PFA) ו acrylamide רעילים מגרים. בצע ניסויים ניצול ריאגנטים אלה במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה בתא המתת חסד עם ~ 1 מ&quot;ל של isoflurane עד הנשימה נפסקת (~ 2 - 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת peristaltic מוגדר ~ 5 מ&quot;ל / דקה כדי intracardially perfuse את העכבר עם פתרון זלוף (טבלה 1) ב 4 ° C עד דם מנוקה מן הרקמות (5 - 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את perfusate לפתרון מקבע (טבלה 1)ב 4 מעלות צלזיוס עד צוואר וזנב החמירו משמעותית (5 - 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיום זלוף לערוף את החיה. בזהירות לנתח את המוח מהגולגולת על ידי הסרה הראשונה רקמת החיבור המקיפה את הגולגולת ואז הסרת עצם מפני שטח הגחון של הגולגולת מרים את המוח (איור 1 א), כמתואר 20. הערה: תן טיפול מיוחד להסרת עצם שמסביב אונות flocculonodular של המוח הקטן ואת נורות חוש הריח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חוט השדרה של עמוד השדרה על ידי הכנסת הקצה בעדינות של מספריים בסדר, חדו בין חוט השדרה ואת עמוד השדרה וחיתוך מגזרי עמוד השדרה הבודד משם, כמתואר 21. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect המוח על ידי הצבתו במטריצה ​​במוח העכבר פלסטיק חיתוך לאורך קו האמצע עם להב מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כל חצי הכדור וחוט השדרה להפריד צנטריפוגה 50 מ&quot;ל גיגיתes עם ~ 40 מ&quot;ל של תמיסת הידרוג&#39;ל (טבלה 1). מכריכה קדימה בשלב זה את הצינורות עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על fluorophores במהלך כל הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינור המכיל את הדוגמא הידרוג&#39;ל ב 4 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד) למשך 7 ימים. </li></ol> 2. פילמור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ~ 25 מ&quot;ל של הידרוג&#39;ל, שמירה על מדגם ו ~ 25 מ&quot;ל של הידרוג&#39;ל בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deoxygenate המדגם על ידי הסרת מכסה והצבת צינור צנטריפוגות בצנצנת ייבוש וחיבור צנצנת ואקום. החלת את הוואקום במשך 10 דקות לפחות להתיר גזים מומסים לצאת בועות פתרון וצורה. נער בעדינות כדי לסלק את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הוואקום בצנצנת הייבוש בגז חנקן 100% לעומת 2 - 3 דקות. לאחר לחץ המשווה (פעם בראש צנצנת הייבוש ניתן לפתוח), במהירות מכסה את הצינור כדי למנוע החידוש של חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פּוֹלִימֵרize הידרוג על ידי הנחת צינור עם מדגם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עד פילמור הושלמה. הידרוג&#39;ל polymerized ייקח על (איור 1b) דמוי ג&#39;ל עקבי. הערה: כמות קטנה של הידרוג&#39;ל unpolymerized בראש מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית להסיר את מדגם polymerized מצינור צנטריפוגות, ואז לחתוך את הידרוג&#39;ל העודף מן המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הידרוג&#39;ל הנותרים על ידי הצבת המדגם על מוך חינם לנגב ומשפשף בעדינות לגלגל את הרקמה על זה, והותיר אחריו רק שכבה דקה של הידרוג&#39;ל polymerized על המדגם. </li></ol> 3. הסרת שומנים הערה: רקמת פינה ליפידים הוא שברירי, להישמר מהם. השתמש מסננת תא כאשר רוקנה את הצינור כדי למנוע אובדן של מדגם. כמו כן, המדגם יתנפח לאורך כל תהליך הסליקה, לעומת זאת, נפיחות יכולה להיות הפוך במהלך תהליך ההתאמה מקדם השביר. זהירות: Sodiאממ סולפט dodecyl (SDS) וחומצה בורה הם מגרים. בצע ניסויים ניצול אותם במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מדגם מפולמר צינור צנטריפוגות נקי 50 מ&quot;ל ולהוסיף 45 מ&quot;ל של סליקה חיץ (טבלה 1). לדגור על 45 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד). שינוי למאגר יומי 7 ימים ראשונים על ידי ניגר למאגר הסליקה בשימוש לתוך פסולת כימית והוספה ~ 45 מיליליטר של חיץ סליקה טרי. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים הראשוניים, דגירת המדגם ב 40 מעלות צלזיוס ו חיץ חליפי סליקה כל 2 - 3 ימים. המשך סליקה עד שכל השומנים הם solubilized ורקמות מגיעות השקיפות (איור 1 ג &#39;). זה יהיה 4 - 6 שבועות למשך חצי כדור במוח עכבר 2 - 4 שבועות עבור חוט שדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רקמות מנוקות, להעבירהמדגם לצינור צנטריפוגות חדשות 50 מ&quot;ל ולשטוף 4 פעמים ב PBST (טבלה 1) ב 40 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל&quot;ד) מעל 24 שעות כדי להסיר SDS שיורית. </li></ol> 4. מולקולרי מכתים זהירות: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindole dihydrochloride (DAPI) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה צריך להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל נקי ומלא עם 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI ב 1x PBST, pH 7.5. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב PBST ב RT במשך 6 שעות / לשטוף לפחות. </li></ol> 5. התאמת מקדם השבירה זהירות: 2,2&#39;-Thiodiethanol (TDE) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה shולד להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל נקי ומלא עם 30% (v / v) TDE ב PBS 1x, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ סל&quot;ד 30) למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת 30% TDE עם 63% (v / v) TDE ב 1x PBS, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין למשך 24 שעות. הערה: המדגם יתכווץ חזרה לגודל כ מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח שטוח ונקי לגלגל חתיכת דבק לשימוש חוזר לגליל בקוטר אחיד רק מעט גדול יותר בעובי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגליל הדבק לשימוש החוזר במעגל פתוח (~ 25 מ&quot;מ קוטר פנימי עם פתח קטן בחלק העליון) על צלחת תחתית זכוכית 40 מ&quot;מ. אם תיקונים צריכים להיעשות, להסיר את הגליל מהכוס לחתוך עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טיפ p1000 פיפטה ליצור חותם בין דבק לשימוש חוזר וזכוכית ידימגלגל אותו סביב השפה החיצונית של הגליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ~ 100 μl 63% TDE על צלחת הזכוכית להפיץ מסביב כדי לכסות את משטח הזכוכית בתוך המעגל של דבק לשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, מניח את המדגם בזהירות באמצע המעגל, נזהר שלא ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עוד 100 μl של TDE 63% ישירות על גבי המדגם, ומייד למקם כוס כיסוי עגולה 40 מ&quot;מ מעל הדבק לשימוש החוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות האינדקס, אמצע קמיצה של שתי הידיים, לחצו בזהירות מסביב למעגל עד הזכוכית המכסה יצר קשר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מביאים את התבשיל בתחתית הכוס בתנוחה זקופה נחה על פני השטח, ולאחר מכן להוסיף 63% TDE עם טפטפת עד שהתמיסה תגיע פתח קטן בראש. השתמש חינם מוך לנגב להתנגב קצה פיפטה כך שהפתרון לא לטפטף על זכוכית. כדי למנוע בועות בתא, לא לרוקן את פיפטה כל הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפתח הקטן, להוסיף אלסטומר סיליקון לצרף המעגל ליצור תא סגור. מתן 5 דקות עבור לו להתייבש לפני ההדמיה. </li></ol> מיקרוסקופי 6. זהירות: הלייזרים המשמשים confocal, תאורת מטוס בודדת במיקרוסקופ גיליון האור הם מאוד חזקה ויכולה לגרום לעיוורון. כל ניסויי ניצול לייזרים צריכים להתבצע לאחר אימונים רבים בזהירות רבה ומשקפי מגן מתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הדמיה עם המדגם בתוך על הבמה של מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלה של חומרים). כדי להפעיל את הלייזר עירור ארגון, לחץ על הכרטיסייה תצורת בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן בסמל לייזר. סמן את התיבה לצד ארגון כוח לייזר ולעבור סולם שקופית 30%. שים את המצביע להתחמם לאט למצב שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכרטיסייה לרכוש בחלק העליון. בתיבת הדו הגדולה &quot;הגדרות נתיב קרן &amp;# 34; ללכת העומס / לשמור הגדרת תיבה ובחר את תפריט הנפתח כדי לבחור ערוץ גל מתאים לתמונת YFP (527 ננומטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יעדים מתאימים הדמיה ידי איתור הקישור האדום שכותרתו &quot;מטרה: אובייקט נוכחי&quot; תחת תיבת גדרות ערוץ. לחיצה על הכרטיסייה פותחת את כל המטרות הזמינות ומבחר באופן אוטומטי לסובב את הצריח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מטרות (למשל., 10X) עם מרחק עבודה גדולה (יותר מעובי של הרקמות להיות צלמו, למשל, 11 מ&quot;מ) וכן מספרי צמצם גדול (למשל., 0.3) על מנת למקסם רזולוציית תמונת המטוס ולמזער עובי סעיף אופטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על העמוד השמאלי של תפריטים נפתחים, לפתוח את &quot;XY: רזולוציה&quot; החלון להגדיר מטריצת רכישה, בשם &quot;תבנית&quot;, 1,024 x 1,024 או ערך מתאים עבור מגבלת רזולוציה לרוחב של המטרה. הגדר את גורם זום נמוך ככל האפשר (למשל., 1.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו החלון, להגדיר ממוצע 8 קו 1 פרמטרים ממוצעים מסגרת ידי הטלה למטה בתפריטים שכותרתו בנפרד בהתאם. השתמש בערכים גדולים עבור יחס אות לרעש גבוה וערכים קטנים לרכישה מהירה. הערה: 8 ממוצעי קו ממוצע מסגרת 1 ירכשו תמונות באיכות גבוהה של אונה במוח עכבר בתוך כ -4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את המדגם באמצעות הפקדים הבמה. לאחר שדה נציג גלוי, להגדיר את הרווח לקזז. הערה: הרווח לקזז ישתנה מבוסס במידה מהותית על סוג הרקמה, fluorophores, ו / או להיות הדמית תכונה אנטומית. עבור YFP, להגדיר ערכים מ 760 ל 780 טוב רווח ומתוך -1.0 ל -1.5 עבור לקזז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;סריקת אריח&quot; ובחר את גבולות האזור של עניין. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של Z- מחסנית להירכש. הגדר את העובי של הסעיף האופטי המבוסס על מגבלת רזולוצית סעיף האופטית של המטרה. הערה: המטרה שלמגבלת רזולוצית סעיף אופטית מוגדרת בראש ובראשונה על ידי הצמצם המספרי שלה. רוב תוכנות מיקרוסקופ שליטה תחשבנה מתאים ערך באופן אוטומטי עבור המטרה בשימוש. עבור מטרת 10X עם צמצם מספרי של 0.3 זה יהיה כ 11 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הרכישה. הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות בהגדלה גבוהה יותר מאזורים ספציפיים של עניין. </li></ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+automated+histology+in+the+pursuit+of+connectomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.</a> J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).</li>
<li>MacKenzie-Graham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal%2C+multidimensional+atlas+of+the+C57BL%2F6J+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain.</a> J Anat. 204, 93-102 (2004).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci.+Vis%22%5BJournal%5D)">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> Neuroimage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Sci Rep. 5, 9808(2015).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Parra, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+brain+expressing+YFP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP.</a> J Vis Exp. (67), e3848(2012).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Viz+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> J Viz Exp. (96), e52580(2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

סליקה פסיבית של רקמות מוטבעות הידרוג&#39;ל (CLARITY הפסיבי) היא שיטה פשוטה וזולה לניקוי חתיכות גדולות של רקמה. גישה זו אינה דורשת ציוד ייעודי וניתן לבצעו בקלות שייקר בקרת טמפרטורה. במשך תקופה של כמה שבועות, אפילו גדולים, רקמות myelinated ביותר, כגון המוח כולו או בחוט השדרה, יהפוך שקוף ומתאים מיקרוסקופיה. למרות דוח זה התמקד סליקת רקמות CNS, ניתן ליישם CLARITY הפסיבית לכל רקמה. את נקודות החוזק והחולשה היחסיות של טכ...

היכולת לדמות מבנים נוירו-אנטומיים שלמים היא בעלת ערך עצום להבנת המוח בבריאות ובחולי. באופן מסורתי, הדמיה תלת מימדית דרשה חתך רקמות כדי לספק את הרזולוציה הצירית וכדי לדמיין מבנים אנטומיים עמוקים. גישה זו יכולה לייצר מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה, אך דורשת טכניקות שחזור תמונה מתוחכמות והיא עתירת עבודה. כתוצאה מכך, הוא הוגבל להדמיה של נפחים קטנים של רקמה1-3. חתך אופטי, לעומת זאת, מתאים היטב ליצירת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של רקמות המסומנות בפלואורסצנט. מכיוון שחתך אופטי הוא תלת מימדי מטבעו, הוא אינו דורש חישוב נרחב כדי לייצר נפח תמונה תלת מימדי. עם זאת, פיזור אור ואטימות רקמות מגבילים את העומק שבו ניתן לחתוך רקמות אופטית. עומק ההדמיה מוגבל לכ-150 מיקרומטר במיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר ולפחות מ-800 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ עירור דו-פוטוני4-8.
על מנת להתגבר על מגבלות אלה, פותחו לאחרונה מספר טכניקות ניקוי אופטי ולאחר מכן שוכללו עוד יותר כדי לאפשר הדמיה מיקרוסקופית עמוקה של רקמות שלמות. השימוש בבנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB) כדי להפוך רקמות קבועות לשקופות היה בין הגישות המוקדמות ביותר9. עם זאת, גישה זו הוגבלה על ידי כיבוי הקרינה בדגימות ופינוי לא שלם של מבנים בעלי מיאלין גבוה10. שיפורים של טכניקה זו, כגון הדמיה תלת מימדית של איברים מנוקים ממסים (3DISCO), הובילו לניקוי רקמות מהיר ומלא מאוד, אך עדיין סובלים מאובדן מהיר של אותות פלואורסצנטיים, במיוחד חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)10. תמיסות ניקוי על בסיס מים, כגון Sca/e11 ו-SeeDB12, משמרות אותות פלואורסצנטיים, אך אינן מנקות לחלוטין רקמות מיאליניות מאוד. קוקטיילים של הדמיית מוח נקייה ללא הפרעה וניתוח חישובי (CUBIC) היא טכנולוגיית קלירינג אופטית חדשה ומבטיחה שנראה כי היא מתגברת על המגבלות של פתרונות ניקוי על בסיס מים שפותחו בעבר13. בניגוד לטכניקות ניקוי אופטיות אחרות, רקמה תואמת הדמיה קשיחה (CLARITY)14 מטמיעה את המוח במטריצה נקבובית המספקת שלמות מבנית לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות, תוך השארת שומנים לא קשורים. לאחר מכן מסירים את השומנים באופן אלקטרופורטי, ומגיעים לשיאם במוח מנוקה אופטית שניתן לדמיין בקלות ובאותה קלות לחקור אותו באותה מידה באמצעות טכניקות נפוצות הזמינות.
ניקוי רקמות אלקטרופורטי (ETC) משמש להסרת שומנים מרקמות משובצות הידרוג'ל ב-CLARITY, עם זאת, ETC יכול להיות קשה ליישום באופן עקבי ורקמות הכפופות לאלקטרופורזה יכולות להפגין עיוות רקמות, השחמה, אובדן פלואורסצנטיות ותגובתיות נוגדנים. ניקוי שומנים פסיבי נמנע ממגבלות אלה, אך דורש זמני ניקוי מוגברים15-17. קלירינג פסיבי מאפשר גם ניקוי של מספר רב של דגימות במקביל, מכיוון שהוא אינו מוגבל על ידי מספר מכשירי ה-ETC הזמינים. הפחתת ריכוז הפרפורמלדהיד והוצאת ביס-אקרילאמיד מההידרוג'ל הובילו לעלייה גדולה במהירות הפינוי על חשבון התרחבות גדולה יותר של רקמות16. חלופות זולות יותר לפתרון התאמת מקדם השבירה ששימש בטכניקת CLARITY המקורית פותחו17-19. 2,2'-תיודיתנול (TDE) הוא חומר ניקוי מוח זול ומהיר ההופך חלק מהתרחבות הרקמה המתרחשת במהלך הסרת שומנים18. דוח זה משלב ניקוי פסיבי של רקמה משובצת הידרוג'ל ושימוש ב-TDE כפתרון תואם מקדם שבירה לטכניקת CLARITY המקורית כדי לייצר פרוטוקול זול וניתן לשחזור לניקוי אופטי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר.

<table><tbody><tr><td>10x פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>פישר</td><td>BP399-1</td><td>חוצץ</td></tr><tr><td>32% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>15714-5</td><td>זלוף והידרוג'ל</td></tr><tr><td>2,2'-תיודיתנול (TDE)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>166782-500G</td><td>תמיסת התאמת מקדם שבירה</td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד</td><td>ביו-ראד</td><td>161-0140</td><td>הידרוג'ל</td></tr><tr><td>2% ביס-אקרילאמיד</td><td>ביו-ראד</td><td>161-0142</td><td>יוזם הידרוג'ל</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>הידרוג'ל</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B7901</td><td>מאגר פינוי</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td> <td>פישר</td><td>BP166-5</td><td>מאגר פינוי</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר</td><td>55255-1</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>52002-100G</td><td>חומר משמר</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100-500 גרם</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3393-50KU</td><td>זילוף</td></tr><tr><td>נתרן חנקתי</td><td>פישר</td><td>BP360-500</td><td>זלוף</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1306</td><td>כתם גרעיני</td></tr><tr><td>99.9% איזופלורן</td><td>פיניקס</td><td>57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוקולורית</td> הרדמה <td>פישר</td><td>A1445-500</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>כלי Willco</td></tr><tr><td>דבק רב פעמי</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>מגבון ללא מוך</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Mouse מטריצת מוח</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>רקמת</td></tr> <tr><td>חתךלהבי מטריקס</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>רקמת חיתוך</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מיקרוסקופיה</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>מיקרוסקופיה</td> AF</tr></tbody></table>

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש clarity הפסיבי

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

באופן מסורתי, הדמיית רקמות דרשה חתך והדמיה סדרתית של הרקמה המעניינת, מה שחושף כל קטע רקמה לעיוותים לא ליניאריים ייחודיים, מה שפוגע באופן דרמטי ביכולתו של האדם להעריך מורפולוגיה תאית, פיזור וקישוריות במערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, טכניקות ניקוי אופטי משנות את האופן שבו רקמות נראות. גישות אלה מאפשרות לחקור לעומק את תכשירי האיברים השלמים, ומספקות תובנה עצומה לגבי הארגון המבני של רקמות בבריאות ובחולי. טכניקות כגון החלפת ליפידים שקופים אקרילאמיד היברידית רקמה תואמת הדמיה קשיחה (CLARITY) משיגות מטרה זו על ידי מתן מטריצה הקושרת ביומולקולות חשובות תוך מתן אפשרות לליפידים המפזרים אור להתפזר בחופשיות. הסרת שומנים, ואחריה התאמת מקדם שבירה, הופכת את הרקמה לשקופה וניתנת להדמיה בקלות ב-3 מימדים (תלת מימד). עם זאת, ניקוי הרקמות האלקטרופורטיות (ETC) ששימש בפרוטוקול CLARITY המקורי יכול להיות מאתגר ליישום בהצלחה והשימוש בפתרון קנייני להתאמת אינדקס שבירה מייקר את השימוש בטכניקה באופן שגרתי. דוח זה מדגים את היישום של פרוטוקול ניקוי אופטי פשוט וזול המשלב CLARITY פסיבי לשיפור שלמות הרקמות ו-2,2′-thiodiethanol (TDE), פתרון התאמת מקדם שבירה שתואר בעבר.

לדמיין את המבנה הארגוני של המוח הוא קריטי להבנת איך מורפולוגיה וקישוריות להשפיע על תפקוד המוח בריאות ומחלות. טכניקות סליקה אופטיות מאפשרות אוכלוסיות תאי תמונת 3D ברקמות ללא פגע, מה שמאפשר לנו ללמוד מורפולוגיה וקישוריות cohesively. עכברים המבטאים חלבוני ניאון מונע על ידי יזמים ספציפיים עבור תת-אוכלוסיות של תאים להתיר אחת ניסו להפריד דפוס המורכב של ק...

טכניקות ניקוי אופטי מחוללות מהפכה באופן שבו רקמות נראות. בדוח זה אנו מתארים שינויים בפרוטוקול המקורי של Clear Lipid-Hybridized Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) שמניב תוצאות עקביות יותר ופחות יקרות.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שינויים לפרוטוקול ה-CLARITY המקורי, המניבים תוצאות עקביות וכלכליות יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי העצבים, כגון מורפולוגיה תלת-ממדית וקישוריות במערכת העצבים המרכזית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משפרת את העקביות של הפינוי האופטי (optical clearing) והמיקרוסקופיה במערכת העצבים המרכזית של העכבר.באופן חסכוני וניתן לשחזור. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שבניית תא הדימות היא מורכבת ואינה מובנת בקלות מתוך תיאור כתוב.השג רקמות של מוח וחוט שדרה מקובעים בפראפורמלידה מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. בצע חצייה של המוח על ידי הצבתו במטריקס פלסטי למוח עכבר וחיתוך לאורך קו האמצע בעזרת להב המטריקס. העבר כל המיספירה וכן את חוט השדרה לתוך מבחנות צנטריפוגה נפרדות בנפח 50 milliliter.כל אחד מכיל 40 milliliters של תמיסת הידרוג'ל. כסו את המבחנות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופורים. והדגירו את המבחנות המכילות את הדגימות וההידרוג'ל בטמפרטורה של ארבעה מעלות celsius עם ניעור עדין למשך שבעה ימים.לאחר תקופת האינקובציה, השליכו 25 מיליליטר של הידרוג'ל, כך שיישארו הדגימה וכ-25 מיליליטר של הידרוג'ל בתוך מבחנת הצנטריפוגה. לאחר מכן, בצעו דה-אוكسגנציה לדגימה על ידי הסרת המכסה, הנחת מבחנת הצנטריפוגה בתוך מכל דסיקטור וחיבור המכל

optical-clearing-mouse-central-nervous-system-using-passive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

לחץ תוך עיני מוגבר כרוני הנגרם באמצעות טיפול לייזר של meshwork trabecular בעיני עכבר. לחץ התוך עיני (IOP) הוא גבוה למשך מספר חודשים לאחר טיפול לייזר. הירידה של חדות ראייה ורגישות לקונטרסט של חיות ניסוי מנוטרת באמצעות בדיקת optomotor.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

במאמר זה אנו מתארים את ההליך ניסיוני המלא לשחזר, עם רזולוציה גבוהה, האנטומיה מוח הקנס של מוח עכבר שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול המתואר כולל הכנת מדגם וסליקה, דגימת הרכבה עבור הדמיה, שלאחר עיבוד נתונים והדמיה רב היקף.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

הקרנות על-עמוד השדרה חשובות לתפיסת כאב והתנהגויות אחרות, וסיבים סרוטונרגיים הם אחת ממערכות הסיבים הללו. המחקר הנוכחי התמקד ביישום הפרוטוקול המשולב CLARITY/CUBIC על חוט השדרה של העכבר על מנת לחקור את סיום הסיבים הסרוטונרגיים הללו.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ויוו ההדמיה של הרשתית עכבר עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (SD-אוקטובר). הוא מתמקד תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) באזור peripapillary, עם מספר סריקה וכימות הגישות שתוארו.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לגרום לדלקת שיתוק ובעיות opticospinal על ידי העברה של aquaporin-4 (AQP4)-תאי T ספציפי של עכברים- / - AQP4 לתוך WT עכברים. בנוסף, נדגים כיצד להשתמש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית טורי כדי לפקח על תפקוד מערכת הראייה.

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

טכניקות ניקוי אופטי, כגון תמיסות ספיגת מולקולות, מפחיתות את פיזור האור באופן זמני כדי לשפר את ההדמיה הביולוגית ומציעות אסטרטגיות הדמיה in vivo תואמות ביולוגית והפיכות לאיברים משובצים עמוק. פרוטוקול זה מציג נהלי ניסוי מפורטים כמו גם עיבוד תמונה מתקדם להשגת הדמיה דינמית באיכות גבוהה לדינמיקה בזמן אמת בבעלי חיים חיים.

סליקה אופטית חולפת באמצעות מולקולות סופגות להדמיית ex vivo ו-in vivo

למדו שיטת CLARITY פסיבית לניקוי אופטי של מערכת העצבים המרכזית בעכבר. הפרוטוקול המשופר מספק תוצאות עקביות וחסכוניות לחקר מורפולוגיה תלת-ממדית וקישוריות עצבית.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

גלה סרטונים נוספים