Name: פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: למד ליצור מערכת כנס עמית של שני סוגים סלולריים באמצעות מכנסים עם ממברנה חדירה. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת גורמים מופרשים מסיסים על תאי מטרה ללא מגע ישיר בין התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC) בקנדה ל-MGM. ג'יי.אר הוא עמית סטודנטים ב-NSERC-Vanier.

למחברים אין מה לחשוף.

השלב הקריטי ביותר של כל ניסוי מערכת שיתוף תרבות כנס למעשה שוכן בבחירת הכנס הראוי לשימוש. גודל נקבובי וחומר קרום חייבים להילקח בחשבון יסודי, מבלי לשכוח לקחת בחשבון את הסוג של תא יהיה זורע ואת מטרת הניסוי. לדוגמה, מבחני chemotaxic עשויים להשתמש באותו סוג של קרום מ שיתוף תרבויות התא לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים. עם זאת, שני סוגי ניסויים דורשים גדלים נקבוביים שונים: בגדולים עבור לשעבר, כדי לאפשר נדידת תאים, ואת קטנים באפשרות השנייה, ...

המחקר של רקמות, איברים או מערכות במבחנה הוא ניסיון לפשט את היחסים המורכבים מאוד הקיים בין תת הסלולר מספר המרכיבות יצורים רב-תאיים. ואכן, מחקרים במבחנה מאפשרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תא בודדות. ישנם שני יתרונות גדולים של עורכת ניסויים במבחנה: 1) מופחתים אינטראקציות הסלולר, ו -2) את היכולת לתפעל את הסביבה התאית בקלות. לפיכך, שני יתרונות אלה מדענים מותר לחזות את ההתנהגות של סוגי תאים מסוימים in vivo, שמוביל את היכולת לווסת תוצאות של השפעות חיצוניות באורגניזמים כולו. במובן זה, תרבית תאים במבחנה בדרך כלל עובדת כגשר מחבר מדעי חיים בסיסיים ויישומים. עם זאת, ישנם גם כמה חסרונות של עבודה במבחנה, אחד החשוב ביותר להיות כי הזמנה מסוימת עשויה לשכון הפיזיולוגיאל הרלוונטיות של פנוטיפים שנצפו. ואכן, כאשר סוג תא בודד הוא גדל בתוך סיר, התרבות מאבדת במידה שונה, קשרים בין התאים עם סוגי תאים אחרים, תרומתה לסביבת הלחות מן רקמות האורגניזם מוצא, ואת העוגנים בתוך הרקמה, שאיפשרה לו לקיים מבנה תלת ממדי בפרט לפעמים חיוני לתפקוד התא. שאל יחסים בין תאים טופל על ידי הפיתוח של טכניקות תרבות מעורבות. בשיטה זו, שתיים או יותר אוכלוסיות תאים גדלות יחד באותו כלי התרבות. עם זאת, תרבויות המעורבות אלה לשאת טרדות חשובות. מצד אחד, תת תא מסוים אינו אינטראקציה פיזית עם אחד אחר בתוך הרקמה ממוצא ולהסתמך אך ורק על תקשורת paracrine שנגרמה גורמים מסיסים מופרשים קולטנים סמוכים. זהו המקרה במשך כמה תהליכים דלקתיים שתלויים איתות ציטוקינים הפרוקסימלי. ב- C מעורבתultures, אינטראקציות פיסיות הם בלתי נמנעות ולעשות את זה אי אפשר ללמוד תקשורת paracrine בהעדר קשר תאי תאים שיכולים להניב תוצאות שינו. מצד שני, השגת פרשנויות תא ספציפי מתוך אוכלוסייה מעורבת הופך ישים ללא שימוש בטכניקות הפרדה קשים שיש בהם כדי להשפיע באופן משמעותי תוצאות. כדי לפתור סוגיות חשובות אלה, השימוש בתקשורת מותנית פותח כטכניקה המאפשרת תרבויות ממודרות וחקר האיתות אוטוקריני. שיטה זו דורשת העברת supernatant של סוג תא אחד, ובכך בשם בינוני מותנה, כדי בארות המכילות אוכלוסייה אחרת של תאים. עם זאת, חיסרון שחשוב זה מולקולות קצרת אינם שורדים מספיק זמן במדיום מותנה שיועברו הבארות של האוכלוסייה השנייה של תאים. גם מולקולות האריכה ימים ידוללו באופן משמעותי לאורך זמן עקב דיפוזיה. יתר על כן, הן תאאוכלוסיות להשתתף רק בתקשורת paracrine חד כיווני ולא בתקשורת דו-כיוונית פעילה. זה מוביל בהעדר איתות כי משוב הוא חיוני מחדש יחסים רב-תאיים מדויק ככל שהם קיימים in vivo. כתוצאה מכך מונע על ידי הצורך לדמות את המקורי טוב יותר בתנאי vivo בסביבת הסלולר במבחנה, כמה התקדמות טכניקות תרבית תאים הושגה במהלך השנים. אחד הפיתוחים המשמעותיים ביותר כבר בשימוש תומך חדיר עם ממברנות microporous עבור מידור בתרביות תאים, השתמשו בפעם הראשונה על ידי Grobstein בשנת 1953 1. תומך חדיר כאלה כבר מותאם לאורך השנים כדי להתאים סוגי תאים רבים כדי לשמש בכמה יישומים שונים. כיום, עזרה כזאת להתקיים כתוספות חלולות אשר נועדו לנוח בבארות מתוך צלחת תרבות multiwell רקמות או circuמנות Lar. במערכת שיתוף תרבות, את הכנס מכיל סוג תא אחד ואילו הבאר או צלחת מכילה האוכלוסייה התאית האחרת, מה שמאפשר ללמוד את התרומה של שתי אוכלוסיות שונות של תאים על סביבת הלחות שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, קוטביות הסלולר (basolateral vs הפרשת פסגה או קבלת אות) נשמרה, ובכך מקנה מערכות שיתוף תרבות כנס יתרון חשוב על פני תרבויות מעורבות וטכניקות בינוניות מותנות. ישנם מספר סוגים של חומרי קרום זמינים, אלה הנפוצים ביותר פוליאסטר להיות (PET), פוליקרבונט (PC) או מצופה קולגן polytetrafluoroethylene (PTFE), והם קיימים בגדלים נקבוביים שונים הנעים בין 0.4 מיקרומטר 12.0 מיקרומטר. אלו סוגים של חומרים וגדלים נקבוביים מציעים קשת של הוסיף הפעלת תכונות משתנות רלוונטיות תכונות אופטיות, עובי קרום ודבק תא שהופכים אותם מעשיות ברמות שונות עבור השימושים הבאים לא מוגבלים ל: -studyingהתמיינות תאים, התפתחות עוברית, גרורות של גידולים ותיקון פצע על ידי מבחני chemotaxic דרך ממברנות חדירות; -evaluating חדירה התרופה על ידי הערכת התחבורה שלהם באמצעות monolayers אפיתל או אנדותל בתרבית על תומך חדיר, ו; תא שיתוף תרבויות -ביצוע לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים. מטרת מאמר זה היא לתאר שיקולים מתודיים הרחב למלא את הפונקציה השלישית כאמור לעיל, כי היא להעריך שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. שדות שונים של מחקר לעשות שימוש במערכות שיתוף תרבות הכנס על מנת לענות על שאלות רלוונטיות שפעת גורמים מסיסים המופרשים על אוכלוסיות של תאים. ואכן, איתות אוטוקריני כי מודולציה התנהגות הסלולר ברמות שונות היא רלוונטית בכל הרקמותומערכות, מה שהופך מערכות שיתוף תרבות הכנס הכרחית כדי להבטיח התקדמות בתחומים אלה. לעומת זאת, השימוש מוסיף יכול לאשר כי תמרת אות על ידי מגע תאי תאים ישיר ולא על ידי גורמים מופרשים. אחד השימושים החשובים ביותר של מוסיף הוא במחקרי דלקת 2-14 בם ההשפעה של ציטוקינים מופרשים מוערכת ב שחקנים הסלולר שונים של חסינות. בפרט, המחקר של דלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS) הרוויח מאוד ממחקרי שיתוף תרבות כנס, אשר אפשרו עדיפה בהגדרת תפקידי paracrine הברור של נוירונים המיקרוגליאה נהיגת neuroinflammation 15-21. מערכות אלו תוכננו גם ללמוד את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של מולקולות המסתמכת על יכולתם להפחית או למנוע את הפרשת גורמים פרו-דלקתיים 22-26. מחקר הנוגע סרטן 27-31, בפרט מנגנוני אנגיוגנזה 32-34 ו inflammatiעל 35-42 ב tumorigenesis, נהנה גם מערכות שיתוף תרבות הכנס. יתר על כן, גורמים מסיסים הם בעלות חשיבות עליונה בתהליכים שמניעי הבידול מספר מחקרים השתמשו מוסיף לענות על שאלות בדרך מסוימת שדה 43-50. במערכת העצבים המרכזית, כמו לראות רקמה עצבית יש פוטנציאל התחדשות מוגבלת מאוד, חקר neurotrophism ו neuroprotection הוא יסודי כבר הבטיחו נרחב על ידי שימוש בתאי גזע במערכות שיתוף התרבות 51-56. בנוסף, מוסיף גם מנוצלים בתחומים מגוונים כמו נפרולוגיה 57,58, אינטראקציות האנדותל אנגיוגנזה 59-62, אפופטוזיס איתות 63-65, דלקת השמנה ותסמונת מטבולית 22,23,66-67, אוזן פנימית הגנה על תאי שיער 68,69, ואפילו ארסי פטריית 70,71 ופרזיטולוגיה 72,73. מאמר זה מציע קווים מנחי מתודולוגיים כללי כדי להקים experimאף אוזן גרון לאור הערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. בפרט, נוכל למקד את תשומת הלב שלנו על תרבויות-שיתוף תא העצב ואת השימושים שלהם בלימוד תהליך neuroinflammatory. בהתחשב הספקטרום רחב מאוד של ניסויים מוסיף לאפשר לטייס, זה בלתי נסבל לכסות כל היבט של טכניקת תרבית תאים זה. כדוגמא, פרוטוקול ספציפי כדי למדוד את ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia N9 על תאי PC12 עצביים שיפורט, מציע הבנה בטון של המתודולוגיה שיתוף תרבות כנס.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>R8755</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle' s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש, יש להוסיף 0.365 גרם/ליטר סרום L-גלוטמין</td></tr><tr><td>לסוסים</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S מבלוטה תת-לסתית של עכברים</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>להרכיב מחדש את האבקה הליופילית בתמיסה של תמיסת מלח חוצצת או מדיום תרבית רקמה המכיל 0.1&ndash; 1.0% אלבומין בסרום בקר או 1-10% סרום</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מ&nbsp; Escherichia coli&nbsp; 055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים רעילים לשימוש עם צלחות 24 בארות</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>353095 0.4 &mu; m נקבוביות</td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>ציפוי TrueLine</td><td>TR5002</td><td>עם קולגן לפני השימוש</td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> תרבית תאי PC12 <td>שגרתי מדיום תרבית תאי N9 שגרתי</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 85% RPMI בינוני</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 90% DMEM-F12 בינוני</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% סרום סוסים מומת בחום</td>-&nbsp;<td></td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% סרום סוסים מומת בחום</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5% סרום</td><td></td><td></td><td></td>בקר עוברי מומת בחום</tr><tr><td>PC12 מדיום</td><td></td><td></td><td>התמיינות N9 מדיום טיפול</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI בינוני</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% DMEM-F12 בינוני</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% סרום בקר עוברי מומת בחום</td>-&nbsp;<td></td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% סרום בקר עוברי מומת בחום</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 ננוגרם/מ"ל גורם</td><td></td><td></td><td></td>גדילה עצבי</tr><tr><td>PC12 מדיום</td><td></td><td></td><td></td> טיפול</tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI בינוני</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% סרום</td><td></td><td></td><td></td> בקר עוברי מומת בחום</tr></tbody></table>

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר cell-cell

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

תפקידם של גורמים מסיסים המופרשים בשינוי התגובות התאיות הוא נושא חוזר בחקר כל הרקמות והמערכות. בניסיון להבהיר את היחסים המורכבים מאוד בין מספר תת-הסוגים התאיים המרכיבים אורגניזמים רב-תאיים, פותחו טכניקות במבחנה כדי לסייע לחוקרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תאים בודדים. אחת הטכניקות הללו משתמשת בתוספות עם קרום חדיר המאפשר לגורמים מסיסים המופרשים להתפזר. לפיכך, אוכלוסיית תאים הגדלה בתוספות יכולה להיות מתורבת בבאר או בצלחת המכילה סוג תא אחר להערכת שינויים תאיים בעקבות איתות פרקריני בהיעדר מגע תא-תא. מערכות תרבית משותפת כאלה מציעות יתרונות שונים על פני טכניקות אחרות של תרבית משותפת, כלומר איתות דו-כיווני, קוטביות תאים שמורה וזיהוי ספציפי לאוכלוסייה של שינויים תאיים. בנוסף לשימוש בתחום הדלקת, הסרטן, אנגיוגנזה והתמיינות, מערכות קו-תרבית אלה הן בעלות חשיבות עליונה בחקר הקשרים המורכבים הקיימים בין תת-הסוגים התאיים השונים הקיימים במערכת העצבים המרכזית, במיוחד בהקשר של דלקת עצבית. מאמר זה מציע קווים מנחים מתודולוגיים כלליים על מנת להקים ניסוי על מנת להעריך שינויים תאיים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים באמצעות מערכת תרבית משותפת. יתר על כן, יפורט פרוטוקול ספציפי למדידת ההשפעות הנוירו-דלקתיות של ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה N9 המופעלת על ידי ליפופוליסכריד על תאי PC12 עצביים, המציע הבנה קונקרטית של מתודולוגיית תרבית משותפת.

השימוש במערכות שיתוף תרבות כנס רלוונטי במיוחד בחקר של תהליכי neuroinflammatory שופכי אור יחסי paracrine בין שחקנים סלולריים השונים של מערכת העצבים המרכזית. חסינות של מערכת העצבים המרכזי מושגת בעיקר על ידי תאי תושב קרואי מיקרוגליאה מנטר סביבתם במצב מסועף הנח שלהם (איור 2 א) ומסוגלים הפרעות חישה שיכול להטריד את הומאוסטזיס יקרה מאוד הכרחית לתפקוד עצבי ראוי 76-78. הפעלת microglial, המאופיינת אימוץ צורה אמבואידית (תרש...

באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים המופרשים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פרקריני. מערכות תרבית משותפת מציעות דרך פשוטה להעריך את השינויים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים בהיעדר מגע תא-תא.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת של תרבית תאים משולבת (co-culture) משני סוגי תאים באמצעות תבניות (inserts) בעלות ממברנה חדירה, ובכך לאפשר דיפוזיה של גורמים ממיסים מופרשים. דבר זה מושג באמצעות סדרת שלבים שבהם ממוקמות במדויק תבניות המכילות סוג תא אחד בתוך פלטת תרבית רקמות בעלת בארות מרובות המכילה סוג תא שני. אנו מתחילים בזריעת סוג תא מספר אחת בתוך התבניות, ובזריעת סוג תא מספר שתיים בפלטת תרבית הרקמות בעלת הבארות המרובות.השלב השני הוא להעביר את התאים (inserts) אל בארות הפלטה המכילה את סוג התא השני. בסופו של דבר, הדבר מאפשר לאסוף את שני סוגי התאים ואת תעלילי העל (supernatants) המתאימים להם. לפיכך, ניתן להעריך את השפעתם של גורמים מסיסים מופרשים על סוג התא הנחקר.באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים מוקרטים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פראקריני. לפיכך, ערכו של מערכת שיתוף-תרבית עם מקטעים (insert co-culture system) טמון ביכולתה להציע דרך מקורית להערכת שינויים בפרמטרים תאיים המתווכים על ידי גורמים מסיסים מוקרטים, בהיעדר מגע בין תאים. מערכות שיתוף-תרבית עם מקטעים מציעות יתרונות שונים על פני טכניקות שיתוף-תרבית אחרות, כגון: ראשית, איתות חד-כיווני; שנית, שימור של קוטביות תאית; ושלישית, זיהוי של שינויים תאיים באופן ספציפי לאוכלוסייה.להלן יפורט פרוטוקול ספציפי למדידת ההשפעות הרעילות של ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה N9 שהופעלה באמצעות ליפו פוליסכריד על תאי עצב PC12, ובכך ייסופק הבנה קונקרטית של מתודולוגיית השתקעויות שיתוף-תרבית (co-culture). ראשית, הוצאו מתוך האריזה את פלטת תרבית הרקמה בעלת 24 הבארים ואת ההשתקעויות (inserts) העשויות פוליטטרהפלואורואתילן בעלות נקבים של 0.4 מיקרון. לאחר מכן, הניחו את ההשתקעויות בתוך הבארים הריקות של פלטת תרבית הרקמה על ידי תפיסת הקצה העליון של ההשתקעות באמצעות פינצטה סטרילית.בשלב הבא, מלאו את המצעים (inserts) במדיום N9 שגרתי עד שהממברנה תהיה מכוסה לחלוטין. הדגרימו את המצעים למשך שעה אחת לפחות, או למשך הלילה, כדי לשפר את יכולת ההיצמדות של התאים. לאחר שהמצעים מוכנים, בצעו פיצול (split) של מיקרוגליה N9 בהתמלאות (confluence) של 80% עד 90% באמצעות מדיום N9 שגרתי, כדי להשיג תרחיף תאים שישמש לזריעה במצעים.לאחר מכן, הסירו את מצע השגרה מהמבני (inserts) תוך הקפדה לא לנקב את הממברנה עם טיפ המיקרופיפטה. בהמשך, זרעו בכל מבנה 60,000 תאים לסנטימטר רבוע באמצעות 50 µL של תגלהי התאים, או בהתאם לפרוטוקול של יצרן המבנים. בזמן חלוקת תגלהי התאים, ודאו שהתמיסה נותרת הומוגנית על ידי היפוך מזדמן של המבחנה.לאחר זריעת כל ההכנסות (inserts), נדנדו בעדינות את הפלטה קדימה ואחורה, ולאחר מכן משמאל לימין, כדי להפיץ את התאים באופן שווה. הימנעו מתנועות סיבוביות, שכן אלו יגרמו לתאים להצטבר במרכז ההכנסה. לאחר מכן, דגרו את הפלטה המכילה את ההכנסות למשך 24 שעות לפני ההמשך להפעלת מיקרוגליה N9.התחילו בשקילה של 10 מיליגרם של ליפופוליסכריד ואחסנו אותו בפרוקת Eppendorf בנפח 1.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. מכיוון שליפופוליסכריד הוא אנדוטוקסין פרו-דלקתי חזק הדורש אמצעי בטיחות מיוחדים, מומלץ מאוד להשתמש במשקפי מגן, כפפות ומסננת חלקיקים. לאחר מכן, הכינו סדרת דילולים של ליפופוליסכריד באמצעות מצע טיפול N9 חם כדי לקבל תמיסות עבודה בריכוזים של ארבעה, שניים ואחד מיקרוגרם למילו ליטר.לבסוף, הסירו מחצית ממצע התרבית מהסרטים (inserts), תוך הקפדה לא להפריע לתאים. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 25 microliters של תמיסות עבודה של lipopolysaccharide לסרטים כדי להגיע לדילול סופי של 2, 1 או 0.5 micrograms per milliliter. דגרו את הפלטה למשך 24 שעות נוספות לפני השלב של ניסויי התרבית המשולבת (co-culture).שלב זה דורש תאי PC12 שנזרעו בריכוז של 30,000 תאים לסנטימטר רבוע כנוירונים ביניים מובחנים, ותאי מיקרוגליה N9 שהופעלו באמצעות ליפופוליסכריד למשך 24 שעות כפי שמתואר בסעיף הקודם. התחילו בהסרה עדינה של כל המצע מהאינסרטים, והחליפו אותו ב-50 מיקרוליטר של מצע טיפול N9 טרי וחם. פעולה זו נחוצה כדי להסיר את כל השאריות של הליפופוליסכריד, ולהשאיר רק תאי מיקרוגליה N9 מופעלים.יש לזכור כי המאשרים (inserts) אינם מהודקים לבארים של פלטת תרבית הרקמה ועשויים לזוז אם הפיפטה תילחץ חזק מדי אל הדופן. יש לבצע שלב זה עבור מאשר אחד בכל פעם כדי למנוע מהתאים להתייבש עקב חשיפה ממושכת לאוויר. לאחר מכן, יש להסיר לחלוטין את מצע תרבית תאי ה-PC12 העצביים ולהחליפו ב-0.6 milliliters של מצע טיפול PC12 טרי וחם.בצעו זאת בבאר אחת בכל פעם כדי להבטיח שהתאים לא יתייבשו. בעזרת פינצטה, אחזו בקצה העליון של אינסרט והניחו אותו בעדינות לתוך הבאר המכילה תאי neuronal PC12. לאחר העברת כל האינסרטים, בדקו אם קיימות בועות אוויר מתחת לממברנות של האינסרטים.בועיות אוויר ימנעו כל חילוף חומרים דרך ממברנת האינסרט ועלולות לסכן את הניסוי כולו. הסיר כל בועיות אוויר על ידי הרמה עדינה מאוד של האינסרט מהבאר באמצעות פינצטה והחזרתו אל מצע תרבית התאים; פעולה זו אמורה להסיר את מרבית הבועיות. עם זאת, עבור בועיות עקשניות, נסה לטבול את האינסרט בעדינות חזרה אל מצע תרבית התאים בזווית.אין להקיש או לערבב את המכניסים (inserts), שכן הדבר עלול לגרום להתנתקות של תאים דבקים. לאחר מכן, בדקו את נפח המדדיים הן במכניסים והן בבארים; מפלס הנוזל בשני התאים צריך להיות בערך באותה רמה. כאשר כל בועות האוויר הוסרו ונפחי המדדיים מתאימים, הכניסו את הפלטה לדגירה.ניתן לאחר מכן לאסוף את התאים, את מצע התרבית, או את שניהם, כדי למדוד את השפעות האיתות הפראקריני בין תאי המיקרוגליה N9 לבין תאי העצבים PC12. בדיקות ELISA בוצעו על מצע תרבית התאים של המדור התחתון כדי לכמת ציטוקינים פרו-דלקתיים. התוצאות ממחישות כי 24 שעות לאחר תקופת ההפעלה, תאי מיקרוגליה N9 שטופלו ב-2 µg/mL של lipopolysaccharide הפרשו כמות גדולה משמעותית של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha ו-interferon gamma, בהשוואה לתאי מיקרוגליה שלא טופלו.בנוסף, מיקרוגליה מסוג N9 שטופלה ב-1 µg/mL של ליפופוליסכריד הפרשה באופן מובהק יותר interferon gamma לאחר 24 שעות, בעוד שנדרשו 48 שעות כדי לראות עלייה משמעותית ברמות של interleukin-6 ו-tumor necrosis factor-alpha במדיום התרבית. לעומת זאת, התנאי של 0.5 µg/mL לא הוביל להגברת ביטוי הציטוקינים במיקרוגליה מסוג N9 הן ב-24 והן ב-48 שעות לאחר תקופת ההפעלה. יתרה מכך, הנתונים בנקודת זמן של 24 שעות בקבוצת ה-2 µg/mL מרמזים על התרחשות מיקרוגליוזיס, שהיא עלייה באוכלוסיית המיקרוגליה.עם זאת, רק לאחר 48 שעות חל wzrost משמעותי במספר התאים. לבסוף, על מנת להעריך את השלכותיה של הפעלת המיקרוגליה המובילה להגברת הפרשת ציטוקינים ולמיקרוגליאוזיס, נבחנה הציטוטוקסיות בתאי עצבים PC12 בתרבית משותפת. על ידי מדידת רמות של Lactate Dehydrogenase חוץ-תאי, המשוחרר על ידי תאים פגועים, נמצא כי תאי עצבים PC12 מראים רמות גבוהות יותר של מוות תאי ככל שריכוז ה-lipopolysaccharide על תאי ה-N9 עלה.כך, תוצאות אלו מראות כי גורמים מסיסים מופרשים מסוגלים לעבור דרך ממбраנת המכניסים של התרבית המשולבת (co-culture inserts), ויכולים לגרום לנזק ציטוטוקסי לתאי PC12 נוירונליים בהיעדר מגע בין תאים. למרות שהוצג כאן תרחיש אחד בלבד של תרבית משולבת באמצעות מכניסים, זוהי טכניקה גמישה מאוד. בפרוטוקול זה, סוג תא אחד טופל מראש במולקולה האחראית להפחתת הפרשתם של גורמים מסיסים אשר, עם העברת המכניס לבאר, משפיעים על התנהגותו של סוג תא שני.עם זאת, ניתן להדגיר את שני סוגי התאים יחד במערכת של תרבית משולבת (co-culture) כדי לזהות חולשה מוגברת, או עמידות, של אחת או שתי אוכלוסיות התאים לטיפול מאוחר יותר. טכניקה זו יכולה פשוטת להשתמש בשתי אוכלוסיות של תאים המודגירות יחד ללא כל טיפול, כדי להעריך, למשל, את השיגנול הפראקריני ההדדי הבסיסי. בנוסף לערכה בתחום הנוירו-דלקת כפי שהודגם כאן, ניתן להשתמש במערכות תרבית משולבת כדי לענות על מגוון רחב של שאלות הנוגעות להתחדשות גידולים, נוירו-לתרסיזמה, שיגנול של אפופטוזיס, או כל נושא אחר הכולל מרכיב של שיגנול פראקריני.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מערכות של cultivos-משותפים במסננת (insert co-culture systems) יכולות להוות דרך פשוטה להערכת שינויים המתווכים על ידי גורמים מסיסים מופרשים. אנו מקווים שהצלחנו לשכנע אתכם בפוטנציאל הגבוה של מערכות co-culture אלו במחקר של סיגנלינג פראקריני רב-תאי בהיעדר מגע בין תאים.

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מפתחים מודל תרבית משותפת פרוקסימלי של תאי סרטן השחלות ותאי מזותל אנושיים ראשוניים. מודל פיזיולוגי רלוונטי זה מאפשר לחקור איתות פרקריני, שבו נשמרים הריכוזים המקומיים של הגורמים המופרשים תוך מניעת מגע תאי ישיר.

מערכת תרבית פרוקסימלית: טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר איתות פרקריני בין תאים

סרטון זה מדגים טכניקה להקמת תרבית משותפת של נוירונים בין-עצביים עם תאי אנדותל פריווסקולריים. התאים מתווספים לתוספת באר אחת הממוקמת בתוך צלחת תרבית. לאחר שהתאים נצמדים לצלחת, העלון מוסר, ומאפשר לתאים להתרבות ולקיים אינטראקציה וליצור תרבית משותפת.

הקמת תרבית משותפת של נוירונים בין-עצביים עם תאי אנדותל פריוונטריקולריים

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

במאמר זה אנו מדגימים כיצד תאי אפיתל שגודלו בתרבית עם פיברובלסטים במערכת הדו-שכבתית המבוססת על קרום ננו-סיבי יכולים להיצמד ביציבות לקרום ולגדול עליו.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם שלבי מפתח להנחיית ההנדסה והניצול של 3D Flipwell. אנו מתארים ומראים כיצד להרכיב את ערימות התוספות של תרבית משותפת ולהשתמש בהן לתרבית משותפת של שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, אפיתל מעיים ומקרופאגים כדי לדגמן את סביבת רירית המעי.

הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

למד ליצור מערכת כנס עמית של שני סוגים סלולריים באמצעות מכנסים עם ממברנה חדירה. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת גורמים מופרשים מסיסים על תאי מטרה ללא מגע ישיר בין התאים.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

גלה סרטונים נוספים