כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים
13 באוגוסט 2016
ההרכבה והמיקום של הציר המיטוטי תלויים בכוחות המשולבים הנוצרים על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות, חלבונים מוטוריים ומקשרים צולבים. כאן אנו מציגים את השיטות שפותחו לאחרונה בהן הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה כדוריות משמשת לבנייה מחדש מלמטה למעלה של צירים מיטוטיים בסיסיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מחדש מבנים דמויי ציר מיטוטי בתוך הכליאה הגיאומטרית של מים בטיפות תחליב שמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרכבת הציר המיטוטי, כגון כיצד ממוקמים ומורכבים צירים, ומהי התרומה הספציפית של רכיבים בודדים לתהליכים אלה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו משתמשים בגישה מלמטה למעלה כדי לבנות מחדש מבנים דמויי ציר בתוך הכליאה הגיאומטרית המחקה את צורתו של תא מיטוטי.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור תהליכים אחרים התלויים בכליאת תאים. מערבבים 10 חלקים PDMS pre-polymer עם חלק אחד של חומר ריפוי במסה כוללת של כ -40 גרם. לאחר מכן, מניחים את התערובת בתא ואקום למשך כ-30 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
בינתיים עוטפים נייר אלומיניום סביב התבנית ליצירת בעומק סנטימטר בקוטר ארבעה סנטימטרים. כשהוא מוכן, יוצקים כ -3/4 מתערובת ה- PDMS לתבנית. לאחר מכן, החזר את ה-PDMS לתא ואקום למשך 30 דקות נוספות.
לאחר הסרת הגז, רפאו את ה-PDMS למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו כמה שקופיות זכוכית לציפוי ספין על ידי אבק באוויר דחוס. לאחר מכן, סובב את תערובת ה-PDMS הנותרת על השקופיות.
רפאו את השקופיות הללו למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס כדי להקשיח את ה-PDMS. לאחר מכן, הסר בעדינות את ה-PDMS באמצעות סכין גילוח, ונקב את החורים הנדרשים מרצועות ה-PDMS כדי ליצור שבבים מיקרופלואידיים. כעת, קורונה מטפלת בשבב המיקרופלואידי ובמגלשת זכוכית מצופה PDMS למשך מספר שניות.
לבסוף, מניחים שבב מיקרופלואידי על כל שקופית זכוכית כשהתעלות פונות כלפי מטה, ואופים את הצ'יפס למשך הלילה בחום של 100 מעלות צלזיוס. ראשית, בעזרת כלי זכוכית שטופים בכלורופורם, הכינו כ-250 מיקרוגרם של שומנים מומסים בכלורופורם. יבש בזהירות את תערובת השומנים בגז אינרטי.
ואז הניחו אותו בתא ואקום למשך שעה. לאחר מכן, ממיסים את השומנים בשמן מינרלי ו-2.5% פעילי שטח ל-0.5 מיליגרם למיליליטר, שהם כ-500 מיקרוליטר. כדי להמיס לחלוטין את השומנים, סוניקציה של התערובת למשך 30 דקות ב-40 קילו-הרץ.
לאחר מכן, סובב את ה-PDMS על כוסות כיסוי בעובי התואם את מטרת המיקרוסקופ. לאחר מכן, סובב את ה-PDMS על שקופיות זכוכית. כעת, רפאו את משקפי הכיסוי המצופים PDMS ושקופיות הזכוכית למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, צור את תאי הזרימה על ידי מרווח הדוק של פרוסות דקות של סרט איטום מעבדה על שקופיות הזכוכית המצופות PDMS. מקם רצועות של שלושה מילימטר במרחק של כשני מילימטרים זה מזה. לאחר מכן, כסו את תאי הזרימה בהחלקת כיסוי מצופה PDMS, ואטמו את המכלול על ידי המסת הסרט ב-100 מעלות צלזיוס למשך דקה מהירה.
לאחר החימום, לחץ בעדינות על המכסה החליק כלפי מטה ואטום אותו עם Valap. לאחר מכן, הכינו PDMS להדמיה ארוכת טווח. נקב חור בקוטר ארבעה מילימטר בפרוסה בעובי שלושה מילימטרים של PDMS.
לאחר מכן, קורונה מטפלת בפרוסת ה-PDMS ובזכוכית כיסוי מצופה PDMS. לאחר הטיפול, הניחו אותם זה על גבי זה, ואפו את המכלול למשך הלילה בחום של 100 מעלות צלזיוס. עקוב אחר היווצרות טיפות במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.
חבר את שלב שמן השומנים לבקר הלחץ, והגביר את הלחץ עד שיוצאת טיפת שמן מצינור השיא. חבר את צינור השיא כדי להכניס שניים משבב המיקרופלואידיקה. לאחר מכן, מלאו לחלוטין את השבבים המיקרופלואידיים בשלב שמן השומנים מהכניסה השנייה.
לאחר מכן, הציגו את שלב המים המבוסס MRB-80 מהכניסה הראשונה. שלוט בגודל הטיפות על ידי שינוי פאזת שמן השומן ולחצי פאזת המים ליצירת טיפות בקוטר של כ-15 מיקרון. כ-800 מיליבר לשלב שמן השומנים, ו-200 מיליבר לשלב המים, הם נקודת התחלה טובה.
לאחר השגת גודל הטיפות הרצוי, מלאו לחלוטין את תא הזרימה בטיפות. טיפות אלו נוצרות באמצעות נפחים קטנים של שלב המים. המשמעות היא שהמערך המיקרופלואידי צריך לפעול במהירות כדי לא לאבד את כל שלב המים לפני שנוצרו טיפות בגודל הנכון.
לאחר המילוי, סגור בזהירות את קצות תא הזרימה באמצעות Valap. אם הטיפות לא מפסיקות לנוע, אז האיטום לא הושלם, או שאולי הוכנסו בועות אוויר. להדמיה ארוכת טווח, העבירו את הטיפות לכוס PDMS, וכסו בשכבה של תערובת שומנים שמן.
הפשירו את הצנטרוזומים בטמפרטורת החדר, והניחו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להבטיח גרעין מיקרו-צינורי תקין. בזמן ההמתנה, הכינו את תערובת הבדיקה על קרח. זה צריך להכיל טובולין, GTP, מערכת נבלות חמצן, מחוללי כוח מולקולרי כגון מקשרים צולבים של מיקרו-צינורות, ATP ומערכת התחדשות ATP.
לאחר הערבוב, סובב את הדגימה ברוטור ה-Airfuge המקורר ב-30 psi למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת את הצנטרוזומים שחוממו מראש. מטב את כמות הצנטרוזומים שנוספו כדי לקבל צנטרוזום אחד או שניים לכל טיפה.
לאחר מכן, השתמשו בתערובת זו כדי לייצר טיפות תחליב כפי שתואר קודם לכן. על מנת לגייס דינאין לשומנים ביוטיניליים בקליפת המוח הטיפתית, כלול GFP-dynein TMR וסטרפטווידין לשלב המים. במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, דמיין את צמיחת המיקרו-צינורות לאחר 30 דקות בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.
בזמן ההדמיה, ניתן לקדם את צמיחת המיקרו-צינורות על ידי העלאת הטמפרטורה ל-28 או אפילו 30 מעלות צלזיוס. עבור הקרנות Z, קח ערימות עם מרווחים של מיקרון אחד, שאמורות לדרוש כ-20 תמונות לכל טיפה. עבור לחלונית המצלמה הראשית, לחץ על ערוך Z והגדר את Z Step ל-1.0.
לחץ על הבא כדי לאחסן את ההגדרות. לאחר מכן, הגדר את רווח ה-EM הליניארי המקסימלי על ידי לחיצה על הכרטיסייה מצלמה בחלונית הרכישה, והחלקת סרגל ה-EM Gain ל-300. לאחר מכן, הגדר את זמן החשיפה ל-200 אלפיות השנייה באותה כרטיסייה.
לחץ על הקלט כדי לאחסן את ההגדרות. עבור ניסויי הדמיה חיה, בצע הקרנות Z כל שתי דקות למשך שעתיים על ידי הפחתת זמני החשיפה לכ-100 אלפיות השנייה, והגדלת מרווחי Z לשני מיקרון. לניסויי הדמיה חיים, השתמש בכוס PDMS במקום בתא זרימה רגיל לקיבוע מקסימלי של הדגימה.
באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, נחקרה היווצרות כוכב בטיפות תחליב מים ושמן המכילות צנטרוזומים. בתחילה, הצנטרוזומים מתפזרים בחופשיות בתוך הנפחים המוגבלים. לאחר כ-20 עד 30 דקות, המיקרו-צינורות הראשונים נראים לעין, ודיפוזיה צנטרוזומית הופכת מוגבלת כאשר מיקרו-צינורות גדלים כנגד קליפת המוח לכל הכיוונים.
כאשר המיקרו-צינורות גדלים יותר ממחצית מקוטר הטיפה, הצנטרוזומים נדחפים לגבולות מנוגדים, כאשר מיקרו-צינורות גדלים לאורך קליפת המוח הטיפתית. ללא סטרפטווידין, דימיין מפוזר בתוך הטיפה. עם זאת, עם סטרפטווידין, תוך כ-10 דקות מהיווצרות הטיפות, דינין מקושר לליפידים הביוטיניים.
כאשר צופים בטובולין פלואורסצנטי בנוכחות דינין קליפת המוח, ברור שהצנטרוזומים ממוקמים במרכז. ואילו בהיעדר דינין, הצנטרוזומים נדחפים לצדדים מנוגדים של הטיפה. זה כנראה נובע מכך שדיניין מקדם קטסטרופות מיקרו-צינוריות וכוחות משיכה בקליפת המוח, מה שמביא לריכוז האסטרים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בטכנולוגיות מיקרופלואידיות כדי ליצור מבנים דמויי ציר בטיפות תחליב כדוריות. לאחר השליטה, ניתן לבצע היווצרות טיפות והדמיה תוך שעתיים-שלוש כאשר הם מבוצעים כראוי. באמצעות הליך זה, ניתן לעטוף גורמי הרכבת ציר אחרים על מנת לחקור את השפעתם על המורפולוגיה והמיקום של הציר.
יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת שימוש בכלורופורם או PDMS.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לשיקום מבנים דמויי ציר מיטוטי בתוך הגבלה גיאומטרית באמצעות טיפות תחליב מים-ב-שמן. הגישה שואפת להבהיר את מנגנוני ההרכבה והמיקום של צירים מיטוטיים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- מדעי המוח
- ביאופיזיקה
רקע
- צירים מיטוטיים חיוניים לחלוקת התא.
- הבנת דינמיקה של צירים יכולה לחשוף תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- הגבלה גיאומטרית מדמה סביבות תאיות.
- שיטות קודמות חסרו טכניקות שיקום יעילות.
מטרת המחקר
- לפתח גישה מלמטה למעלה לחקר הרכבת צירים.
- לחקור את תרומת הרכיבים האינדיבידואליים בדינמיקה של צירים.
- לחקור את השפעות ההגבלה על תהליכים תאיים.
שיטות ששימשו
- הכנת תבניות PDMS לשבבים מיקרופלואידיים.
- יצירת טיפות שומן באמצעות לחצים מבוקרים.
- שילוב של צנטרוזומים ורכיבי מיקרו-צינורות.
- צילום חי של צמיחת מיקרו-צינורות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- שיקום מוצלח של מבנים דמויי ציר בטיפות.
- תצפית על דינמיקה של מיקרו-צינורות תחת הגבלה.
- תובנות לגבי תפקידם של רכיבים אינדיבידואליים בהרכבת צירים.
- הוכחת חלות השיטה על תהליכים תאיים אחרים.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה חדשנית לחקר צירים מיטוטיים.
- ההגבלה הגיאומטרית חיונית לחיקוי תנאים תאיים.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את ההבנה של דינמיקת הצירים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reconstituting mitotic spindle-like structures in geometrically confined emulsion droplets enables precise dissection of force-generating components critical for cell division. This bottom-up system provides a controlled platform for mechanistic de-risking and target validation in early discovery, supporting predictive confidence in cytoskeletal drug target portfolios. The approach bridges the gap between in vitro reconstitution and disease-relevant cellular complexity, informing risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of individual spindle assembly factors under defined conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of microtubule motors, cross-linkers, and cortical anchors.
- Facilitates functional target validation by recapitulating cellular confinement and force-balance.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of cytoskeletal modulators.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, confined biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative outputs on microtubule dynamics and spindle positioning.
- Enables assay standardization and scalability for compound evaluation targeting spindle components.
- Supports platform reuse for diverse cytoskeletal perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro force-balance measurements with disease-relevant mitotic defects.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation of spindle-targeting agents.
- Informs translational biomarker development by quantifying spindle assembly phenotypes.
- Reduces late-stage biological risk by clarifying mechanistic underpinnings of mitotic failure.
Pipeline & Workflow Integration
This reconstitution method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation for cytoskeletal targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on force generation and spindle assembly mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, confined systems with reproducible quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of spindle positioning, microtubule dynamics, and force-balance outputs.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant mitotic phenotypes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various spindle assembly factors and perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spindle-targeting programs.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay systems for cytoskeletal research.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitotic and cytoskeletal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cytoskeletal biochemistry, and advanced imaging.
- Demands access to microfabrication, confocal microscopy, and pressure-controlled droplet generation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of droplet formation and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of confinement and component concentrations.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise control of component stoichiometry.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Microfluidic Chips
2:37
Microfluidic Setup: Lipid Preparation and Making PDMS Items
4:38
Microfluidic Setup: Emulsion-droplet Formation
6:15
Reconstituting Basic Microtubule Asters
7:27
Imaging
8:48
Results: Microtubule Aster Visualization
10:07
Conclusion
