פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת של תרבית תאים משולבת (co-culture) משני סוגי תאים באמצעות תבניות (inserts) בעלות ממברנה חדירה, ובכך לאפשר דיפוזיה של גורמים ממיסים מופרשים. דבר זה מושג באמצעות סדרת שלבים שבהם ממוקמות במדויק תבניות המכילות סוג תא אחד בתוך פלטת תרבית רקמות בעלת בארות מרובות המכילה סוג תא שני. אנו מתחילים בזריעת סוג תא מספר אחת בתוך התבניות, ובזריעת סוג תא מספר שתיים בפלטת תרבית הרקמות בעלת הבארות המרובות.

השלב השני הוא להעביר את התאים (inserts) אל בארות הפלטה המכילה את סוג התא השני. בסופו של דבר, הדבר מאפשר לאסוף את שני סוגי התאים ואת תעלילי העל (supernatants) המתאימים להם. לפיכך, ניתן להעריך את השפעתם של גורמים מסיסים מופרשים על סוג התא הנחקר.

באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים מוקרטים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פראקריני. לפיכך, ערכו של מערכת שיתוף-תרבית עם מקטעים (insert co-culture system) טמון ביכולתה להציע דרך מקורית להערכת שינויים בפרמטרים תאיים המתווכים על ידי גורמים מסיסים מוקרטים, בהיעדר מגע בין תאים. מערכות שיתוף-תרבית עם מקטעים מציעות יתרונות שונים על פני טכניקות שיתוף-תרבית אחרות, כגון: ראשית, איתות חד-כיווני; שנית, שימור של קוטביות תאית; ושלישית, זיהוי של שינויים תאיים באופן ספציפי לאוכלוסייה.

להלן יפורט פרוטוקול ספציפי למדידת ההשפעות הרעילות של ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה N9 שהופעלה באמצעות ליפו פוליסכריד על תאי עצב PC12, ובכך ייסופק הבנה קונקרטית של מתודולוגיית השתקעויות שיתוף-תרבית (co-culture). ראשית, הוצאו מתוך האריזה את פלטת תרבית הרקמה בעלת 24 הבארים ואת ההשתקעויות (inserts) העשויות פוליטטרהפלואורואתילן בעלות נקבים של 0.4 מיקרון. לאחר מכן, הניחו את ההשתקעויות בתוך הבארים הריקות של פלטת תרבית הרקמה על ידי תפיסת הקצה העליון של ההשתקעות באמצעות פינצטה סטרילית.

בשלב הבא, מלאו את המצעים (inserts) במדיום N9 שגרתי עד שהממברנה תהיה מכוסה לחלוטין. הדגרימו את המצעים למשך שעה אחת לפחות, או למשך הלילה, כדי לשפר את יכולת ההיצמדות של התאים. לאחר שהמצעים מוכנים, בצעו פיצול (split) של מיקרוגליה N9 בהתמלאות (confluence) של 80% עד 90% באמצעות מדיום N9 שגרתי, כדי להשיג תרחיף תאים שישמש לזריעה במצעים.

לאחר מכן, הסירו את מצע השגרה מהמבני (inserts) תוך הקפדה לא לנקב את הממברנה עם טיפ המיקרופיפטה. בהמשך, זרעו בכל מבנה 60,000 תאים לסנטימטר רבוע באמצעות 50 µL של תגלהי התאים, או בהתאם לפרוטוקול של יצרן המבנים. בזמן חלוקת תגלהי התאים, ודאו שהתמיסה נותרת הומוגנית על ידי היפוך מזדמן של המבחנה.

לאחר זריעת כל ההכנסות (inserts), נדנדו בעדינות את הפלטה קדימה ואחורה, ולאחר מכן משמאל לימין, כדי להפיץ את התאים באופן שווה. הימנעו מתנועות סיבוביות, שכן אלו יגרמו לתאים להצטבר במרכז ההכנסה. לאחר מכן, דגרו את הפלטה המכילה את ההכנסות למשך 24 שעות לפני ההמשך להפעלת מיקרוגליה N9.

התחילו בשקילה של 10 מיליגרם של ליפופוליסכריד ואחסנו אותו בפרוקת Eppendorf בנפח 1.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. מכיוון שליפופוליסכריד הוא אנדוטוקסין פרו-דלקתי חזק הדורש אמצעי בטיחות מיוחדים, מומלץ מאוד להשתמש במשקפי מגן, כפפות ומסננת חלקיקים. לאחר מכן, הכינו סדרת דילולים של ליפופוליסכריד באמצעות מצע טיפול N9 חם כדי לקבל תמיסות עבודה בריכוזים של ארבעה, שניים ואחד מיקרוגרם למילו ליטר.

לבסוף, הסירו מחצית ממצע התרבית מהסרטים (inserts), תוך הקפדה לא להפריע לתאים. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 25 microliters של תמיסות עבודה של lipopolysaccharide לסרטים כדי להגיע לדילול סופי של 2, 1 או 0.5 micrograms per milliliter. דגרו את הפלטה למשך 24 שעות נוספות לפני השלב של ניסויי התרבית המשולבת (co-culture).

שלב זה דורש תאי PC12 שנזרעו בריכוז של 30,000 תאים לסנטימטר רבוע כנוירונים ביניים מובחנים, ותאי מיקרוגליה N9 שהופעלו באמצעות ליפופוליסכריד למשך 24 שעות כפי שמתואר בסעיף הקודם. התחילו בהסרה עדינה של כל המצע מהאינסרטים, והחליפו אותו ב-50 מיקרוליטר של מצע טיפול N9 טרי וחם. פעולה זו נחוצה כדי להסיר את כל השאריות של הליפופוליסכריד, ולהשאיר רק תאי מיקרוגליה N9 מופעלים.

יש לזכור כי המאשרים (inserts) אינם מהודקים לבארים של פלטת תרבית הרקמה ועשויים לזוז אם הפיפטה תילחץ חזק מדי אל הדופן. יש לבצע שלב זה עבור מאשר אחד בכל פעם כדי למנוע מהתאים להתייבש עקב חשיפה ממושכת לאוויר. לאחר מכן, יש להסיר לחלוטין את מצע תרבית תאי ה-PC12 העצביים ולהחליפו ב-0.6 milliliters של מצע טיפול PC12 טרי וחם.

בצעו זאת בבאר אחת בכל פעם כדי להבטיח שהתאים לא יתייבשו. בעזרת פינצטה, אחזו בקצה העליון של אינסרט והניחו אותו בעדינות לתוך הבאר המכילה תאי neuronal PC12. לאחר העברת כל האינסרטים, בדקו אם קיימות בועות אוויר מתחת לממברנות של האינסרטים.

בועיות אוויר ימנעו כל חילוף חומרים דרך ממברנת האינסרט ועלולות לסכן את הניסוי כולו. הסיר כל בועיות אוויר על ידי הרמה עדינה מאוד של האינסרט מהבאר באמצעות פינצטה והחזרתו אל מצע תרבית התאים; פעולה זו אמורה להסיר את מרבית הבועיות. עם זאת, עבור בועיות עקשניות, נסה לטבול את האינסרט בעדינות חזרה אל מצע תרבית התאים בזווית.

אין להקיש או לערבב את המכניסים (inserts), שכן הדבר עלול לגרום להתנתקות של תאים דבקים. לאחר מכן, בדקו את נפח המדדיים הן במכניסים והן בבארים; מפלס הנוזל בשני התאים צריך להיות בערך באותה רמה. כאשר כל בועות האוויר הוסרו ונפחי המדדיים מתאימים, הכניסו את הפלטה לדגירה.

ניתן לאחר מכן לאסוף את התאים, את מצע התרבית, או את שניהם, כדי למדוד את השפעות האיתות הפראקריני בין תאי המיקרוגליה N9 לבין תאי העצבים PC12. בדיקות ELISA בוצעו על מצע תרבית התאים של המדור התחתון כדי לכמת ציטוקינים פרו-דלקתיים. התוצאות ממחישות כי 24 שעות לאחר תקופת ההפעלה, תאי מיקרוגליה N9 שטופלו ב-2 µg/mL של lipopolysaccharide הפרשו כמות גדולה משמעותית של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha ו-interferon gamma, בהשוואה לתאי מיקרוגליה שלא טופלו.

בנוסף, מיקרוגליה מסוג N9 שטופלה ב-1 µg/mL של ליפופוליסכריד הפרשה באופן מובהק יותר interferon gamma לאחר 24 שעות, בעוד שנדרשו 48 שעות כדי לראות עלייה משמעותית ברמות של interleukin-6 ו-tumor necrosis factor-alpha במדיום התרבית. לעומת זאת, התנאי של 0.5 µg/mL לא הוביל להגברת ביטוי הציטוקינים במיקרוגליה מסוג N9 הן ב-24 והן ב-48 שעות לאחר תקופת ההפעלה. יתרה מכך, הנתונים בנקודת זמן של 24 שעות בקבוצת ה-2 µg/mL מרמזים על התרחשות מיקרוגליוזיס, שהיא עלייה באוכלוסיית המיקרוגליה.

עם זאת, רק לאחר 48 שעות חל wzrost משמעותי במספר התאים. לבסוף, על מנת להעריך את השלכותיה של הפעלת המיקרוגליה המובילה להגברת הפרשת ציטוקינים ולמיקרוגליאוזיס, נבחנה הציטוטוקסיות בתאי עצבים PC12 בתרבית משותפת. על ידי מדידת רמות של Lactate Dehydrogenase חוץ-תאי, המשוחרר על ידי תאים פגועים, נמצא כי תאי עצבים PC12 מראים רמות גבוהות יותר של מוות תאי ככל שריכוז ה-lipopolysaccharide על תאי ה-N9 עלה.

כך, תוצאות אלו מראות כי גורמים מסיסים מופרשים מסוגלים לעבור דרך ממбраנת המכניסים של התרבית המשולבת (co-culture inserts), ויכולים לגרום לנזק ציטוטוקסי לתאי PC12 נוירונליים בהיעדר מגע בין תאים. למרות שהוצג כאן תרחיש אחד בלבד של תרבית משולבת באמצעות מכניסים, זוהי טכניקה גמישה מאוד. בפרוטוקול זה, סוג תא אחד טופל מראש במולקולה האחראית להפחתת הפרשתם של גורמים מסיסים אשר, עם העברת המכניס לבאר, משפיעים על התנהגותו של סוג תא שני.

עם זאת, ניתן להדגיר את שני סוגי התאים יחד במערכת של תרבית משולבת (co-culture) כדי לזהות חולשה מוגברת, או עמידות, של אחת או שתי אוכלוסיות התאים לטיפול מאוחר יותר. טכניקה זו יכולה פשוטת להשתמש בשתי אוכלוסיות של תאים המודגירות יחד ללא כל טיפול, כדי להעריך, למשל, את השיגנול הפראקריני ההדדי הבסיסי. בנוסף לערכה בתחום הנוירו-דלקת כפי שהודגם כאן, ניתן להשתמש במערכות תרבית משולבת כדי לענות על מגוון רחב של שאלות הנוגעות להתחדשות גידולים, נוירו-לתרסיזמה, שיגנול של אפופטוזיס, או כל נושא אחר הכולל מרכיב של שיגנול פראקריני.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מערכות של cultivos-משותפים במסננת (insert co-culture systems) יכולות להוות דרך פשוטה להערכת שינויים המתווכים על ידי גורמים מסיסים מופרשים. אנו מקווים שהצלחנו לשכנע אתכם בפוטנציאל הגבוה של מערכות co-culture אלו במחקר של סיגנלינג פראקריני רב-תאי בהיעדר מגע בין תאים.