העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate Ciona intestinalis

המטרה הכוללת של טכניקות טרנספקציה חולפת בעוברי Ciona היא לחקור את ויסות הגנים והתפקוד הנדרשים ליצירת זחלים דמויי ראשנים, תוך ניצול השושלת התאית הקבועה שלהם, וגנום חסרי חוליות קומפקטי, על מנת לקבל תובנה לגבי מקורות חסרי חוליות אקורדיטים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטיקה המולקולרית, כגון המנגנונים המשומרים של תוכנית הפיתוח האקורדיטים הרלוונטיים למחקר תאי גזע, ולגילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבעזרת אלקטרופורציה של עוברים אתה יכול להתמודד עם מאות או אלפי עוברים מסונכרנים ביום אחד.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, בגלל הדכוריון של העובר השביר, ומכיוון שקשה לפתח טכניקת מיקרו-הזרקה יעילה. התחל בניתוח בוגרים של Ciona בחדר עוברים מקורר של 18 מעלות צלזיוס. השתמש במספריים קטנים כדי לבצע חתך בקצה הנגדי של הסיפונים ובצד הסיפון הקצר יותר, שמתחתיו עובר צינור הביצית וצינור הזרע.

האריכו את החתך כדי לחשוף את צינור הביצית. לאחר מכן, השתמש בקצה המספריים כדי לבצע חתך מדויק בצינור הביצית. לוחצים בעדינות על צינור הביצית עם המספריים הסגורים ומפשיטים את הביצים.

אפשר לביצים ליפול ישירות לצלחת של שש בארות המכילה מי ים מלאכותיים עם HEPES. השתמש בפיפטה פסטר, שטופה מראש עם ASWH, כדי לאסוף ולהעביר את הביצים הנותרות. כדי לאסוף זרע, חתכו את צינור הזרע עם המספריים, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה נפרדת כדי לאסוף זרע מרוכז, והעבירו לצינור של 1.5 מיליליטר.

הפעל את הזרע על ידי שילוב של מיליליטר אחד של ASWH ו-50 מיקרוליטר של טריס בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של זרע מרוכז, סגרו את הפקק וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור, או באמצעות פיפטה פסטר. לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטר מתמיסת הזרע הפעיל לכל באר ביציות, וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, כך שהביצים צפות בתווך.

התחל בניקוי על ידי איסוף הזיגוטות וחלוקתן לצינורות זכוכית. בעזרת הצנטריפוגה הידנית, סובב את הזיגוטות ב-1200 פעמים G למשך כ-20 שניות, ואז עצור לאט את הצנטריפוגה. הסר את ה- ASWH מהכדורים בעזרת פיפטה פסטר.

הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת דה-כוריונציה מופעלת לגלולה בכל צינור. תלו את הזיגוטות על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה באמצעות פיפטת פסטר שטופלה במי ברז, ומעליו אגס גומי קטן. התמיסה אמורה להפוך צהבהבה לאחר 1 עד 3 דקות.

במהלך הדכוריוניציה, הסר חלק קטן מהתרחיף המחורר, באמצעות פיפטת הפסטר. הניחו טיפה על שקופית, והתבוננו בה תחת המיקרוסקופ המנתח. פיפט את מתלה הזיגוטה למעלה ולמטה, ובדוק את השקופית כל 20 עד 30 שניות.

תחילה תאי הזקיק מתנתקים, לאחר מכן הכוריון הופך לצהוב ואטום, ולבסוף הוא מתנתק מהזיגוטים. זיגוטות ורודות מפוזרות ישקעו לתחתית צינור הזכוכית. לאחר שיותר מ-50% מהזיגוטות עוברות דה-כוריון, מלאו את הצינור ב-ASWH.

צנטריפוגה עדינה מאוד למשך כ-10 עד 15 שניות, בדיוק מספיק כדי לשקוע את הזיגוטות המפורקות. עצור את הצנטריפוגה לאט. הסר כמעט את כל הנוזל מצינור הזכוכית, כולל כל חומר צף, והחלף ב-ASWH.

פיפטה לאט למעלה ולמטה לכביסה, ואז צנטריפוגה בעדינות כמו קודם. שוטפים שוב עד שלא נותר פסולת כוריון. משקעי הכבידה שוטפים לזיגוטות דה-כוריוניות בצינורות סיליקון של 1.5 מיליליטר.

לאחר השקיעה, הסר את ה- ASWH עד לסימון 100 מיקרוליטר על הצינור. כעת השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף 250 מיקרוליטר של DNA שהוכן בעבר בתמיסת מניטול לשפופרת אחת של זיגוטים. מערבבים בעדינות, ומעבירים מיד את התערובת לקוביית אלקטרופורציה של ארבעה מילימטרים.

הנח את הקובט לתוך מחזיק האלקטרופורציה, ותן דופק בודד של 16 מילישניות ב-50 וולט. לאחר מכן מוציאים את הזיגוטות מהקובטה באמצעות אותה פיפטת פסטר, ומוציאים אותן לתוך צלחת תרבית המכילה ASWH טרי ומסונן. מערבבים את המנה כדי לפזר את הזיגוטות.

שוטפים את הפיפטה בכוס ASWH ואז עוברים לדגימה הבאה. לאחר העלאת כל הזיגוטים, יש לגדל את הזיגוטות בטמפרטורה של 15 עד 20 מעלות צלזיוס. הגדר את המיקרו-מניפולטור בחדר מקורר של 18 מעלות צלזיוס.

חבר את צינור הפלסטיק ואת מחזיק המחט למזרק זכוכית של 10 מיליליטר מלא בשמן מינרלי. מלאו מחדש את הצינור ואת מחזיק המחט בשמן, והוציאו את כל בועות האוויר. הכנס את מחט ההזרקה המכילה 0.5 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה עם צבע חיוני ירוק במחזיק המחט.

ומקם את המחזיק על המיקרו-מניפולטור. כוונן את מחזיק המחט כך שינוע לאורך קו ישר בזווית של 45 מעלות ביחס למשטח. אוריינט ביצים מפוזרות בצלחת תרבית קטנה מצופה אגרוז לאורך שקע, כך שניתן יהיה להזריק את הביצים אחת אחת תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.

במידת הצורך, שברו את קצה המחט על ידי דחיפה עדינה של המחט כנגד חתיכת כיסוי זכוכית, המונחת על האגרוז. הפעל לחץ קל כדי לוודא שקצה המחט פתוח. הזריקו את הביציות הלא מופרות אחת אחת, על ידי החדרת המחט תחילה לביצית, ושאיבה קלה לשבירת קרום הביצה.

לאחר מכן, הזרקו את תמיסת ההזרקה הירוקה לאמצע הביצית, עד לשליש מקוטר התא לכל היותר. לאחר הזרקת כל הביציות, הסר את המחט, העביר את הביצים המוזרקות והלא מופרות לכלי תרבית טרי ודגירה בחום של 15 עד 18 מעלות צלזיוס עד להפריה. מיקרו-הזרקה שימשה לחקר ויסות גורם השעתוק של מיאלין Ciona intestinalis או, MyT, בשלב הגסטרולה של עוברי Ciona.

מנוטר על ידי הכלאה אינסטו, ביטוי אנדוגני נצפה במבשרי הצלחת העצבית בשורה השישית בסוג פראי. מיקרו-הזרקה של מורפולינים כדי להפיל גורמים עובריים מוקדמים, כגון Forkhead box A, גורם שעתוק, מבטלת את ביטוי ה-MyT הכולל. לעומת זאת, ביטוי MyT מופעל באופן אקטופי עם ויסות למטה של הצמתים, מה שמרמז על כך שהצומת בדרך כלל מדכא את ביטוי MyT במבשרי חוט העצב הצדדיים הללו.

גורם השעתוק GATAa תויג בתג נוגה, והותאם לבלסטומרים אקטודרמליים עם דרייבר pfog. כפי שניתן לראות כאן, GATAa ממוקם בעיקר לגרעינים, כצפוי עבור גורם שעתוק. ואילו הביטוי של ונוס נמצא בכל מקום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע טרנספקציה חולפת על ידי אלקטרופורציה לזיגוטות Ciona מסונכרנות, כיצד לטפל בעוברים השבריריים המפורקים, וכיצד למצוא את הזווית הנכונה של מיקרו-הזרקה. לאחר פיתוחן, טכניקות אלו סללו את הדרך לקראת גנומיקה פונקציונלית. לחקור את תפקוד הגנים, רשתות ויסות גנים ולשמר מודולים התפתחותיים, החשובים להיווצרות רקמות גם בבני אדם.