Name: שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: חקור שיטה חישובית לקביעת מקדמי חדירות ודיפוזיה במודלים תלת-ממדיים של עור באמצעות מערכת ממברנות קטנה. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה ואופטימיזציה של סימולציות ליישומים בפרמצבטיקה וקוסמטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נוצרה באמצעות תמיכה כספית מ דויטשה פתוח (DFG) תחת גרנט לא. PO413/12-1 ו- LA 1028/7-1.

<ol><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip+developments%3A+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li>
<li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li>
<li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li>
<li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li>
<li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li>
<li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22459170">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li>
<li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Occup+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li>
<li>Ng, S. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li>
<li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Dev+Tecnol%22%5BJournal%5D)">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li>
<li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels%3A+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li>
<li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li>
<li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li>
<li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li>
<li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Rech%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li>
<li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4386065/">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).</li>
<li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li>
<li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7816761">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li>
<li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-%CE%B2-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li>
<li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11512545">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li>
<li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X86908560">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li>
<li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li>
<li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.tau.ac.il/~klafter1/258.pdf">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li>
</ol>

Uwe מרקס הוא המנכ ל ובעל מניות והוא גרד לינדנר מניות של TissUse GmbH, חברת מסחור הטכנולוגיה MOC וייצור. מחברים אחרים מצהירים אין ניגוד אינטרסים בדבר הפרסום של המאמר.

מחקר זה מתעד שיטה שפותחה כדי לכמת הסתננות דרך מבנה רקמות מהונדסים על קרום. הסתננות של חומרים עם שינוי מולקולרי גדלים באמצעות ג'ל agarose נבדק קודם כדי לבדוק ולאמת את השיטה ואת ההדמיה המתאימות. זה ידוע כי מולקולות קטנות לחדור יותר מהר דרך רשת matrix (למעט האפקט בג'ל סינון על-ידי חדירות גזים). תצפיות דומות נעשו עם גודל-הדרה ניסויים של חומרים דרך בסקלרה26, ממברנה עוריות אנושי27, העור האנושי17, ועכברוש העור28. מתאם הפוך בין המקדמים של חדירות רדיוס סטוקס המתאים (הרדיוס של כדור קשה שזז עם דיפוזיה באותו קצב כמו שהמולקולות מתואר, בדרך כלל קטן יותר רדיוס אפקטיבי של המולקולה) הוכח 26 , 28, מערכת יחסים דומה נצפתה בניסויים עם חומרים מולקולריים בגדלים שונים. ידי מקדמי חדירות על רדיוס 1/סטוקס, נמצאה התאמה לינארית מעל מארבע הקבוצות עם גודל מולקולרי הקטן ביותר (R2 = 0.93) (איור 6). אפשרות זו מציינת כי הם מקדמים חדירות מדומה עם השיטה הציע במגוון מציאותי.
השגיאה % 46.15 בניסויים הוא מעט גדול יותר. מאשר דיווח לניסויים חדירות עם מערכת10תא דיפוזיה פרנץ. הסבר אפשרי אחד יכול להיות התפלגות גודל של fluorescein-isothiocyanate-לתוספי, אשר נדון מאוחר יותר.
השיטה המתוארת יש חשוב יתרונות לעומת שיטות באמצעות מערכת תא פרנץ דיפוזיה. ראשית, ההגדרה תהיה יותר קומפקטי; הניסויים מתבצעות ישירות במערכת ממברנה הוספה, שבו יש את קנה המידה של צלחת טוב מסחרי (∼ 13 ס מ x 8.5 ס מ). דבר זה מאפשר מספר דוגמאות שיש להפעיל בעת ובעונה אחת, ואילו תא נפרד של דיפוזיה פרנץ נדרש עבור כל דגימה. שנית, החדירות של מודל העור ניתן ישירות למדוד את תותב ממברנה, שם מתקיים הטיפוח. באמצעות תאים דיפוזיה פרנץ, הדגימות יש לחסל, רכוב על המערכת, אשר הוא מסורבל יותר עבור מדגמים קטנים והוא גם אורכת זמן רב.
הסתננות ניסויים עם קולגן תא מטריצות הראה כי בשיטה זו ניתן ליישם בהצלחה מערכות נזרע התא. המודל המוצג כאן אומתה לדגמי העור; עם זאת, ניתן להחיל את שיטת לסוגים אחרים של תרביות תאים אורגני, למשל, בכליות או בכבד.
במחקר זה, שימשה מודל קולגן תאים שבו התאים HaCaT מכוסה לחלוטין ממשטח הדגם (ראה איור 5). זה הוביל לירידה של מקדם פרמאביליות, הדגמת השיטה היא רגישה מספיק כדי להבדיל את מקדם חדירות בין מודל קולגן תאים עם ובלי שכבה של HaCaT. באופן אידיאלי, מודל העור צריך לבנות מחסום, אשר מתקרב של האפידרמיס של העור האמיתי29, לכן חשוב לוודא את איכות העור המודל לפני השימוש בפועל (למשל, הבניין של העור, האפידרמיס). הפיתוח של מודל העור יכול להיות דמיינו מכתים טכניקות, לכמת מן הגילוי של העור חלבון וקולגן30,31,32. המקדם חדירות עשוי גם להיות גורם חשוב להערכת התפתחות המודל העור, אך בהמשך הניסויים נדרשים לאשר זאת. כאמור, שיטה זו מאפשרת הפעלה דגימות מרובים במקביל. זה גם אפשר לקחת דגימות במהלך הטיפוח למדוד פרמאביליות, ולבחון ובכך הפיתוח של הפרמטר של המודל העור.
יצוין, כי חדירות. נמדד באמצעות ג'ל/קולגן-תא-דגם קרום בו זמנית. המקדם שזוהו חדירות הוא ספציפי למערכת, לפיה תוצאות מודלים עור שונים ניתן רק להשוות בעת שימוש את תותב קרום זהה. יתר על כן, המודל העור צריך לכסות את האזור כולו הטיפוח-תרגול על מנת להבטיח כי החומר במבחן לחדור רק דרך המודל, לא בצמוד לו, אשר זירוז שגיאות ב- החדירות נמדד. היבט נוסף שיש לשקול בעתיד הניסויים הוא הסביבה הטבעית המקיפים את העור. בדרך כלל, הטמפרטורה של פני העור הוא נמוך בהשוואה האזור הפנימי, אשר יכולים להשפיע על התנאים הסתננות.
כדי ליישר ניסויים במעבדה עם סימולציות מחשב, הוצגה שיטה המאפשרת אופטימיזציה פרמטר עבור יישומי סימולציה. סימולציות נמצאו יעלה בקנה אחד עם נתוני הניסוי חומרים עם גודל מולקולרי קטן. עם זאת, הסטיות בין סימולציה נתוני הניסוי נצפו חומרים בגודל מולקולרי גדול יותר. מולקולות גדולות רב-סוכר ניתן להגביר את החיכוך, להאט את תהליך דיפוזיה של ג'ל. אפקט זה גורם לא תקין דיפוזיה, המהווה סיבה אפשרית הסטייה בין ניסיוני ו סימולציה הערכים33,34. הסבר אחר יכול להיות הנוכחות של חלקיקים קטן או גדול יותר ב- fluorescein-isothiocyanate-לתוספי. היצרן מציין את המשקל המולקולרי של החומר כגודל מרושע עם מגוון נתון, אשר מאפשר חלקיקים קטנים יותר, גדול יותר להיות נוכח. לא ברור גם איך התפזרו חומרים אלו הם, כפי החלקיקים קטנים יותר מהר יותר לחדור דרך הג'ל וערוץ נוזלים. זה אפשרי להרחיב את הסימולציה לשקול אלה דיפוזיה ואפקטים חיכוך.
חדירות ניסוי של הדמיה פותחו לשימוש ב- 2-הציוד בעזרתו של הסימולציה, שיטה ניסויית זו ניתן להעביר ישירות כדי מתוחכמים יותר setups ניסיוני. לדוגמה, ניתן בקלות להעביר ממברנה הוספה מערכת סימולציה הגיאומטריה של 2-OC או למערכות אחרות עם set-ups דומה. אפשרות זו הכוח ויסות הסימולציה יכול לשמש כדי לתמוך את העיצוב של ניסויים עתידיים. בנוסף, ניתן לשלב תופעות לוואי כגון אידוי, פיזור נורמלי ואפקטים ממברנה כדי לשפר את ההדמיה, ובכך לשפר את דיוק. התוכנית סימולציה נותן את ההזדמנות כדי לשנות או לשפר את המשוואה סימולציה, כמו גם באשר לשלב מודולים פיזיים אחרים במטרה לחקור היבטים אחרים של התפתחות מודל העור. דוגמה אחת היא ההדמיה של צריכת גלוקוז וייצור לקטט במודל תא קולגן.
היבט מעניין במיוחד של חומרים רפואיים בדיקת הוא איך החומרים מופצים בכל מערכת איברים-על-שבב. הפרמטר חדירות וחידונים לעזרתי כדי לענות על שאלות כגון מה המהירות חומר מפעפע לתוך המערכת, כמו גם הריכוז אשר יהיו זמינים בשביל לרקמות אחרות במולטי-organ-צ'יפס. שיטה זו יכולה לתמוך ולשפר הפיתוח ובדיקות של מערכות איברים על שבב כאלה.

אורגניות טיפוסי תרבויות 3D הפכו כלים רבי-עוצמה עבור פיתוח תרופות, חומר בדיקה1. במובן זה, העור האנושי הדוגמניות עניין מיוחד עקב דרישות רגולטוריות, כגון אלה בתעשיית הקוסמטיקה. הם הובילו בהמשך פיתוח מודלים 3D עור רבים, לשימוש או על תרבויות יחיד-איבר משלהם כמו צלחות רב טוב, או מולטי-organ-צ'יפס בשילוב עם מודלים איברים נוספים, למשל, את הכבד2.
לגבי טיפוח של מקבילה העור, הממשק אוויר נוזלי (עלי) הוא מרכיב חיוני עבור נאות בידול באפידרמיס3. תא תרבות מוסיף המורכב כלי קיבול עם קרום חדיר נוזלים בתחתית משמשים בדרך כלל להקים של עלי. ALIs מנוצלים נרחב זמינים מסחרית העור דגמים כמו EpiDerm4, Phenion5ו – Episkin6, על התרבות של העור דגמים עם גדלים מ 96-ובכן (4.26 מ"מ קוטר) עד 12-טוב (12.2 מ"מ קוטר) צלחות. השיטה המתוארת כאן קובע את הסתננות של חומרים במערכת הוספה ממברנה.
המקדם חדירות הוא פרמטר משמעותי להערכת האיכות של כל עור-דגם בתרבית לעומת עור מקורי5, והוא משמש כדי להעריך כמה מהר חומרים פעילים להעביר דרך העור. במיוחד אם סמים או קוסמטיקה מוצרי צריך להיות מוחל על העור, פרמטר זה חיוני להבין מתי בדיוק סוכנים פעילים עוברים. הדמיה נוספות יכול לעזור לחזות את אופן הפעולה של המערכת, לאחר מכן להפחית את המאמץ הדרוש ניסיוני גוזלת זמן, במיוחד כאשר קבוצה גדולה של חומרים מעורב.
התא דיפוזיה פרנץ היא המדינה-of-the-art הסתננות ניסויים עם העור, העור מודלים5,6,7,8,9. מכשיר זה כולל שני תאים עם מדגם קבוע (מחסום דיפוזיה) בין לבין. החומר להיבדק מוחל ישירות לחלק העליון של המדגם (התורם תא), הריכוז של המתחם חודרני ניתן להבחין ב התא הנגדי (מקבל). בצד מקבל, טמפרטורה קבועה וריכוז חומר הומוגני מובטחים דרך תא טמפרטורה של פגים. ניתן לקחת דגימות של זרוע דגימה בצד מקבל התא פרנץ. עם מגוון גובה 19 ס"מ בין 179 ס מ, מערכת זו היא גדולה יחסית10,11. שיטה נוספת לקביעת מקדמי דיפוזיה של חומרים דמוי ג'ל ורקמות היא FRAP. שיטה זו משתמשת העיקרון של הלבנת fluorescently שכותרתו חלקיקי הג'ל, ואז לקבוע את זמן ההחלמה של האזור מולבן לחישוב13,1412,מקדם דיפוזיה.
יתר על כן, ספקטרוסקופיית פורייה-המרה-תת-אדום (FTIR) ניתן להשתמש כדי לזהות תנועה של חלקיקים עם ספיגת האור האינפרא-אדום על מנת לקבוע את תהליך הסתננות של חומרים לעור15,16. עם זאת, אלה או שיטות הדמיה אחרות (למשל, שני הפוטונים פלורסצנטיות המתאם ספקטרוסקופיה17) צריך לעלות מכשירים אינטנסיבית.
במאמר זה, שיטה מוצג ישירות מודדים את החדירות של מחסום בתוך מערכת הוספה ממברנה, איפה מודל העור יכול להיות מעובד. שיטה זו מאפשרת חדירות ניסויים כדי לפעול עם מספר רב של דוגמאות קטנות (טוב גודל למעלה מ"מ 4.26) עוד מערכת קומפקטית. זאת בניגוד פרנץ דיפוזיה התא, איפה מכשיר נפרד נדרש עבור כל בדיקה, אשר חייב להיות מותקן על המכשיר קשה להבין עבור מדגמים קטנים (גודל של 4.26 מ מ). יתר על כן, מאז השיטה אינה דורשת מכשור הגדולות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או multiphoton), צמצום זמן ועלות מושגת.
כל הניסויים בוצעו ב נקבובי ממברנה להוסיף מערכות עם דגימה (מכשול) המורכב agarose ג'ל או מודל תא קולגן נוסדה בהקרום. חומרים פלורסנט (תורם) עם משתנה גדלים מולקולרית יושמו לחלק העליון של המדגם, הריכוז של חומר חילחלו זוהה בתחתית (מקבל) שימוש בקורא צלחת קרינה פלואורסצנטית (ראה איור 1). על מנת לאמת את שיטת ולבדוק את הדיוק של סימולציה זה, ג'לים agarose היו המיוצר, משמש כמחסום. Hydrogels משמשים בדרך כלל עבור החקירה של תהליכי דיפוזיה, הסתננות במדיום נקבובי ביולוגיים.13. השיטה נבחנה אז נזרע תא מערכת המורכבת קולגן מטריצה של fibroblasts ראשי ו למבוגרים נמוך סידן גבוהה טמפרטורה keratinocytes (HaCaT) תאים אנושיים (מטריצה תא מודל), אשר עור מפושטת דגם18,19 .
בנוסף, תהליך הסתננות היה מדומה בעזרת סימולציות זרימה עם חישובית דינמיקה של נוזלים. נמצא כי, על-ידי הפרמטר אופטימיזציה, מקדם דיפוזיה יכול לחשב מתוך המידע מהניסוי. באופן כללי, סימולציה זה מציעה יישומים שונים; למשל, ניתן לחזות תהליך הסתננות המבוסס על ניסויים קצר, הסימולציה להפחית באופן משמעותי את מספר ניסויים.
השיטה הניסיונית וסימולציות תוכננו עבור היישום מערכת איברים-על-שבב1,20,21,1,22, פותחה במיוחד 2 האיברים-צ'יפס-(2-OC) 23,24,25. בעקרון, ניתן לתאר את תהליך הסתננות של כל דגם אורגן המבוסס על רפידה הוספה מערכות בדרך זו.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>אבקת קולגן ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td></td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>תמיסת קולגן R 0.4</td></tr>% <tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>סרום עגל עוברי</td></tr><tr><td>פלואורסצאין נתרן מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>46944-500 מ"ג</td><td>4000 גרם/מול</td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 גרם/מול</td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 גרם/מול</td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 גרם/מול</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>ללא סידן, ללא מגנזיום, עם פנול אדום</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>טבליות</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>טבליות</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture מוסיף</td><td>קורנינג</td><td>3391</td><td>96 באר, 0.4 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>Transwell תרבית תאים מוסיף</td><td>קורנינג (VWR)</td> <td>734-1563</td><td>12 באר, 0.4 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>עם EDTA</td></tr></tbody></table>

שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

במבחנה מגידולי העור מודלים הפכו יותר ויותר רלוונטי עבור יישומים התרופות, הקוסמטיקה, משמשים גם פיתוח תרופות, כמו גם חומר בדיקה. מודלים אלה בעיקר המטופחים במערכות ממברנה-הוספה, חדירות שלהם כלפי חומרים שונים להיות גורם חיוני. בדרך כלל, השיטות יישומית לקביעת פרמטרים אלה דורשות לרוב גדלי מדגם גדולים (למשל, פרנץ דיפוזיה תא) או ציוד מפרך (למשל, קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP)). מחקר זה מציג שיטה לקביעת מקדמי חדירות ישירות במערכות ממברנה-הוספה עם קוטר בגדלים של 4.26 מ"מ ו 12.2 מ"מ (טיפוח אזור). השיטה אומתה עם agarose, ג'לים קולגן, כמו גם מודל תא קולגן המייצג העור מודלים. התהליכים הסתננות של חומרים בגדלים שונים מולקולרית, הסתננות דרך מודלים תאים שונים (המורכב של קולגן ג'ל, פיברובלסט HaCaT) תוארו במדויק.
יתר על כן, כדי לתמוך בשיטה ניסויית שלעיל, הוקמה סימולציה. הסימולציה מתאים המידע מהניסוי היטב עבור חומרים עם גודל מולקולרי קטן, עד כדי 14 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (4,000 מגה-וואט), ולכן הוא כלי מבטיח כדי לתאר את המערכת. יתר על כן, הסימולציה יכול להפחית במידה ניכרת המאמצים ניסיוני, יציבה מספיק כדי להיות מורחב או סוגל setups מורכבים יותר.

ניסויים חדירות קרום 96-ובכן להוסיף מערכת עם ג'ל agarose 2% כמו מחסום נערכו על מנת להעריך את הדיוק של סימולציה. Fluorescein נתרן מלח (NaFl) fluorescein isothiocyanate-dextranes (FD) שימשו כדי לאמת את ההשפעה של גודל מולקולרי של החומר באמצעי מ 5 10x-10 מ' למעלה כדי 45 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (376.27 40,000 mol wt). פרמטר יליד אופטימיזציה הסימולציה שימש כדי להתאים את הסימולציה נתונים ניסיוני.
לשם כך, מדרונות רק החלקים ליניארי של החדירות מדומה הושוו לתוצאות הניסוי. עבור גודל מולקולרי קטן, סימולציה נתוני הניסוי היו בהסכם טוב עם 99.2% עבור NaFl ו 80.2% עבור FD 4,000 (ראה איור 4a , 4b יבינו). גודל מולקולרי גדול שנוצר סטיות גבוהה מציג מתאמים של 50.5% עבור FD 10,000, 79.7% עבור FD 20,000 ו- 53.6% עבור FD 40,000. התקדמות עקומה הסימולציות הראו עיכוב בתחילתה ואת עלייה חזקה יותר בקורס נוסף של תרשימי (ראה איור 4 c–4e).
חדירות והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה מוצגות באיור בטבלה 4. המקדם הסתננות יורד עם הגדלת גודל מולקולרי. סטיית תקן היה בין 0.08 x 10-8 m/s 0.47 x 10-8 m/s (N = 7), אשר תאמו היא טעות מוחלטת בין 4.18% ל 46.15%. ניסויים עם מולקולות גדולות יותר הראה שגיאת מוחלטים גדולים יותר. מקדמי דיפוזיה מדומה התנהגו באופן דומה מאוד ל מקדמים חדירות ניסיוני. חומרים עם רדיוס גדול יותר סטוקס הראו הפחתת המקדמים דיפוזיה, ושגיאה מוחלטת נע בין 9.09% ל- 18.46% (N = 3).
בניסויים נוספים הסתננות, ארבעה סוגי מודל של תאים קולגן שונים שימשו כמו מחסומים קרום 12-טוב להוסיף מערכת. מודלים אלה מהווים מודל ללא תאים דגם תא עם שילובים שונים של ראשי fibroblasts ג'ל קולגן, HaCaT על פני השטח. שימשו את השילובים הבאים: קולגן (קולונל) כמודל ללא תאים, קולגן + Fibroblasts (אל"מ + פ), קולגן + HaCaT (אל"מ + ה'), ואת קולגן + Fibroblasts + HaCaT (אל"מ + פ + ח.). Fluorescein מלח נתרן עם DMEM + 10% FCS שימש חומר התורם. התמונה שימש ניתוח של המודל תא קולגן, צביעת ועם hematoxylin אאוזין (הוא). זה מכתים נעשה באמצעות הפרוטוקול של היצרן. איור 5, כתם כזה עם דגם אל"מ + פ + ח נציג מוצג. הוא מעט כתמי מבנה רקמת קולגן המטריצה. Fibroblasts ממוקמים במטריצה, הגרעינים של פיברובלסט ותאים HaCaT מוכתמים בסגול כהה. על גבי מטריצת קולגן, יש שכבה הכוללת גרעינים רבים, אשר צריכה להיות הגרעינים של HaCaTs, בניית שכבת תוחם על המודל.
טבלה 5, מפורטים הסתננות ניסיוני והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה. ניתן לראות מגמה עבור רוב הדגמים עם HaCaT, אשר מקדמים הסתננות/דיפוזיה נמוך לעומת הדגמים ללא HaCaT. השגיאה המוחלטת של מקדמי הסתננות היא 10.9-24.4%, עבור דיפוזיה המקדמים של 5.2% - 12.9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> איור 1: מבט צד של הניסוי חדירות קרום הוספת מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> איור 2: גרף למופת של ניסוי חדירות. הריכוז של מקבל מותווים לאורך זמן. שני קווים מקווקווים סוגר את החלק כמעט ליניארית של הגרף. השיפוע של החלק הליניארי משמש לקביעת המקדם חדירות. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> איור 3: גיאומטריה ורשתות של הקרום להוסיף מערכת סימולציה. מערכת הוספה () גאומטריה של קרום 96-ובכן. מערכת הוספה (b) גאומטריה של קרום 12-. טוב. (ג) רשת של קרום 96-ובכן הוספה מערכת. מערכת הוספה (d) רשת של קרום 12-. טוב. (e) חתך ופרמטרים של הקרום להוסיף מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> איור 4: השוואה של נתונים ניסיוני של ניסוי הסתננות אל הסימולציה ממוטבת. מלח נתרן () fluorescein (b) fluorescein isothiocyanate-לתוספי 4,000 מול wt., (ג) 10,000 מול wt., wt. mol (d) 20,000, (e) 40,000 מול wt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> איור 5: נציג הוא מכתים של מודל תא קולגן (קולגן + Fibroblasts + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> איור 6: חדירות מקדם כפונקציה של רדיוס 1/סטוקס באמצעות מלח נתרן fluorescein ו- fluorescein isothiocyanate-לתוספי בקרום 96-ובכן להוסיף מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>Experession עבור מערכת טוב 96 מ מ</td>
			<td>Experssion 12-ובכן מערכת במ מ</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [מ מ]</td>
			<td>14.7 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של הבאר</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [מ מ]</td>
			<td>12.1 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של קרום</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [מ מ]</td>
			<td>21.97 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [מ מ]</td>
			<td>2 [מ מ]</td>
			<td>הי של המכשול</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [מ מ]</td>
			<td>1 [מ מ]</td>
			<td>המרחק בין טוב והתחתונים</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [מ מ]</td>
			<td>5.24 [מ מ]</td>
			<td>גבוהה של מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>עומק טבילה</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>רדיוס הכדור טבילה+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-מיקום של הכדור טבילה+
</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: גאומטריה פרמטרים עבור הסימולציה "תעבורה מינים כימי". + רק כדי לשמש עבור הסימולציה של agarose ג'ל בקרום טוב 96 להוסיף מערכת.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>הביטוי</td>
			<td>ערך</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.26576/m2
</td>
			<td>ריכוז של Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.5/m2</td>
			<td>ריכוז FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.2/m2</td>
			<td>ריכוז FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 מול/m2</td>
			<td>ריכוז FD-20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.05/m2</td>
			<td>ריכוז FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>/S21E - 9 מטר</td>
			<td>מקדם דיפוזיה של ערבוב מים</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פרמטרים פיזיים להדמיה "תעבורה מינים כימי".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>הביטוי</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>ההגדרה של ריכוז מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>שינוי פקטור D</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: פרמטרים עבור הסימולציה "אופטימיזציה".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>לחדור</td>
			<td>חדירות מקדם (m/s) x 10-8</td>
			<td>מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10</td>
			<td>סטוקס הרדיוס של permeate (ז) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4,000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20,000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40,000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 4: מקדם פרמאביליות, דיפוזיה של חומרים עם רדיוס שונה סטוקס דרך 2% Agarose ג'ל + ממברנה ב 96-ובכן קרום להוסיף מערכת. (מלח נתרן fluorescein = פעל אז, לתוספי fitc = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מודל</td>
			<td>חדירות מקדם (m/s) x 10-8</td>
			<td>מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + F.</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + H.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + פ + H.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: מקדם חדירות ובהפצה של מלח נתרן fluorescein באמצעות מודל תא קולגן גם עם 12-ממברנה טוב להוסיף מערכת (אל"מ = קולגן, פ = פיברובלסט, ה = HaCaT).

שיטה לקביעת חדירות קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב, סיליקו פרמטר אופטימיזציה עבור החישוב של מקדמים דיפוזיה באמצעות סימולציה מוצגים.

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע את מקדמי החדירות והדיפוזיה של מודלים תלת מימדיים של עור במערכת הכנסת ממברנה קטנה. עניינים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הנדסת רקמות עור תלת מימדיות ליישומים פרמצבטיים וקוסמטיים שבהם החדירות ומקדם הדיפוזיה הם גורמי איכות חיוניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של מקדמים אלה בתוך הכנסה מרובת בארות קטנה.ניתן לשנות עוד יותר את מערכת הכנסת הממברנה הקטנה בסימולציה לשימוש באיבר במכשירי הספינה ויישומים אחרים המשתמשים במערכות הכנסת ממברנה. להכנת ג'ל אגרוז, התחל במריחת 28.6 מיקרוליטר של ג'ל אגרוז נוזלי טרי של 80 מעלות צלזיוס על כל ממברנה של מערכת שיבוץ ממברנה של 96 בארות. לאחר 10 דקות, הג'ל יתמצק וניתן להשתמש בו לבדיקת חדירות.להכנת דגם תאי קולגן, יש לערבב תחילה 125 מיקרוליטר של HBSS ומיליליטר אחד של תמיסת קולגן R על קרח ואחריו נטרול עם נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן הוסף 125 מיקרוליטר של פיברובלסטים ראשוניים תלויים במדיום שלם לתערובת. והוסף 28.6 מיקרוליטר מתמיסת התא המתקבלת לכל באר של מערכת שיבוץ ממברנה חדשה של 96 בארות.לאחר 30 דקות בחממת תרבית תאים, הוסף 75 מיקרוליטר של מדיום שלם על פני הג'ל ו -300 מיקרוליטר של מדיום שלם לתחתית כל באר לדגירה של לילה בחממת תרבית התאים. למחרת, החליפו את המדיום ב-75 מיקרוליטר של קרטינוציטים בוגרים נמוכים בסידן ובטמפרטורה גבוהה לכל דגם של תאי קולגן והחזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך שלושה ימים נוספים. ביום הרביעי יש לשאוב את המדיום מפני השטח של מודל התא ולהחזיר את הצלחת לחממה למשך שבעה ימים נוספים.כדי לבצע בדיקת חדירות, הוצא 75 מיקרוליטר של חומר תורם למערכת מודל הכנסת באר קטנה מעניינת והוסף 300 מיקרוליטר של חומר מקבל לתחתית כל באר. הנח את הצלחת על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95 אחוזי לחות וכ-480 סל"ד למשך חמש שעות, העביר את מערכת הכנסת הממברנה פעם בשעה לצלחת ריקה של 96 בארות ומדוד את הקרינה המפוזרת בתוך הבארות התחתונות של צלחת הניסוי על קורא צלחות. בתום ניסוי החדירות, פתח את תוכנת המידול המתאימה והתחל מודל חדש.בחר אשף המודלים ומודל תלת-ממד. הוסף הובלה של מינים מדוללים ולחץ על מחקר. לאחר מכן בחר תלוי זמן ולחץ על סיום.תחת הגדרות גלובליות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוסיף פרמטרים ולהזין את הפרמטרים הגיאומטריים והפיזיים לרשת. הגדר את הגיאומטריה של מערכת הכנסת הממברנה מהניסויים, ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות כדי להוסיף שתי בדיקות תחום, ובחר בדיקה אחת כתחום המקבל והשנייה כתחום התורם. הגדר את שני התחומים לממוצע עם ביטוי C ויחידת מול למטר מעוקב.ולהגדיר את מקדם הדיפוזיה תחת תכונות הובלה אחת והובלה של מינים מדוללים. לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף מאפיין הובלה שני שניים ובחר את המחסום השני בבחירת הדומיין. תחת הובלה של מינים מדוללים, עבור ערכים התחלתיים אחד, הגדר את הריכוז כאפס.לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף ערך התחלתי שני שניים ובחר את התורם כתחום השלישי. הגדר את הריכוז כריכוז ההתחלתי של החומר התורם הפלואורסצנטי. לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף סימטריה אחת ובחר את כל המשטחים של בחירת הגבול המשקפים את כל הגיאומטריה.לחץ לחיצה ימנית על הרשת כדי להוסיף שני טטרהדרלים חופשיים ולהגדיר את המחסום השני כתחום. לחץ לחיצה ימנית על הטטרהדרלי החינמי כדי להוסיף את גודל הרשת המוגדרת מראש לעדינה במיוחד. בטטרהדרל החופשי השני, הגדר את המקבל והתורם כתחומים ואת הרשת המוגדרת מראש לעדינה יותר.לאחר מכן, תחת מחקר ראשון, לחץ על מחשוב כדי להתחיל את הסימולציה. כדי להתאים את מקדם הדיפוזיה לנתונים שנוצרו על ידי סימולציית הדיפוזיה, פתח את תפריט הוסף נפשי ובחר מתמטיקה. אתר אופטימיזציה ורגישות.בחר מיטוב ולחץ על הוסף לרכיב. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על הגדרות כדי להוסיף משתנים ולהזין ידנית את המשתנים מטבלה שלוש. לאחר מכן, תחת תפריט צימוד הרכיבים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות, הוסף ממוצע ואחריו הוספה ידנית של המקבל כשם המפעיל ובחר דומיין אחד.ייצא את נתוני הניסוי למסמך טקסט חדש. השתמש בנקודה-פסיק כדי להפריד את הנתונים לעמודות ובמעבר שורה כדי להפריד את הנתונים לשורות. לחץ לחיצה ימנית על אופטימיזציה כדי להוסיף את המטרה הגלובלית של הריבועים הפחותים ולצרף את מסמך הטקסט לנתוני הניסוי.לחץ על המטרה הריבועים הפחותים הכלליים כדי להגדיר את העמודה הראשונה כעמודת זמן אחת ואת העמודה השניה כעמודת ערך אחת. בעמודה ביטוי ערך, הזן את המשתנה C.לחץ לחיצה ימנית על אופטימיזציה כדי להוסיף משתני בקרה גלובליים אחד. והכריז על חיפוש קו תחתון D כמשתנה עם ערך התחלתי של 1, גבול תחתון של אפס וגבול עליון של 1,000.לחץ לחיצה ימנית על מחקר אחד כדי להוסיף אופטימיזציה. ובחר SNOPT כשיטת פותר אופטימיזציה. הגדר את סובלנות האופטימליות ל-1 בחזקת מינוס שמונה.לאחר מכן הגדר את מקדם הדיפוזיה על המחסום ל-D.הגדר את זמן הסימולציה תחת הגדרת המחקר מאפס שניות ל-22,000 שניות במרווח של 100 שניות ולחץ על מחשוב כדי להתחיל באופטימיזציה של הפרמטר. ניתוח היסטולוגי של מודל תאי קולגן מגלה צביעה קלה של הפיברובלסטים בתוך המטריצה המרכזית. בחלק העליון של מטריצת הקולגן, ניתן להבחין בשכבה המכילה גרעינים רבים המורכבים ככל הנראה מקרטינוציטים בוגרים בעלי סידן נמוך וטמפרטורה גבוהה.שימוש במלח נתרן פלואורסצאין ודקסטרן פלואורסצאין איזותיוציאנט מאמתים את ההשפעה של הגודל המולקולרי של החומר המפזר מגלה כי עבור גדלים מולקולריים קטנים, הסימולציה ונתוני הניסוי תואמים היטב עבור שתי המולקולות. עם זאת, גדלים מולקולריים גדולים יותר מייצרים סטיות גבוהות יותר בהתקדמות העקומה בסימולציות, מה שמדגים עיכוב בהתחלה ועלייה חזקה יותר במהלך המאוחר יותר של הגרפים. ואכן, מקדם החדירה יורד ככל שהגודל המולקולרי גדל כאשר המקדמים המדומים מתנהגים באופן דומה למקדמי החדירות הניסיוניים.יש לציין כי לרוב המודלים המשתמשים בקרטינוציטים בוגרים נמוכים בסידן ובטמפרטורה גבוהה יש מקדמי חדירה ודיפוזיה נמוכים יותר בהשוואה למודלים ללא קרטינוציטים בוגרים נמוכי סידן וטמפרטורה גבוהה. ניתן לקבוע את מודל הקולגן תוך 11 עד 12 יום וניתן להשלים את מדידת החלחול תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע ההליך, חשוב לשמור על תנאי הגבול כמו הטמפרטורה, נפח המילוי, ריכוז החומר המיושם, הלחות ותהליך הממברנה קבועים על מנת להפחית את השונות של מקדם החלחול.בעזרת סימולציית מודול זו ניתן להפחית את המאמץ הניסויי ולחזות את הביצועים ארוכי הטווח. ניתן להתאים אותו גם למכשירי חדירה אחרים או למערכות בעלות על איברים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום היישומים התרופתיים והקוסמטיים כמו גם פיתוח אינטראקציה בהנדסת רקמות כדי לחקור את תהליכי חדירת הדיפוזיה ברקמות מלאכותיות.

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

סרטון זה מדגים שיטה לחקר חלחול באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה (BBB) באמצעות אסטרוציטים ותאי אנדותל על גבי ממברנה, עם פריטין חופשי מסוג FITC ו-FITC. FITC-פריטין נקשר לקולטנים על תאי אנדותל וחצה את מחסום הממברנה לחדר התחתון בעוד FITC חופשי הראה חדירה מוגבלת ונשאר בחדר העליון.

חקר החדירה של FITC ו- FITC-Ferritin באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

כאן, שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדירה מבוסס כנס כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן מופרש המיוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים מתוארת. מערכת זו יכולה בקלות להיות מיושמת בחקר חלבונים חיידקיים מופרשים אחרים על סוגי תא מארח שונים במהלך הדבקה.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

מחסום הדם-מוח האנושי באופן סלקטיבי מונע חדירה של מולקולות הידרופילית ופתוגנים לתוך המוח. מספר פתווגיות, כולל דלקת קרום המוח והזיות פוסט-אופרטיביות, קשורות לחדירות מוגברות של מחסום הדם-מוחי. כאן, אנו מתארים מודל של התרבות התא האנדותל כדי לבדוק את חדירות המכשול על ידי החציית מחיידקים.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

פרוטוקול זה מציג מודל ביומימטי תלת מימדי עם תא סטרומה פיברוטית נלווית. מוכן עם הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ביחסים המחקים את התכונות הביו-פיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית הסטרומלית, מתווך פעיל של אינטראקציות תאיות, צמיחת גידולים וגרורות.

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

חקור שיטה חישובית לקביעת מקדמי חדירות ודיפוזיה במודלים תלת-ממדיים של עור באמצעות מערכת ממברנות קטנה. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה ואופטימיזציה של סימולציות ליישומים בפרמצבטיקה וקוסמטיקה.

שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

גלה סרטונים נוספים