פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר את הפיתוח של מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של רירית המעי האנושית, המגודלת תחת תנאי מיקרו-כבידה המסופקים על ידי ביו-ריאקטורים של כלי דופן מסתובב (rotating wall vessel bioreactors). לשיטה זו פוטנציאל רב ככלי לגילויים הן במצב בריאותי והן במצב מחלה, כולל אינטראקציות עם פתוגנים, תעבורת אנטיגנים ותהליכים דלקתיים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם חיקוי הגיוון הפנוטי של החתול והשימוש בביוראקטורים מסוג D-12 שמאפשרים דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים וחמצן. התחילו בהסרת המכסה מפתח המילוי של כלי התרבית והוסיפו 50 milliliters של PMI שלנו. לאחר שהכלי מלא, החזירו את המכסה ונגבו כל שארית מצע שנשפכה באמצעות 70% ethanol.

השאירו את הכלי להדגרה למשך 15 דקות לפחות ועד ללילה שלם בטמפרטורת החדר. כאשר תהיו מוכנים להמשיך, השתמשו בפתח המילוי כדי לשפוך את מצע התרבית והוסיפו לכלי 30 milliliters של מצע תרבית בתלת-ממד. החזירו את הפקק לפתח המילוי ושוב, נגבו כל מצע שנשפך בעזרת 70% ethanol.

הוצא מהאינקובטור בקבוקים קרובים למצב של התמזגות (confluence) המכילים תאי אנדותל של וריד טביליות אנושי ותאי פיברובלסטים של מעי גס אנושי, ושטוף אותם פעמיים ב-PBS. לאחר מכן,נתק את התאים על ידי כיסוי שלהם בתמיסת trypsin 0.25% עם trypsin EDTA 0.05%. ברגע שהתאים ניתקו, אסוף אותם לשפופרת של 50 milliliter המכילה מראש 30 milliliters של DMEM עם 30%FBS.

סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך 10 דקות כדי לשקע את התאים. לאחר מכן, השהה שוב את התאים ב-30 milliliters של DMEM המכיל 30%FBS. לאחר מכן, דלל 20 microliters של התאים שהושהו עם 20 micro-liters של צבע trypan blue.

טענו את ההמוציטומטר עם תערובת התאים וספרו את ריכוז התאים החיים. לאחר מכן, השעיו מחדש כל סוג תא בריכוז של 50 עד 80 מיליון תאים למיליליטר ב-DMEM המכיל 30%FBS. ראשית, מקמו את מספר המכניסים (inserts) המתאים לתרבית בתוך בארות של פלטת שש בארות.

בשלב הבא, הכינו את תערובת הקולגן על ידי הוספה ראשונית של 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, L-glutamine בריכוז 200 millimolar ו-FBS שעבר דה-אקטיבציה תרמית לפרועת קונית של 50 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו bovine collagen type one, laminin, collagen type four, fibronectin, heparin sulfate proteoglycan ולבסוף הוסיפו sodium hydroxide כדי לנטרל את ה-pH של התמיסה. אם בכל שלב התערובת מקבלת מראה חומצי בגוון צהוב, הוסיפו מספר טיפות של 1 normal sodium hydroxide סטרילי כדי לנטרל את התערובת.

סגרו את המבחנה וערבבו את התמיסה על ידי הפיכה מספר פעמים, תוך הימנעות מיצירת בועות. כאשר אינכם מערבבים, שמרו את התמיסה על קרח כדי למנוע פולימריזציה. לאחר הערבוב, הוסיפו את תרחילי התאים להכנת הקולגן וערבבו את המבחנות על ידי הפיכה עדינה מספר פעמים כדי למנוע היווצרות בועות.

לאחר מכן, החזירו אותם לקירור על קרח. הוסיפו ארבעה עד חמישה מיליליטרים של תמיסת הקולגן המכילה את התאים לכל כיס (insert) ואפשרו לקולגן להתגבש במC-hood ללא תנועה או בתנועה מועטה למשך שעה אחת. לאחר שעה, העבירו את הפלטה בעלת ששת הבארים (six well plate) לאינקובטור למשך שעה עד שעתיים נוספות.

בשלב הבא, החזיר את הפלטה למCב המזרע (tissue culture hood) והשתמש בפינצטה סטרילית ובסכין מנתחים כדי לחתוך באופן אספטי את הממברנה מהאינסרט. הפר את הג'ל המכיל תאים מהממברנה ולאחר מכן חתוך את הג'ל שהופר לריבועים קטנים. הוסף את ריבועי הקולגן הקטנים המכילים תאים לאחד מהכלים בנפח 50 milliliter הממולאים מראש, באמצעות פתח המילוי.

בשלב הבא הכין תרחיף של תאי אפיתל אנושיים מסוג HCT-8 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. השהה מחדש את התאים בריכוז של 10 מיליון תאים למילליטר ב-DMEM המכיל 30%FBS. לאחר מכן, הוסף מילליטר אחד של תרחיף תאי HCT-8 אל כלי ה-50 מיליליטר באמצעות פתח המילוי שלו.

לאחר הוספת התאים, הוסיפו 20 מיליליטרים נוספים של מצע גידול תלת-ממדי לכלי כך שיהיה מלא כמעט לחלוטין. החזירו את הפקק והרטיבו את שפת פתח המילוי ב-70% ethanol. לאחר מכן, הכניסו מזרק של חמישה מיליליטרים המכיל שלושה עד ארבעה מיליליטרים של מצע גידול תלת-ממדי לאחד הפתחים של הכלי, ומזרק ריק של חמישה מיליליטרים לפתח השני.

הסר בועות גז נראות על ידי משיכה למזרק הריק, בעוד שנכנס נפח דומה של מדיום דרך המזרק השני אל תוך הכלי. לאחר שכל האוויר הוסר, הנח את הכליים בביוריאקטור, הפעל את המכשיר וקבע את המהירות ל-13 עד 14 rotations per minute. התאם את המהירות לפי הצורך כדי למנוע מהתאים לבוא במגע עם דפנות הכלי.

גדלו את התאים בתנאי מיקרו-כבידה והחליפו את מצע התרבית כל שלושה עד ארבעה ימים. כדי להחליף את המצע, השתמשו בשיטת המזרקים הכפולה כדי להחליף כ-30 milliliters של המצע המשומש במצע תרבית תלת-ממדי טרי. לאחר שלושה עד חמישה ימי תרבית, בודדו תאים חד גרעיניים מדם פריפריאלי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.

לאחר מכן, הוצא את הכלי מהביוריאקטור והוסף לכלי דרך פתח המילוי כ-20 מיליון תאים המורכבים מלימפוציטים ומונוציטים. החזר את הכלים לביוריאקטור וטפח אותם למשך ארבעה עד שישה ימים נוספים. בסביבות היום התשיעי של התרבית, הוסף לכלי 20 מיליון תאים נוספים המורכבים מלימפוציטים ומונוציטים, והמשך את גידול התרביות למשך עד 12 ימים נוספים.

בסיום הניסוי, השתמשו בפיפטת העברה כדי לאסוף כל רבדי ג'ל קטנים, הנקראים כעת "מבנה" (construct), והניחו אותם לתוך בארות של פלטת שש בארות המכילה 10 milliliters של בופר פורמלין 10%formalin. קבעו את המבנים למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשיכו בפרוטוקולים סטנדרטיים של הטמעה היסטולוגית, חיתוך וצביעה. השיטות המוצגות בסרטון זה יוצרות מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של הרירית המעי האנושית.

בתרבית במיקרו-גרביטציה, התאים הופכים למובחנים היטב ומפתחים מאפיינים מסודרים דמויי סיסות (villi) עד היום ה-20. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשישה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לדבקה להנחיות תרבית תאים תקינות.

חשוב לבקר באופן שיטתי את התאיים מבחינת חיוניות, זיהום במיקופלסמה ושינויים בהתנהגות צמיחת התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה, כדי לזהות סמנים של שושלת ודיפרנציאציה של תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעמדה להבין היטב כיצד לפתח מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של רירית המעי האנושי המגודל בתנאי מיקרו-כבידה.