פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מערכת תרבית משותפת תאית של שני סוגי תאים באמצעות תוספות עם קרום חדיר, ובכך לאפשר דיפוזיה של גורמים מסיסים המופרשים. זה מושג באמצעות סדרה של שלבים שהניחו תוספות עדינות המכילות סוג תא אחד בצלחת תרבית רקמה מרובת בארות המכילה סוג תא שני. אנו מתחילים את סוג תא הזריעה שלי מספר אחת בתוספות, ואת סוג תא הזריעה מספר שתיים בצלחת תרבית רקמות מרובת בארות.

השלב השני הוא העברת התוספות לבארות הצלחת המכילה תא מסוג מספר שתיים. בסופו של דבר, זה נותן את היכולת לקצור את שני סוגי התאים כמו גם את הסופרנטנטים המתאימים. לכן, ניתן להעריך את ההשפעה של גורמים מסיסים המופרשים על סוג התא המעניין.

באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים המופרשים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פרקריני. ככזה, הערך של מערכת תרבית משותפת טמון ביכולתה להציע דרך מקורית להעריך את השינויים בפרמטרים תאיים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים בהיעדר מגע תא-תא. מערכות הכנסת תרבית משותפת מציעות יתרונות שונים על פני טכניקות אחרות של קו-תרבות, כגון: אחת על ידי איתות כיווני; שתי קוטביות תאים שמורה; ושלושה זיהוי ספציפי לאוכלוסייה של שינויים תאיים.

פרוטוקול ספציפי למדידת ההשפעות הרעילות של ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה N9 המופעלת על ידי ליפופוליסכריד על תאי PC12 עצביים יפורט להלן, ובכך יספק הבנה קונקרטית של מתודולוגיית תרבית משותפת. כדי להתחיל, פרקו את צלחת תרבית הרקמה בת 24 הבארות ואת תוספות הפוליטטרפלואורואתילן בגודל 0.4 מיקרון מאריזתן. לאחר מכן, הנח את התוספות בבארות הריקות של צלחת תרבית הרקמות על ידי אחיזה בקצה העליון של התוספת באמצעות פינצטה סטרילית.

לאחר מכן, מלאו את התוספות במדיום N9 שגרתי עד שהקרום מכוסה לחלוטין. דגרו על התוספות למשך שעה לפחות, או למשך הלילה, כדי לשפר את יכולת החיבור של התאים. לאחר שהתוספות מוכנות, פצלו את המיקרוגליה N9 במפגש של 80 עד 90% באמצעות מדיום N9 שגרתי כדי לקבל תרחיף תאים שישמש לזריעת התוספות.

לאחר מכן, הסר את המדיום השגרתי מהתוספות תוך הקפדה לא לנקב את הממברנה עם קצה המיקרופיפטה. לאחר מכן, זרעו כל תוספת ב-60,000 תאים לסנטימטר רבוע עם 50 מיקרוליטר של תרחיף התא, או לפי פרוטוקול יצרן התוספת. בזמן הפצת תרחיף התאים, ודא שהוא יישאר הומוגני על ידי היפוך הצינור מדי פעם.

כאשר כל התוספות נזרעות, נדנדו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה, ואז משמאל לימין, על מנת לפזר את התאים באופן שווה. הימנע מביצוע תנועות מעגליות מכיוון שהדבר יגרום לתאים להצטבר במרכז התוספת. לאחר מכן, דגרו את הצלחת המכילה את התוספות למשך 24 שעות לפני שתמשיכו עם הפעלת N9 microglia.

התחל בשקילה של 10 מיליגרם של ליפופוליסכריד ואחסן אותו בשפופרת אפנדורף של 1.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. מכיוון שליפופוליסכריד הוא אנדוטוקסין פרו-דלקתי חזק ודורש אמצעי זהירות מיוחדים, מומלץ מאוד להשתמש במשקפיים, כפפות ומכונת הנשמה חלקיקית. לאחר מכן, צור קבוצה של דילולים סדרתיים של ליפופוליסכריד באמצעות מדיום טיפול חם N9 כדי להשיג פתרונות עבודה של ארבעה, שניים ואחד מיקרוגרם למיליליטר.

לבסוף, הסר מחצית ממדיום התרבות מהתוספות, הקפד לא להפריע לתאים. לאחר מכן, הוסף בעדינות 25 מיקרוליטר של תמיסות העבודה של הליפופוליסכריד לתוספות כדי להניב דילולים סופיים של שניים, אחד או 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות נוספות לפני שתמשיכו בניסויי התרבות המשותפת.

שלב זה דורש תאי PC12 מצופים ב-30,000 תאים לסנטימטר רבוע אינטרנוירונים מובחנים, ו-N9 microglia מופעל עם ליפופוליסכריד למשך 24 שעות כמתואר בסעיף הקודם. התחל בהסרה עדינה של כל המדיום מהתוספות, ובהחלפתו ב-50 מיקרוליטר של מדיום טיפול N9 טרי וחם. זה הכרחי כדי להסיר את כל עקבות הליפופוליסכריד, ולהשאיר רק מיקרוגליה N9 מופעלת.

זכור כי התוספות רופפות בבארות של צלחת תרבית הרקמות ועלולות לנוע אם הקצה נלחץ חזק מדי על הקיר. שלב זה צריך להתבצע בתוספת אחת בכל פעם על מנת למנוע התייבשות התאים עקב מגע ממושך עם האוויר. לאחר מכן הסר את מדיום התא העצבי PC12 לחלוטין והחלף אותו ב-0.6 מיליליטר של מדיום טיפול PC12 טרי וחם.

עשו זאת היטב אחד בכל פעם כדי להבטיח שהתאים לא יתייבשו. בעזרת פינצטה, אחזו בקצה העליון של התוספת והניחו אותה בעדינות לתוך הבאר המכילה תאי PC12 עצביים. כאשר כל התוספות מועברות, בדוק אם יש בועות אוויר מתחת לממברנות התוספות.

בועות אוויר ימנעו כל החלפה על פני קרום התוסף ועלולות לסכן את הניסוי כולו. הסר בועות אוויר על ידי הרמת התוספת מהבאר בעדינות רבה באמצעות פינצטה והחזרתו למדיום תרבית התאים, פעולה זו אמורה להיפטר מרוב הבועות. עם זאת, עבור בועות מתמשכות נסה לטבול בעדינות את התוספת בחזרה למדיום תרבית התא בזווית.

אין לדפוק או לערבב תוספות, מכיוון שיש לכך נטייה לגרום לדיסוציאציה של תאים דבקים. לאחר מכן, בדוק את נפחי המדיה הן בתוספות והן בבארות, הנוזל בשני התאים צריך להיות בערך באותה רמה. כאשר כל בועות האוויר מוסרות, ונפחי המדיה מתאימים, דגרו את הצלחת.

לאחר מכן ניתן לקצור את התאים, מדיום התרבית, או שניהם, כדי למדוד את ההשפעות של איתות פרקריני בין תאי המיקרוגליה N9 לתאי PC12 העצביים. בדיקות אימונוסורבנט מקושרות לאנזים בוצעו על מדיום תרבית התאים של התא התחתון כדי לכמת ציטוקינים פרו-דלקתיים. התוצאות ממחישות כי 24 שעות לאחר תקופת ההפעלה, מיקרוגליה N9 שטופלה בשני מיקרוגרם למיליליטר של ליפופוליסכריד הפרישה באופן משמעותי יותר ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון אינטרלוקן-6, גורם נמק גידול-אלפא ואינטרפרון גמא, בהשוואה למיקרוגליה שלא טופלו.

בנוסף, מיקרוגליה N9 שטופלה במיקרוגרם אחד למיליליטר של ליפופוליסכריד הפרישה באופן נקודתי יותר אינטרפרון גמא לאחר 24 שעות, בעוד שלקח 48 שעות לראות עלייה משמעותית ברמות המדיום התאי של אינטרלוקן-6 וגורם נמק גידול-אלפא. לעומת זאת, המצב של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר לא הצליח לשפר את ביטוי הציטוקינים במיקרוגליה N9 הן ב-24 והן ב-48 שעות לאחר תקופת ההפעלה. יתר על כן, הנתונים ב-24 שעות בקבוצת שני מיקרוגרם למיליליטר מצביעים על כך שהייתה מיקרוגלוזיס, עלייה באוכלוסיית המיקרוגליה.

עם זאת, רק לאחר 48 שעות הוגדל המספר הסלולרי באופן משמעותי. לבסוף, על מנת להעריך את ההשלכות של הפעלת מיקרוגליה המובילה להפרשת ציטוקינים מוגברת ומיקרוגליוזוס, הוערכה ציטוטוקסיות בתאי PC12 עצביים בתרבית משותפת. על ידי מדידת רמות הלקטט דהידרוגנאז החוץ-תאי, המשתחרר על ידי תאים פגומים, נמצא כי תאי PC12 עצביים מציגים יותר מוות תאי ככל שריכוז הליפופוליסכריד בתאי ה-N9 עלה.

ככזה, תוצאות אלה מראות כי גורמים מסיסים המופרשים מסוגלים לחצות את הממברנה של תוספות התרבות המשותפת, ויכולים לגרום לנזק ציטוטוקסי לתאי PC12 עצביים בהיעדר מגע בין תא לתא. בעוד שרק תרחיש אחד של תרבית משותפת הוצג כאן, זוהי טכניקה גמישה מאוד. בפרוטוקול זה, סוג תא אחד טופל מראש במולקולה האחראית להפחתת הפרשת גורמים מסיסים אשר עם העברת התוספת לבאר משפיעים על התנהגות סוג התא השני.

עם זאת, ניתן לדגור את שני סוגי התאים יחד במערכת תרבית משותפת כדי לזהות חולשה מוגברת, או עמידות, של אוכלוסיית תאים אחת או שתיהן לטיפול מאוחר יותר. טכניקה זו יכולה פשוט לעשות שימוש בשתי אוכלוסיות של תאים שהודגרו יחד ללא כל טיפול, כדי להעריך את האיתות ההדדי הפרקריני הבסיסי, למשל. בנוסף להערכה בתחום הדלקת העצבית כפי שמודגם כאן, ניתן להשתמש במערכות תרבית משותפת כדי לענות על מגוון רחב של שאלות הנוגעות להתחדשות גידול, נוירולתיריזמה, איתות אפופטוזיס או כל נושא אחר עם מרכיב של איתות פרקריני.

לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד מערכות תרבית משותפת יכולות להציע דרך פשוטה להעריך את השינויים המתווכים על ידי גורם מסיס מופרש. ואנו מקווים ששכנענו אתכם בפוטנציאל הגבוה של מערכות תרבית משותפת זו בחקר איתות פרקריני רב-תאי בהיעדר מגע תא-תאי.