פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר את הפיתוח של מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של רירית המעי האנושית שגודלה תחת מיקרו-כבידה המסופקת על ידי ביו-ריאקטורים מסתובבים של כלי דם מסתובבים. לשיטה זו יש פוטנציאל רחב ככלי לגילוי הן בבריאות והן בחולי. כולל אינטראקציות עם פתוגנים, סחר באנטיגן ותהליכים דלקתיים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם חיקוי המגוון הפנוטיפי של החתול ושימוש בביו-ריאקטורים של כלי D-12 המאפשרים דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים וחמצן. התחל בשחרור המכסה מיציאת המילוי של כלי התרבות והוספת 50 מיליליטר של PMI שלנו. לאחר שהכלי מלא, החזר את המכסה ונגב כל מדיום שנשפך באתנול 70%.

הניחו לכלי לדגור לפחות 15 דקות עד לילה בטמפרטורת החדר. כאשר אתה מוכן להמשיך, השתמש ביציאת המילוי כדי להשליך את מדיום התרבות ולהוסיף 30 מיליליטר ממדיום התרבות התלת מימדי לכלי. החזר את המכסה ליציאת המילוי ושוב, נגב כל מדיום שנשפך עם 70% אתנול.

הסר מהאינקובטור צלוחיות ליד קונפלואנט המכילות תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי ופיברובלסטים אנושיים של המעי הגס ושטוף אותם פעמיים עם PBS. לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי כיסויים באמצעות תמיסת טריפסין של 0.25% עם 0.05% טריפסין EDTA. לאחר שהתאים מתנתקים, אספו אותם בצינור של 50 מיליליטר טעון מראש ב-30 מיליליטר של DMEM המכיל 30% FBS.

צנטריפוגה את הצינור למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-30 מיליליטר של DMEM המכילים 30% FBS. לאחר מכן, יש לדלל 20 מיקרוליטר מהתאים התלויים מחדש עם 20 מיקרו-ליטר צבע כחול טריפאן.

טען את ההמוציטומטר בתערובת התאים וספור את ריכוז התאים הקיימאים. לאחר מכן, השעו מחדש כל סוג תא ב-50 עד 80 מיליון תאים למיליליטר ב-DMEM המכיל 30% FBS. ראשית, הניחו את המספר המתאים של תוספות תרבות לבארות של צלחת שש בארות.

לאחר מכן, הכינו את תערובת הקולגן על ידי הוספת 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 מילי-מולרי L-גלוטמין ו-FBS מושבת בחום לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו קולגן בקר מסוג 1, למינין, קולגן סוג 4, פיברונקטין, הפרין סולפט פרוטאוגליקן ולבסוף הוסיפו נתרן הידרוקסיד כדי לנטרל את ה-pH של התמיסה. אם בכל עת התערובת מפתחת מראה חומצי בצבע צהבהב, הוסף כמה טיפות של נתרן הידרוקסיד רגיל סטרילי 1 כדי לנטרל את התערובת.

סגור את הצינור וערבב את התמיסה על ידי היפוכה מספר פעמים תוך הימנעות מהיווצרות בועות. כשלא מערבבים, שמרו את התמיסה על קרח כדי למנוע ממנה להתפלמר. לאחר הערבוב, הוסיפו את תרחיפי התאים לתכשיר הקולגן וערבבו את הצינורות על ידי היפוך עדין של הצינורות מספר פעמים כדי למנוע היווצרות בועות.

לאחר מכן הניחו אותם בחזרה על הקרח. הוסיפו ארבעה עד חמישה מיליליטר של תמיסת קולגן לכל תוספת, והניחו לקולגן להתג'ל במכסה המנוע עם מעט תנועה או ללא תנועה למשך שעה. לאחר שעה, העבירו את צלחת שש הבארות לחממה למשך שעה עד שעתיים נוספות.

לאחר מכן, החזירו את הצלחת למכסה המנוע של תרבית הרקמות והשתמשו בזוג מלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לחתוך באופן אספטי את הממברנה מהתוספת. נתק את התא המכיל ג'ל מהממברנה ולאחר מכן חתוך את הג'ל המנותק לריבועים קטנים. הוסף את התא הקטן המכיל ריבועי קולגן לאחד מכלי ה-50 מיליליטר הממולאים מראש באמצעות פתח המילוי.

לאחר מכן הכינו השעיה של תאי אפיתל אנושיים HCT-8 כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. השעו מחדש את התאים בריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר ב-DMEM המכיל 30% FBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תרחיף התאים HCT-8 לכלי ה-50 מיליליטר באמצעות יציאת המילוי שלו.

לאחר הוספת התאים, הוסף 20 מיליליטר נוספים של מדיום תרבית תלת מימד לכלי כך שיהיה כמעט מלא. החזר את המכסה והרטיב את שפת יציאת המילוי באתנול 70%. לאחר מכן, הנח מזרק של חמישה מיליליטר המכיל שלושה עד ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית תלת מימד ליציאה אחת של הכלי ומזרק ריק של חמישה מיליליטר ביציאה השנייה.

הסר את כל הבועות הגלויות על ידי משיכה לתוך המזרק הריק בזמן שבערך אותו נפח של מדיום מוזרק דרך המזרק השני לתוך הכלי. כאשר כל האוויר הוסר כעת, הנח את הכלים בביו-ריאקטור, הפעל את החשמל והגדר את המהירות על 13 עד 14 סיבובים לדקה. התאם את המהירות לפי הצורך כדי למנוע מהתאים ליצור קשר עם דפנות כלי הדם.

תרבית התאים תחת מיקרו-כבידה והחלפת מדיום התרבית כל שלושה עד ארבעה ימים. כדי לשנות את המדיה, השתמש בשיטת המזרק הכפול כדי להחליף כ-30 מיליליטר מהמדיום המשומש במדיום תרבית תלת מימד טרי. לאחר שלושה עד חמישה ימים בתרבית, בודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן הסר את הכלי מהביו-ריאקטור והוסף כ -20 מיליון תאים המורכבים מלימפוציטים ומונוציטים לכלי דרך יציאת המילוי. החזירו את הכלים לביו-ריאקטור ולתרבית למשך ארבעה עד שישה ימים נוספים. בסביבות היום התשיעי של התרבית, הוסיפו 20 מיליון תאים נוספים המורכבים מלימפוציטים ומונוציטים לכלי הדם והמשיכו בתרביות עד 12 ימים נוספים.

בסוף הניסוי, השתמשו בפיפטה כדי לקצור כל שבר ג'ל קטן, שנקרא כיום קונסטרוקציה, והניחו אותם בבארות של צלחת שש בארות המכילה 10 מיליליטר של מאגר פורמלין 10%. תקן את המבנים במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשך בפרוטוקולי הטבעה, חתך וצביעה היסטולוגיים סטנדרטיים. השיטות המוצגות בסרטון זה מייצרות מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של רירית המעי האנושית.

בתרבית מיקרו-כבידה, התאים מתמיינים היטב ויוצרים מאפיינים מסודרים דמויי וילוס עד היום ה-20. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקפיד על הנחיות טובות לתרבית תאים.

חיוני לשלוט באופן שיטתי בתאים על כדאיות, זיהום מיקופלזמה ושינויים בהתנהגות גדילת התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה על מנת לזהות סמנים של שושלת והתמיינות תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח מודל אורגנוטיפי תלת-ממדי רב-תאי של רירית המעי האנושית המתורבת תחת מיקרו-כבידה.