יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

המטרה הכוללת של מערכת זיהום חדירה זו המבוססת על החדרת ממברנה היא לחקור את ההשפעות של רעלני חיידקים המופרשים על תאי המארח במהלך זיהום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין מארח-פתוגן, כגון כיצד רכיבי חיידקים ספציפיים המופרשים תורמים לתגובות התא המארח במהלך זיהום חיידקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור רכיבי חיידקים מופרשים, ומדגמת מקרוב יותר סביבת מארח-פתוגן רלוונטית מבחינה פיזיולוגית בהקשר של זיהום אנושי.

שתדגים את ההליך תהיה רבקה פלהרטי, סטודנטית בכירה לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להכין סטרפטוקוקוס איזוגני מסוג בר מקבוצה A, או GAS, וזנים מוטנטיים GAS M1T1 5448, התחל תרביות נוזליות למשך הלילה על ידי חיסון חמישה עד 10 מיליליטר של מרק טוד יואיט ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. צנטריפוגה את תרביות החיידקים הלילה והשתמש בנפח המקורי של מדיום חיידקי טרי כדי להשעות מחדש את הגלולה.

לאחר מכן, נרמל את תרביות החיידקים לריכוזי התחלה שווים על ידי דילול התרביות המושעות מחדש במדיום נוסף כדי להגיע לאותו OD600. כדי לאסוף ליזטים לביצוע ניתוח איתות ומבחני קביעת ATP, צלחת תאי HaCaT בצלחות של שש בארות בצפיפות ישיבה של בערך פי שלושה מ-10 עד התאים החמישיים לבאר, ותרבית למפגש של 90%. כדי לבצע בדיקות חדירה של ממברנת אתידיום הומודימר ושחרור לקטט דהידרוגנאז, יש לצלחת תאי HaCaT בכלים של 24 בארות בצפיפות ישיבה של בערך פי חמישה מ-10 לתאים הרביעיים לבאר, ולגדול למפגש של 90%.

מיד לפני הטיפול, השתמש ב-PBS 1x כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן יש למרוח שני מיליליטר של מדיום גידול טרי עם או בלי טיפול תרופתי על צלחות שש הבארות, או 0.5 מיליליטר מדיום על בארות של צלחות 24 בארות. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע הלמינר, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח בזהירות תוספת קרום חדירה סטרילית של 0.4 מיקרון לכל באר.

טיפול עדין וסטרילי בתוספות החדירות במהלך הכנת הזיהום הוא קריטי כדי למנוע מהממברנה להיפגע או להזדהם במהלך תהליך זה. מרחו תרביות תאים טריות בינוניות על החדר העליון של כל באר בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, החל נפח מתאים של תרביות החיידקים המנורמלות על החדר העליון של מערכת הכנסת הממברנה החדירה, והחל מדיום חיידקי על בארות הבקרה.

הוספה זהירה של החיידקים לחדר העליון, כמו גם הובלה עדינה של התאים הנגועים לאינקובטור, הם קריטיים, מכיוון שחיוני שחיידקים לא יזהמו את החדר התחתון במהלך מערך הניסוי. כדי להעריך חלבוני מארח מופרשים, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את תוספת הממברנה החדירה. לאחר מכן, תוך כדי לא להפריע לשכבת התאים החד-שכבתית, אסוף את המדיום מהתא התחתון לצינורות של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 RCF וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול פסולת תאית. לאחר מכן, הסר את כל הסופרנטנט מלבד 50 מיקרוליטר, העביר לצינור טרי של 1.5 מיליליטר ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמש מיד. להערכת ליזטים של תא מארח, שאפו בעדינות את המדיום מעל החד-שכבתי מבלי להפריע לתאי המארח.

לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת. שאפו בעדינות את ה-PBS, ומרחו מיד נפח של מאגר ליזה קר כקרח כדי להשיג, למשל, ריכוז חלבון של 0.5 עד 1.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים משטח הצלחת של כל באר, ולהעביר את כל התוכן של כל באר לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 RCF וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי להעריך רכיבי ליסטאט מסיסים, העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי, ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמשו מיד.

כדי להעריך רכיבי ליזאט גרעיניים או בלתי מסיסים אחרים, שמור את הגלולה ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס, או השתמש מיד. להערכה על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית, שאפו את המדיום והשתמשו ב-PBS קר פי 1 כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, עם 4% PFA ו-PBS, תקן את התאים בן לילה.

בצע ניתוחים נוספים על פי פרוטוקול הטקסט. נתוני הכתם המערבי המוצגים כאן מדגימים הפעלה משופרת משמעותית של p38 MAP קינאז וקרטינוציטים בנוכחות סטרפטוליזין S או זני גז המייצרים SLS, מה שמצביע על כך שמערכת זו עשויה לשמש להערכת שינויים בהפעלה של חלבוני איתות מארח בלתי תלויים במגע. באיור זה, מוצגת הפעלה תלויה ב-SLS של הגורם הגרעיני הדלקתי המרכזי - kappa B, אשר עובר מהציטופלזמה לגרעין עם ההפעלה, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש במערכת זו כדי להמחיש את ההשפעות של גורמי חיידקים המופרשים על תגובות חלבון מארח באמצעות גישות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטיות.

כאן, עלייה משמעותית הן בחדירות הממברנה והן בשחרור LDH מתאי המארח מודגמות בעקבות חשיפה לזני גז המייצרים SLS, בהשוואה לתאים לא נגועים או תאים שנחשפו לזן חסר SLS. תוצאות אלה מצביעות על כך שמערכת זו יכולה להעריך שינויים תלויי רעלן בציטוטוקסיות של המארח. בניסוי זה נקבעו רמות ה-ATP בקרטינוציטים והתגובה לזיהום בגז.

16 שעות לאחר ההדבקה, נצפתה ירידה משמעותית ב-ATP, ואובדן ה-ATP היה בולט יותר בנוכחות SLS, עקבי עם העלייה התלויה ברעלן באיתות תגובת הלחץ והרעילות של המארח. לאחר הקמתה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את התגובות הספציפיות של כל גורם מיקרוביאלי המופרש במגוון סוגי תאים מארחים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לתרגל טכניקה סטרילית לאורך שלבי ההתקנה הניסיוניים, ולשמור על טיפול זהיר בתוספות הממברנה החדירה, הן במהלך ההתקנה הראשונית והן במהלך איסוף הדגימות.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון Western Blotting, הדמיה אימונופלואורסצנטית ובדיקות חדירה לממברנה, על מנת לקבוע כיצד הגורם החיידקי המעניין תורם לשינויים במפלי האיתות ומשפיע על הציטוטוקסיות הכוללת במהלך הזיהום. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין דגימות של תאים מארחים להערכה של מגוון תגובות של תאים מארחים בעקבות חשיפה לגורם חיידקי ספציפי המופרש מעניין. אל תשכח שטיפול בחומרים מסוכנים ביולוגית, כגון פתוגנים חיידקיים, דורש שיקולי בטיחות מסוימים.

שימוש נכון במשקפי בטיחות, כפפות ומעילי מעבדה, יחד עם שימוש נכון בקולט אדים, הכרחי כדי לבצע ניסויים אלה בבטחה.