סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שינויים לפרוטוקול ה-CLARITY המקורי, המניבים תוצאות עקביות וכלכליות יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי העצבים, כגון מורפולוגיה תלת-ממדית וקישוריות במערכת העצבים המרכזית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משפרת את העקביות של הפינוי האופטי (optical clearing) והמיקרוסקופיה במערכת העצבים המרכזית של העכבר.

באופן חסכוני וניתן לשחזור. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שבניית תא הדימות היא מורכבת ואינה מובנת בקלות מתוך תיאור כתוב.

השג רקמות של מוח וחוט שדרה מקובעים בפראפורמלידה מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. בצע חצייה של המוח על ידי הצבתו במטריקס פלסטי למוח עכבר וחיתוך לאורך קו האמצע בעזרת להב המטריקס. העבר כל המיספירה וכן את חוט השדרה לתוך מבחנות צנטריפוגה נפרדות בנפח 50 milliliter.

כל אחד מכיל 40 milliliters של תמיסת הידרוג'ל. כסו את המבחנות בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופורים. והדגירו את המבחנות המכילות את הדגימות וההידרוג'ל בטמפרטורה של ארבעה מעלות celsius עם ניעור עדין למשך שבעה ימים.

לאחר תקופת האינקובציה, השליכו 25 מיליליטר של הידרוג'ל, כך שיישארו הדגימה וכ-25 מיליליטר של הידרוג'ל בתוך מבחנת הצנטריפוגה. לאחר מכן, בצעו דה-אוكسגנציה לדגימה על ידי הסרת המכסה, הנחת מבחנת הצנטריפוגה בתוך מכל דסיקטור וחיבור המכל לוואקום. הפעילו את הוואקום למשך 10 דקות לפחות.

נערו בעדינות כדי לשחרר את בועות החמסן שנפלט. לאחר 10 דקות, החליפו את הוואקום במכל הדסיקטור ב-100% nitrogen gas במשך שתי עד שלוש דקות. ברגע שהלחץ ישתווה וניתן יהיה לפתוח את חלקו העליון של מכל הדסיקטור, סגרו במהירות את הפיה של המבחנה כדי למנוע חדירה מחדש של חמסן.

לאחר מכן, פולימריזו את ההידרוג'ל על ידי הנחת המבחנה עם הדגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות עד להשלמת הפולימריזציה. לאחר שלוש שעות, ההידרוג'ל המפולימריז יקבל מרקם ג'לטיני. השתמשו בשפכטול כדי להוציא את הדגימה המפולימריזית ממבחנת הצנטריפוגה, ולאחר מכן הסִירו בחיתוך את עודפי ההידרוג'ל מהדגימה.

לבסוף, הסירו את ההידרוג'ל שנותר על ידי הנחת הדגימה על ניגב נקי מסיבים, תוך שפשוף וגלגול עדין של הרקמה עליו, כך שתישאר על הדגימה רק שכבה דקה של הידרוג'ל פולימרי. כדי להתחיל בתהליך הסרת הליפידים, העבירו את הדגימה הפולימרית למבחנת צנטריפוגה נקייה בנפח 50 milliliter המכילה 45 milliliters של תמיסת בידור (clearing buffer), והדגירו בטמפרטורה של 45 degrees celsius עם ניעור עדין למשך שבעה ימים. החליפו את התמימה מדי יום במהלך תקופה ראשונית זו של שבעה ימים על ידי שפיכת תמיסת הבידור המשומשת למכל פסולת כימית.

הוסף 45 milliliters של תמיסת הבהרה (clearing buffer) טרייה. ברגע שכל השומנים הומסו והרקמה הגיעה לשקיפות, העבר את הדגימה לשפופרת צנטריפוגה חדשה של 50 milliliters המלאה ב-45 milliliters של PBST, ושטוף ארבע פעמים בטמפרטורה של 40 degrees celsius תוך써 ניעור עדין במהלך 24 השעות הבאות, כדי להסיר שאריות SDS. לאחר שטיפת ה-PBST האחרונה, העבר את הדגימה לשפופרת צנטריפוגה נקייה של 15 milliliters המלאה ב-1 microgram per milliliter של DAPI וב-1xPBST.

עטפו בנייר אלומיניום והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. למחרת, שטפו שלוש פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר למשך לפחות שש שעות לכל שטיפה. לאחר מכן, המשיכו להתאמת מדד השבירה.

כדי להתחיל חלק זה של הפרוצדורה, העבירו את הדגימה לשפופרת צנטריפוגה נקייה בנפח 15 מיליליטר הממולאת ב-2-2 thiodiethanol ו-1xPBS ב-pH 7.5 והדגירו כפי שמוצג על המסך. לקראת סוף הדגירה השנייה, צרו תא הדמיה על ידי גלגול פיסת דבק רב-פעמי לצורה של גליל בעל קוטר אחיד הגדול מעט מעובי הדגימה. הניחו את הגליל במעגל פתוח בצלחת עם תחתית זכוכית בקוטר 40 מילימטר.

לאחר מכן, השתמשו בקצה פ pipette P1000 כדי ליצור אטם בין הדבק הרב-פעמי לזכוכית על ידי גלגולו מסביב לשוליים החיצוניים של הגליל. טפטפו כ-100 µL של 63% TDE אל תוך צלחת הזכוכית והפריסו אותם כדי לכסות את פני הזכוכית בתוך מעגל הדבק הרב-פעמי. לאחר מכן, השתמשו בשפכטול כדי להניח בזהירות את הדגימה במרכז המעגל, תוך הקפדה שלא ייווצרו בועות.

בשלב הבא, העבירו בפיפטה 100 µL נוספים של 63%TDE ישירות על הדגימה, והניחו מיד זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 40 mm מעל הדבק הרב-פעמי. השתמשו באצבעות השี้בב, האמה והקמיצה של שתי הידיים כדי ללחוץ בזהירות מסביב להיקף העגול עד שזכוכית הכיסוי תיגע בדגימה. כעת, העמידו לאט את הכלי בעל תחתית הזכוכית במצב אנכי נשען על משטח, והוסיפו 63%TDE באמצעות פיפטה עד שהתמיס יגיע לפתח הקטן בחלק העליון.

השתמשו במטלית ללא סיבים כדי לייבש את קצה הפ pipette כך שהתמיסה לא תטפטף על הזכוכית. לבסוף, הוסיפו silicon elastomer לפתח הקטן כדי לסגור את המעגל וליצור תא סגור. המתינו חמש דקות לייבוש, ולאחר מכן עברו לדימוג.

הניחו את תא הדמיה עם הדגימה בתוכו על השולחן של מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר. פתחו את תוכנת ההדמיה; כדי להפעיל את לייזר העירור של הארגון, לחצו על לשונית התצורה (configuration) בחלק העליון של התוכנה, ולאחר מכן על סמל הלייזר. סמנו את התיבה לצד הארגון כדי להפעיל את הלייזר והזיזו את סרגל הגדרת השקף ל-30%. חזרו ללשונית הרכישה (acquire) בחלק העליון.

בתיבת הגדרות נתיב הקרן, עברו לתיבת הגדרות טעינה-שמירה, ובחרו מהתפריט הנפתח את ערוץ אורך הגל המתאים להפסקת YFP. בתיבת הגדרות הערוץ, בחרו את העדשות המתאימות לדימות על ידי לחיצה על ההיפר-קישור האדום המסומן objective current object. השתמשו בעדשות בעלות מרחק עבודה הגדול מעובי הרקמה.

ומספר מפתח גדול כדי למקסם את רזולוציית התמונה במישור, ולמזער את עובי החתך האופטי. בעמודת התפריטים הנפתחים השמאלית, פתחו את חלון רזולוציית ה-XY כדי להגדיר את מטריצת הרכישה, הנקראת format, ל-1024x1024 או לערך המתאים למגבלת הרזולוציה הלטראלית של העדשה. הגדירו את מקדם הזום לנמוך ככל האפשר.

נעשה שימוש ב-1.7. באותו חלון, הגדירו את הפרמטרים של ממוצע שמונה שורות וממוצע פריים אחד על ידי בחירה בתפריטים המסומנים בהתאם. אתרו את הדגימה באמצעות בקרות הבמה.

ברגע ששדה מייצג נראה בבדיקה, הגדירו את ההגבר (gain) לערך שבין 760 ל-780, ואת ההיסט (offset) לערך שבין 1.0 ל-1.5 עבור YFP. בחרו בסריקת אריחים (tile scan). לאחר מכן, הגדירו את הגבול העליון והתחתון של ה-Z stack שיש לרכוש.

הגדירו את עובי החתך האופטי בהתבסס על גבול רזולוציית החתך האופטי של העדשה, ולאחר מכן התחילו ברכישת הנתונים. תמונה זו מציגה נוירונים חיוביים ל-YFP בקליפת המוח ובהיפוקמפוס שצולמו בהגדלה של 5x ושוחזרו בתלת-ממד. סרגל הקנה מייצג מילימטר אחד.

הקרנה של עוצמה מקסימלית (Maximum intensity projection) של ערימת תמונות (image stack) בפי 10 של קליפת המוח המוחית מדגימה את הסבך הדנדריטי של נוירונים פירמידליים בשכבה חמישה של קליפת המוח. כאן סרגל קנה המידה מייצג 100 microns. כאן מוצג ביטוי של THY-1YFP בחוט שדרה צווארי וחזי intact, שצולם בהגדלה של 5x ושוחזר בתלת-ממד.

סרגל המقياس מייצג שני מילימטרים. לבסוף, השליכה של עוצמה מקסימלית (maximum intensity projection) של סדרת תמונות בפי 10 של חוט השדרה, מדגימה אקסונים בודדים, סרגלי המقياس מייצגים 100 מיקרון. אם הטכניקה בוצעה כראוי, ניתן לבצע אותה בתוך שבועיים עד ארבעה שבועות עבור חוטים שדרים שלמים, ובין ארבעה לשישה שבועות עבור מוחות שחצויים לאורחם (hemisected brains).

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה כדי להשיב על שאלות הדורשות פנוטיפיקה ביוכימית מורכבת יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע שקיפות אופטית ודימוי של מערכת העצבים המרכזית של עכבר, באמצעות Passive Clarity ומיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר.