פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של Parahaemolyticus Vibrio ו אחר Vibrio מינים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את הרגישות והספציפיות של מדיום כרומוגני חדש ליכולת לזהות ולבודד Vibrio parahaemolyticus בהשוואה למדיה קונבנציונלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המזון והמיקרוביולוגיה הסביבתית, כגון מהי השכיחות של מיני ויבריו בסביבות מזון וקציר? היתרון העיקרי של ההליך שלנו הוא שניתן להשתמש בבידוד חיידקים רבים, כולל בנוכחות מטריצת מזון.

לפני גידול החיידקים, יש לבצע חיטוי של כל אמצעי האגר. לאחר מכן מצננים את האגר ל 45 עד 50 מעלות צלזיוס באמבט מים. כשהאגר מוכן, מסדרים צלחות פטרי ריקות בערימות של חמש עד שש צלחות.

לאחר מכן, החל מתחתית הערימה, שפכו את האגר המותך לכל צלחת עד למחצית מלאה, והחזירו את המכסים לאחר המזיגה. הניחו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות. כדי להגדיר את תרביות הזן המיקרוביאלי, כאשר האגר מוכן, השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי להעביר את התרביות על לוחות האגר הלא סלקטיביים המתאימים, תוך פס החיידקים בתבנית שתאפשר תצפית על מושבות מבודדות.

לאחר שכל המושבות מצופות, דגרו על התרביות הפוכות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות, למעט מיני קמפילובקטר, אותם יש לדגור בצנצנת סגורה המכילה שקית גז כדי לייצר סביבה מיקרואירופילית. שימו לב למורפולוגיה של המושבה בסוף הדגירה. תרבויות טהורות צריכות להניב מושבות המציגות מורפולוגיה דומה של מושבה.

כדי לגדל את המושבות המעניינות על מדיה סלקטיבית ודיפרנציאלית, העבירו כמה מושבות מבודדות לחמישה מיליליטר של המרק המתאים ודגרו מחדש את התרביות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. למחרת, פס לולאה של תרביות הלילה על לפחות צלחת אגר אחת של תיוסולפט-ציטראט-מרה-מלח-סוכרוז, או TCBS, ולפחות צלחת אגר כרומוגנית אחת למשך עד 96 שעות דגירה בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, בחנו הן את צפיפות התרבות על הצלחת והן את גודל המושבות המבודדות כדי לקבוע את הצמיחה הכוללת של הזנים, רשמו את צבע המושבות תחת אור סביבתי או UV, לפי הצורך, ושימו לב לכל מאפיין חשוב אחר של המושבות.

כדי לבצע בדיקת התאוששות, חסנו תרביות צעירות של Vibrio parahaemolyticus בחמישה מיליליטר של מרק סויה טריפטי, בתוספת שני אחוז נתרן כלורי, או TSBS, והניחו את הצינורות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. למחרת, מערבל את תרביות הלילה והגדר אחת כפול 10 לשלילית, לאחת כפול 10 לשבע הדילולים השליליים של החיידקים ב-PBS. השתמש באחד כפול 10 עד השלילי ארבע עד אחד כפול 10 לשבע הדילולים השליליים, צלח באופן שווה 100 מיקרוליטר מכל דילול על אגר סויה כרומוגנטי, TCBS וטריפטי בודד בתוספת שני אחוז אגר נתרן כלורי, או TSAS.

דגרו את כל הצלחות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס עד 96 שעות. לאחר מכן ספרו את המושבות, תוך התעלמות מהלוחות הנושאים מושבות רבות מכדי לספור או המכילות פחות מ-25 מושבות. כדי לבצע בדיקת תחרות, בחר זן V.Parahaemolyticus שמניב את מושבות הטורקיז הצפויות על TCBS ומושבות ציאן על אגר כרומוגני, וזן שאינו V.

מין Parahaemolytius שאינו גדל באף אחת מהמדיות או מציג צבע מושבה שונה. העבירו כמה מושבות מבודדות של V.Parahaemolyticus ו-V.Metschnikovii מחקלאות TSAS, לחמישה מיליליטר של TSBS למשך 16 עד 24 שעות דגירה בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס. העבירו כמה מושבות שיגלה סוניי מבודדות מעירוי לב מוח, או BHI, אגר לחמישה מיליליטר מרק BHI למשך 16 עד 24 שעות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, בצע דילול סדרתי עבור כל זן, ציפוי הדילולים על לוחות אגר לא סלקטיביים כדי לקבוע את היחידות היוצרות מושבה למיליליטר של תרביות הלילה. לאחר מכן, השתמש בתרביות הלילה ובצינורות הדילול כדי לערבב נפחים שונים של זן V.Parahaemolyticus וזן שאינו V. Parahaemolyticus ומפזרים 100 מיקרוליטר מתערובת החיידקים על לוחות אגר כרומוגניים, TCBS ו-TSAS בודדים.

לאחר עד 96 שעות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס, ספרו את המושבות על סמך ההבדלים בגדילה ובמורפולוגיה שלהן על הלוחות הכרומוגניים וה-TCBS. כדי להעריך את ההשפעות של צדפות הומוגניות על צמיחת חיידקים על מצע סלקטיבי ודיפרנציאלי, שקלו תחילה לפחות 50 גרם של בשר צדפות מלפחות 12 רכיכות, כולל הבשר והמשקאות החריפים. לאחר מכן הוסיפו מסה שווה של PBS לרקמות הצדפות וערבבו את התערובת במהירות גבוהה למשך 90 שניות.

לאחר מכן, מוסיפים 100 גרם מהצדפה המדוללת הומוגנית ל-400 גרם PBS ומערבבים את התערובת במהירות גבוהה למשך דקה אחת. ואז חיטוי ההומוגנאט. לאחר הקירור, הוסף 100 מיקרוליטר מכל לילה V.Parahaemolyticus ולא V.

תרבית Parahaemolyticus לתמיסת הצדפות, והשתמש בהומוגנייזר כדי לערבב את תאי החיידקים עם הצדפה הומוגנית. הפוך פעם אחת 10 לשלילי אחד לאחד כפול 10 לשלושת הדילולים השליליים של הצדפה ההומוגנית ב-PBS כפי שהודגם, ופיזר 100 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות כרומוגניים, TCBS ו-TSAS בודדים. לאחר 96 שעות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס, השווה את ספירת המושבות בפועל על האגרים הכרומוגניים וה-TCBS עם ספירת המושבות הצפויה הנגזרת מספירת הלוחות הסטנדרטית שנערכה בתרביות הלילה.

כדי לקבוע את הצמיחה ואת המורפולוגיה של המושבה של הזנים ששימשו במחקר זה, החיידקים גודלו על מדיה סלקטיבית ודיפרנציאלית. TCBS הוא המדיום הקונבנציונלי המשמש לבידוד של כמה מינים של ויבריו, כולל טורקיז V.Parahaemolyticus ו-V.Cholerae צהוב. השימוש במדיום כרומוגני לבחירת מיני ויבריו רלוונטיים מבחינה קלינית מדגימות מזון וסביבה מביא ליצירת ציאן V.Parahaemolyticus ומג'נטה V.Cholerae.

מושבות של V.Parahaemolyticus הגדלות על צלחות אגר כרומוגניות בנוכחות צדפות הומוגניות נצפות במספרים דומים לאלו במדיה לא סלקטיבית, מה שמרמז על כך שגבול הזיהוי של המדיום הכרומוגני דומה לזה של מדיה לא סלקטיבית, אפילו בנוכחות מטריצת מזון. כמו כן, הצמיחה וההתאוששות של V.Parahaemolyticus אינן מושפעות מנוכחות של שאינו V. מיני Parahaemolyticus, תכונה חיונית למדיה דיפרנציאלית וסלקטיבית, שכן דגימות סביבתיות מכילות מיני ויבריו שונים במספרים גבוהים, במיוחד לאחר הליך העשרה.

יתר על כן, ההשוואה בין TCBS ואגרים כרומוגניים על ידי המוליזין תרמו-לאביל PCR חושפת רגישות וסגוליות גבוהות יותר עבור האגר הכרומוגני, מה שמעיד על ביצועים טובים יותר בסך הכל עבור מדיום דיפרנציאלי וסלקטיבי זה לאיתור וזיהוי V.Parahaemolyticus. לאחר השליטה, ניתן להשלים את כל ההליך, כולל זמני הבדיקה והדגירה של כ-50 זנים, תוך 30 יום כאשר הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתייג בחריצות את כל התרבויות ולהשתמש בטכניקה אספטית בכל עת.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR מושבה כדי לענות על שאלות נוספות, כמו, האם המבודד הספציפי הזה נושא גן אלימות? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בטיחות המזון ובריאות הציבור לחקור זיהוי מיני ויבריו ברכיכות ובסביבת שפך הנהר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ספירת צלחות סטנדרטית וכיצד להעריך את הרגישות, הספציפיות וגבול הזיהוי של מדיום גידול.

אל תשכח שעבודה עם פתוגנים ומדיום חם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ביגוד מגן, כיסוי פצעים פתוחים והפרדת פסולת ביולוגית מסוכנת בעת ביצוע הליך זה.