שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע את מקדמי החדירות והדיפוזיה של מודלים תלת מימדיים של עור במערכת הכנסת ממברנה קטנה. עניינים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הנדסת רקמות עור תלת מימדיות ליישומים פרמצבטיים וקוסמטיים שבהם החדירות ומקדם הדיפוזיה הם גורמי איכות חיוניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של מקדמים אלה בתוך הכנסה מרובת בארות קטנה.

ניתן לשנות עוד יותר את מערכת הכנסת הממברנה הקטנה בסימולציה לשימוש באיבר במכשירי הספינה ויישומים אחרים המשתמשים במערכות הכנסת ממברנה. להכנת ג'ל אגרוז, התחל במריחת 28.6 מיקרוליטר של ג'ל אגרוז נוזלי טרי של 80 מעלות צלזיוס על כל ממברנה של מערכת שיבוץ ממברנה של 96 בארות. לאחר 10 דקות, הג'ל יתמצק וניתן להשתמש בו לבדיקת חדירות.

להכנת דגם תאי קולגן, יש לערבב תחילה 125 מיקרוליטר של HBSS ומיליליטר אחד של תמיסת קולגן R על קרח ואחריו נטרול עם נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן הוסף 125 מיקרוליטר של פיברובלסטים ראשוניים תלויים במדיום שלם לתערובת. והוסף 28.6 מיקרוליטר מתמיסת התא המתקבלת לכל באר של מערכת שיבוץ ממברנה חדשה של 96 בארות.

לאחר 30 דקות בחממת תרבית תאים, הוסף 75 מיקרוליטר של מדיום שלם על פני הג'ל ו -300 מיקרוליטר של מדיום שלם לתחתית כל באר לדגירה של לילה בחממת תרבית התאים. למחרת, החליפו את המדיום ב-75 מיקרוליטר של קרטינוציטים בוגרים נמוכים בסידן ובטמפרטורה גבוהה לכל דגם של תאי קולגן והחזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך שלושה ימים נוספים. ביום הרביעי יש לשאוב את המדיום מפני השטח של מודל התא ולהחזיר את הצלחת לחממה למשך שבעה ימים נוספים.

כדי לבצע בדיקת חדירות, הוצא 75 מיקרוליטר של חומר תורם למערכת מודל הכנסת באר קטנה מעניינת והוסף 300 מיקרוליטר של חומר מקבל לתחתית כל באר. הנח את הצלחת על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95 אחוזי לחות וכ-480 סל"ד למשך חמש שעות, העביר את מערכת הכנסת הממברנה פעם בשעה לצלחת ריקה של 96 בארות ומדוד את הקרינה המפוזרת בתוך הבארות התחתונות של צלחת הניסוי על קורא צלחות. בתום ניסוי החדירות, פתח את תוכנת המידול המתאימה והתחל מודל חדש.

בחר אשף המודלים ומודל תלת-ממד. הוסף הובלה של מינים מדוללים ולחץ על מחקר. לאחר מכן בחר תלוי זמן ולחץ על סיום.

תחת הגדרות גלובליות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוסיף פרמטרים ולהזין את הפרמטרים הגיאומטריים והפיזיים לרשת. הגדר את הגיאומטריה של מערכת הכנסת הממברנה מהניסויים, ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות כדי להוסיף שתי בדיקות תחום, ובחר בדיקה אחת כתחום המקבל והשנייה כתחום התורם. הגדר את שני התחומים לממוצע עם ביטוי C ויחידת מול למטר מעוקב.

ולהגדיר את מקדם הדיפוזיה תחת תכונות הובלה אחת והובלה של מינים מדוללים. לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף מאפיין הובלה שני שניים ובחר את המחסום השני בבחירת הדומיין. תחת הובלה של מינים מדוללים, עבור ערכים התחלתיים אחד, הגדר את הריכוז כאפס.

לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף ערך התחלתי שני שניים ובחר את התורם כתחום השלישי. הגדר את הריכוז כריכוז ההתחלתי של החומר התורם הפלואורסצנטי. לחץ לחיצה ימנית על הובלה של מינים מדוללים כדי להוסיף סימטריה אחת ובחר את כל המשטחים של בחירת הגבול המשקפים את כל הגיאומטריה.

לחץ לחיצה ימנית על הרשת כדי להוסיף שני טטרהדרלים חופשיים ולהגדיר את המחסום השני כתחום. לחץ לחיצה ימנית על הטטרהדרלי החינמי כדי להוסיף את גודל הרשת המוגדרת מראש לעדינה במיוחד. בטטרהדרל החופשי השני, הגדר את המקבל והתורם כתחומים ואת הרשת המוגדרת מראש לעדינה יותר.

לאחר מכן, תחת מחקר ראשון, לחץ על מחשוב כדי להתחיל את הסימולציה. כדי להתאים את מקדם הדיפוזיה לנתונים שנוצרו על ידי סימולציית הדיפוזיה, פתח את תפריט הוסף נפשי ובחר מתמטיקה. אתר אופטימיזציה ורגישות.

בחר מיטוב ולחץ על הוסף לרכיב. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על הגדרות כדי להוסיף משתנים ולהזין ידנית את המשתנים מטבלה שלוש. לאחר מכן, תחת תפריט צימוד הרכיבים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות, הוסף ממוצע ואחריו הוספה ידנית של המקבל כשם המפעיל ובחר דומיין אחד.

ייצא את נתוני הניסוי למסמך טקסט חדש. השתמש בנקודה-פסיק כדי להפריד את הנתונים לעמודות ובמעבר שורה כדי להפריד את הנתונים לשורות. לחץ לחיצה ימנית על אופטימיזציה כדי להוסיף את המטרה הגלובלית של הריבועים הפחותים ולצרף את מסמך הטקסט לנתוני הניסוי.

לחץ על המטרה הריבועים הפחותים הכלליים כדי להגדיר את העמודה הראשונה כעמודת זמן אחת ואת העמודה השניה כעמודת ערך אחת. בעמודה ביטוי ערך, הזן את המשתנה C.לחץ לחיצה ימנית על אופטימיזציה כדי להוסיף משתני בקרה גלובליים אחד. והכריז על חיפוש קו תחתון D כמשתנה עם ערך התחלתי של 1, גבול תחתון של אפס וגבול עליון של 1,000.

לחץ לחיצה ימנית על מחקר אחד כדי להוסיף אופטימיזציה. ובחר SNOPT כשיטת פותר אופטימיזציה. הגדר את סובלנות האופטימליות ל-1 בחזקת מינוס שמונה.

לאחר מכן הגדר את מקדם הדיפוזיה על המחסום ל-D.הגדר את זמן הסימולציה תחת הגדרת המחקר מאפס שניות ל-22,000 שניות במרווח של 100 שניות ולחץ על מחשוב כדי להתחיל באופטימיזציה של הפרמטר. ניתוח היסטולוגי של מודל תאי קולגן מגלה צביעה קלה של הפיברובלסטים בתוך המטריצה המרכזית. בחלק העליון של מטריצת הקולגן, ניתן להבחין בשכבה המכילה גרעינים רבים המורכבים ככל הנראה מקרטינוציטים בוגרים בעלי סידן נמוך וטמפרטורה גבוהה.

שימוש במלח נתרן פלואורסצאין ודקסטרן פלואורסצאין איזותיוציאנט מאמתים את ההשפעה של הגודל המולקולרי של החומר המפזר מגלה כי עבור גדלים מולקולריים קטנים, הסימולציה ונתוני הניסוי תואמים היטב עבור שתי המולקולות. עם זאת, גדלים מולקולריים גדולים יותר מייצרים סטיות גבוהות יותר בהתקדמות העקומה בסימולציות, מה שמדגים עיכוב בהתחלה ועלייה חזקה יותר במהלך המאוחר יותר של הגרפים. ואכן, מקדם החדירה יורד ככל שהגודל המולקולרי גדל כאשר המקדמים המדומים מתנהגים באופן דומה למקדמי החדירות הניסיוניים.

יש לציין כי לרוב המודלים המשתמשים בקרטינוציטים בוגרים נמוכים בסידן ובטמפרטורה גבוהה יש מקדמי חדירה ודיפוזיה נמוכים יותר בהשוואה למודלים ללא קרטינוציטים בוגרים נמוכי סידן וטמפרטורה גבוהה. ניתן לקבוע את מודל הקולגן תוך 11 עד 12 יום וניתן להשלים את מדידת החלחול תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע ההליך, חשוב לשמור על תנאי הגבול כמו הטמפרטורה, נפח המילוי, ריכוז החומר המיושם, הלחות ותהליך הממברנה קבועים על מנת להפחית את השונות של מקדם החלחול.

בעזרת סימולציית מודול זו ניתן להפחית את המאמץ הניסויי ולחזות את הביצועים ארוכי הטווח. ניתן להתאים אותו גם למכשירי חדירה אחרים או למערכות בעלות על איברים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום היישומים התרופתיים והקוסמטיים כמו גם פיתוח אינטראקציה בהנדסת רקמות כדי לחקור את תהליכי חדירת הדיפוזיה ברקמות מלאכותיות.