כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

המטרה הכללית של הליך זה היא לשחזר מבנים דמויי כישור מיטוטי בתוך הגבלה גיאומטרית של טיפות אמולסיה של מים בשמן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הרכבת הכישור המיטוטי, כגון כיצד מיקומם של כישורים וכיצד הם מורכבים, ומהי התרומה הספציפית של רכיבים בודדים לתהליכים אלו? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש בגישת bottom-up לשחזור מבנים דמויי כישור בתוך הגבלה גיאומטרית המדמה את צורתה של תא מיטוטי.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור תהליכים אחרים התלויים בכליאה תאית. ערבבו 10 חלקים של pre-polymer PDMS עם חלק אחד של חומר מעבש במסה כוללת של כ-40 גרמים. לאחר מכן, הניחו את התערובת בתא ואקום למשך כ-30 דקות להסרת בועות אוויר.

בינתיים, עטפו בנייר אלומיניום את התבנית כדי ליצור גביע בעומק של 1 cm ובקוטר של 4 inch. כאשר הדבר מוכן, שפכו כ-3/4 מתערובת ה-PDMS לתוך התבנית. לאחר מכן, החזירו את ה-PDMS לתא ואקום למשך 30 דקות נוספות.

לאחר ניקוי בועות האוויר (degassing), ייבשו את ה-PDMS במשך שעה בטמפרטורה של 100 °C. במקביל, הכינו מספר שקופיות זכוכית לציפוי בסיבוב (spin coating) על ידי ניקוי האבק מהן באמצעות אוויר דחוס. לאחר מכן, בצעו ציפוי בסיבוב של תערובת ה-PDMS שנותרה על השקופיות.

ייבשו את השקופיות הללו במשך שעה בטמפרטורה של 100 °C כדי להקשيح את ה-PDMS. לאחר מכן, קלפו בעדינות את ה-PDMS באמצעות להב תער, ונקבו את החורים הדרושים ברצועות ה-PDMS כדי ליצור שבבים מיקרופלואידיים. כעת, בצעו טיפול קורונה לשבב המיקרופלואידי ולשקופית זכוכית מצופה PDMS למשך מספר שניות.

לבסוף, הנח שבב מיקרופלואידי על כל שקף זכוכית כאשר התעלות פונות כלפי מטה, ואפה את השבבים למשך לילה ב-100 °C. ראשית, באמצעות כלי זכוכית שטופים בכלורופורם, הכן כ-250 µg של ליפידים מומסים בכלורופורם. ייבש בזהירות את תערובת הליפידים באמצעות גז אינרטי.

לאחר מכן, מקם אותו בתא ואקום למשך שעה. לאחר מכן, המס את הליפידים בשמן מינרלי וב-2.5% surfactant בריכוז של 0.5 mg/mL, שהם כ-500 µL. כדי להמיס את הליפידים באופן מלא, בצע סוניקציה לתערובת למשך 30 דקות בתדר של 40 kHz.

בשלב הבא, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של PDMS על זכוכית כיסוי בעובי התואם לעדשת המיקרוסקופ. לאחר מכן, בצעו ציפוי ספין של PDMS על גשמיות זכוכית. כעת, השאירו את זכוכית הכיסוי וגשמיות הזכוכית המצופות ב-PDMS להקשחה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 100 °C.

לאחר מכן, הכינו את תאי הזרימה על ידי הצמדה ברווחים צמודים של רצועות דקות של סרט איטום למעבדה על גבי שקופיות זכוכית מצופות PDMS. מקמו רצועות של 3 mm במרווחים של כ-2 mm אחת מהשנייה. לאחר מכן, כסו את תאי הזרימה עם כיסוי זכוכית (cover slip) מצופה PDMS, ואטמו את המבנה על ידי המסה של הסרט בטמפרטורה של 100 °C למשך דקה קצרה.

לאחר החימום, לחצו בעדינות על כיסוי הזכוכית (cover slip) למטה ואטמו אותו באמצעות Valap. לאחר מכן, הכינו כוס PDMS עבור דימוי לטווח ארוך. נקבו חור בקוטר 4 mm בפרוסת PDMS בעובי 3 mm.

לאחר מכן, בצעו טיפול קורונה לפרוסת ה-PDMS ולכיסוי זכוכית מצופה PDMS. לאחר הטיפול, מקמו אותם זה על זה, ואפו את המכלול למשך לילה ב-100 °C. עקבו אחר היווצרות הטיפות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.

חבר את פאזת השמן הליפידי לבקר הלחץ, והעלה את הלחץ עד שטיפה של שמן תצא מצינור ה-peak. חבר את צינור ה-peak לכניסה מספר שתיים של שבב המיקרופלואידיקה. לאחר מכן, מלא לחלוטין את שבבי המיקרופלואידיקה בפאזת השמן הליפידי דרך כניסה שתיים.

בשלב הבא, הכניסו את הפאזה המائية המבוססת על MRB-80 מכניסה אחת. השתמשו בלחצי הפאזה השמנית של הליפידים והפאזה המائية כדי לשלוט בגודל הטיפות, במטרה ליצור טיפות בעלות קוטר של כ-15 microns. נקודת התחלה טובה היא כ-800 millibar עבור הפאזה השמנית של הליפידים, ו-200 millibar עבור הפאזה המائية.

לאחר השגת גודל הטיפה הרצוי, מלאו לחלוטין את תא הזרימה בטיפות. טיפות אלו נוצרות באמצעות נפחים קטנים של הפאזה המימית. המשמעות היא שעל מערך המיקרופלואידי לפעול במהירות כדי לא לאבד את כל הפאזה המימית לפני שייוצרו טיפות בגודל הנכון.

לאחר המילוי, סגרו בזהירות את קצות תא הזרימה בעזרת Valap. אם הטיפות אינן מפסיקות לנוע, סימן שהאיטום אינו מלא, או שייתכן שחדרו בועות אוויר. לצילום לטווח ארוך, העבירו את הטיפות לכוס PDMS וכסו אותן בשכבה של תערובת שומן ושמן.

הפשירו את הסנטרוזומים בטמפרטורת החדר, והניחו אותם ב-37 degrees Celsius למשך 20 דקות כדי להבטיח גרעיון מיקרוטובולי תקין. בזמן ההמתנה, הכינו על קרח את תערובת הבדיקה. זו צריכה להכיל tubulin, GTP, מערכת לספיחת חמצן, מחוללי כוח מולקולריים כגון מקשרי מיקרוטובוליים, ATP ומערכת להחדשת ATP.

לאחר הערבוב, סובבו את הדגימה במערבל Airfuge מקורר בלחץ של 30 psi למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו את הסנטרוזומים שחוממו מראש לתערובת. בצעו אופטימיזציה לכמות הסנטרוזומים שנוספים כדי להגיע לסנטרוזום אחד או שניים לטיפה.

לאחר מכן, השתמשו בתערובת זו כדי להפיק טיפות אמולסיה כפי שתואר בעבר. כדי לגייס dynein לליפידים ביוטיניליים בקליפת הטיפה, הוסיפו GFP-dynein TMR ו-streptavidin לשלב המימי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסקה מסתובבת, הדמיפו את צמיחת המיקרוטובולי אחרי 30 דקות בטמפרטורה של 26 °C.

במהלך ההדמיה, ניתן לעודד צמיחה של מיקרוטובוליים על ידי העלאת הטמפרטורה ל-28 או אפילו ל-30 מעלות Celsius. עבור היטל Z (Z-projections), יש ללכוד סדרות תמונות במרווחי מיקרון אחד, דבר שאמור לדרוש כ-20 תמונות לטיפה. עברו לפנל המצלמה הראשי, לחצו על Edit Z, והגדירו את Z Step ל-1.0.

לחצו על Next כדי לשמור את ההגדרות. לאחר מכן, הגדירו את ה-EM Gain הליניארי המקסימלי על ידי לחיצה על לשונית Camera בפאנל Acquisition, והגרת סרגל ה-EM Gain ל-300. לאחר מכן, הגדירו את זמן החשיפה (Exposure Time) ל-200 milliseconds באותה לשונית.

לחצו על Record כדי לשמור את ההגדרות. עבור ניסויי דימיון חי (live imaging), בצעו Z Projections בכל שתי דקות למשך שעתיים על ידי הפחתת זמני החשיפה לכ-100 milliseconds, והגדלת מרווחי ה-Z ל-2 microns. עבור ניסויי דימיון חי, השתמשו בכוס PDMS במקום בתא זרימה (flow cell) רגיל כדי להשיג קיבוע מקסימלי של הדגימה.

באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, נחקרה התהוות האסטר (aster) בטיפות שלתית מים ושמן המכילות סנטרוזומים. בתחילה, הסנטרוזומים מפעפעים בחופשיות בתוך הנפחים המוגבלים. לאחר כ-20 עד 30 דקות, המיקרוטובולו-ס הראשונים הופכים לנראים, ותנועת הדיפוזיה של הסנטרוזומים הופכת מוגבלת ככל שהמיקרוטובולו-ס גדלים לכיוון הקורטקס בכל הכיוונים.

כאשר המיקרוטובוליים גדלים מעבר למחצית מקוטר הטיפה, הצנטרוזומים נדחפים לגבולות מנוגדים, כאשר המיקרוטובוליים גדלים לאורך קורטקס הטיפה. ללא סטרפטאווידין, הדינין מפוזר בתוך הטיפה. עם זאת, בנוכחות סטרפטאווידין, תוך כ-10 דקות מהיווצרות הטיפה, הדינין נקשר לליפידים הביוטיניליים.

בעת צפייה בטובולין פלואורסצנטי בנוכחות דינאין קורטיקלי, ניכר כי הצנטרוסומים ממוקמים במרכז. לעומת זאת, בהיעדרו של הדינאין, הצנטרוסומים נדחפים לצדדים מנוגדים של הטיפה. הדבר נובע ככל הנראה מכך שהדינאין מקדם קטסטרופות של מיקרוטובוליים וכוחות משיכה קורטיקליים, מה שמוביל למירכוז של האסטרים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה כדי ליצור מבנים דמויי כישור (spindle) בתוך טיפות של תמיסות אמולסיה כדוריות. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את יצירת הטיפות והדימוג תוך שעתיים עד שלוש שעות, במידה והדבר מבוצע כראוי. באמצעות פרוצדורה זו, ניתן להכניס גורמי הרכבה אחרים של הכישור כדי לחקור את השפעתם על המורפולוגיה והמיקום של הכישור.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת שימוש בכלורופורם או ב-PDMS.