זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

המטרה הכוללת של הליך זה, היא לזהות את חלבוני הקישור של מולקולות קטנות באמצעות בדיקת פוטו-אפיניטי, שיכולה להיקשר למטרה שלה בתאים חיים, ולאפשר בידוד וזיהוי של המטרה לאחר מכן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבהיר את מנגנון הפעולה המולקולרי של תרופות או מולקולות קטנות אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחשים בסביבה התאית הטבעית, ומסירים את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזה של תאים.

התחל בהליך זה, על ידי הכנת מנות תרבית תאים סטריליות של שישה סנטימטרים, למספר הדגימות הרצויות. בדרך כלל, צלחת אחת של תאים משמשת לכל מצב טיפול. שלוש מנות של תאים יוכנו להדגמה זו, ובקרה שלילית עם DMSO בלבד, המסומנת D, טיפול בדיקה בלבד, מסומנת P, ובדיקה פלוס מתחרה, המסומנת C.To כל צלחת תרבית, מוסיפים 3.5 מיליון תאי HEK 293 T בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית.

דגרו על התאים למשך הלילה. לפני הטיפול בתאים, יש להכניס מראש את התרופות הדרושות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לטיפול מקדים למתחרה, הוסף ארבעה מיקרוליטר של DMSO לכל אחד משני הצינורות, וארבעה מיקרוליטרים של מתחרה של 10 מילי-מולרית לצינור אחד.

לטיפול בבדיקה, הוסף 16 מיקרוליטר של DMSO לצינור אחד, ו-16 מיקרוליטר של 15 בדיקת פוטו-אפיפיניות מיקרו-מולרית לכל אחד משני הצינורות. הכניסו את צלחות תרבית התאים למכסה המנוע של תרבית התאים להוספת התרופות המוכנות מראש. שאפו מיליליטר אחד של מדיום תרבית מכלי הטיפול בתחרות, העבירו אותו לצינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את המתחרה שצוין מראש, והשעו מחדש את התרופה במדיום.

מוסיפים בעדינות את תערובת המדיום והתרופות בחזרה לתבשיל. באותו אופן, הוסף DMSO הן למנת הבקרה השלילית והן לצלחת הבדיקה. מחזירים את הכלים לחממה למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, החזירו את הכלים למכסה המנוע ועמעמו את האורות. הוסף את ה-DMSO המצוטט מראש לצלחת הבקרה השלילית, ובדוק לכלי הבדיקה והתחרות. מחזירים את הכלים לחממה למשך שעה.

לאחר שעה מניחים את הכלים על קרח. שטפו את התאים בכל כלי בעדינות עם חמישה מיליליטר PBS קר כקרח כדי להסיר עודפי בדיקה. מכסים מחדש את התאים בארבעה מיליליטר PBS קר כקרח.

הניחו צלחת תאים, במרכזם שלושה סנטימטרים מתחת למנורת ה-UV על גבי שקית קרח, כדי למזער את החימום מהמנורה, והקרינו במשך שלוש דקות. מוציאים את המנה ומניחים אותה על קרח. באופן זה, הקרינו את כל הדגימות.

לאחר הקרנה של כל הדגימות, יש לשאוב את ה-PBS מהתאים, ולהוסיף 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח עם מעכבי פרוטאז לכל מנה. נתקו את התאים מהצלחת באמצעות מגרד גומי, והעבירו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים מראש על קרח. הוסף SDS לכל דגימה לריכוז סופי של 0.4% ליז את התאים על ידי סוניקציה של התרחיף למשך 10 פולסים, דגירה על קרח למשך דקה אחת ולאחר מכן סוניקציה ל-10 פולסים נוספים.

הרתיחו את הדגימות על גוש חום המוגדר ל-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להשלים את ליזיס התאים ולפרק את כל החלבונים. לאחר מדידת ריכוז החלבון בכל דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, נרמל את ריכוז החלבון ל-2.5 מיליגרם למיליליטר, על ידי הוספת PBS PH 8.5 בתוספת 0.4% SDS לפי הצורך. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו 40 מיקרוליטר מכל ליזאט תא, שהוכן בקטע הקודם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.

הוסף את הריאגנטים הבאים בסדר זה, 0.2 מיקרוליטר קמח-אזיד, 0.58 מיקרוליטר TCEP ו-3.38 מיקרוליטר TBTA. מערבולת לערבב. הוסף 1.14 מיקרוליטר של נחושת גופרתית פנטהידרט כדי להתחיל בתגובה.

מערבולת קצרה ודוגרת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS 2X כדי להרוות את התגובה. הפעל את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE, וכאשר חזית הצבע הגיעה לסוף הג'ל, המשך להפעיל את הג'ל במשך חמש דקות נוספות כדי להבטיח שכל עודפי הקמח-אזיד שלא הגיבו יצאו לחלוטין מהג'ל.

לאחר שטיפת כל עודפי הקמח-אזיד, הניחו את הג'ל על צלחת זכוכית וסרקו את הג'ל באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי, בהתאם להוראות היצרן. להצמדת תג ביוטין, השתמש בכמות המקסימלית של ליזטים של תאים לאחר נורמליזציה של חלבון, כך שכל הדגימות יהיו באותו נפח. נקה את הליזטים על ידי הוספת כל דגימה לצינור חדש, המכיל 50 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין אגרוז בעלי קיבולת גבוהה שנשטפו מראש.

דגירה למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש על קרח, והשליך את החרוזים.

לכל 500 מיקרוליטר ליזאט, הוסף את הריאגנטים הבאים, 1.38 מיקרוליטר ביוטין-אזיד, 5.5 מיקרוליטר TCEP ו-32.5 מיקרוליטר TBTA. מערבולת לערבב. הוסף 11 מיקרוליטר של נחושת גופרתית פנטהידרט לכל 500 מיקרוליטר ליזאט ומערבולת בקצרה.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו ארבעה נפחי דגימות של אצטון, צוננים ל-20 מעלות צלזיוס, מערבלו את הדגימות ודגרו למשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס, כדי לזרז לחלוטין את החלבונים ולהסיר ביוטין-אזיד שלא הגיב. למחרת, צנטריפוגה את הדגימות ב-17,000 x גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את החלבונים המשקעים.

שאפו את הסופרנטנט לחלוטין, הוסיפו 150 מיקרוליטר של PBS PH 7.4 ו-1% SDS לכל דגימה, והפיסו מחדש את החלבונים על ידי סוניקציה. הוסף 600 מיקרוליטר של PBS לכל דגימה, כדי לדלל את ריכוז ה-SDS ל-0.2%ואז הוסף את הדגימה לצינור חדש המכיל 30 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין אגרוז בעלי קיבולת גבוהה שטופים מראש. דגירה למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב.

לאחר שעה, גלול את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 1000 x גרם למשך שלוש דקות. שאפו והשליכו את הסופרנטנט, המכיל חלבונים לא קשורים. הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לחרוזים, ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.

צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם מאגר כביסה. לאחר הכביסה הסופית, שאפו את מאגר הכביסה לחלוטין מהחרוזים, והוסיפו 30 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS 2X. דגירה במשך חמש דקות בגוש חום של 95 מעלות צלזיוס, כדי לשחרר את החלבונים מהחרוזים.

צנטריפוגה את החרוזים ב 13000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. פיפטה בזהירות את מאגר הדגימה, המכיל חלבונים מהחרוזים, עבור SDS-PAGE. ההדמיה של חלבונים לאחר תיוג עם תג פלואורסצנטי, מודגמת על ידי ג'ל סרוק פלואורסצנטי זה.

פס החלבון הקושר הספציפי העיקרי, בכ-35 קילודלטון, קיים רק בנתיב הבדיקה, ומתחרה בו עודף תרכובת האם. אותה פס של 35 קילודלטון הודגם על ידי צביעת כסף לאחר משיכת ביוטין, ולאחר מכן זוהה על ידי ספקטרומטריית מסה כחלבון הממברנה VDAC1. זהות החלבון אומתה עוד יותר, באמצעות נוגדן ספציפי ל-VDAC1.

האות קיים בנתיב הבדיקה, וירד בנתיב התחרות. הכללת שבר הקלט, מבטיחה שהנוגדן עובד וניתן לזהות את החלבון המעניין בליזאט. העלייה הקלה במשקל המולקולרי של הדגימות הנשלפות, נובעת מהגשושית המחוברת היטב.

ההשלכות של אי ביצוע נכון של שלבים מסוימים בפרוטוקול מומחשות. הסרה לא מלאה של עודפי קמח-אזיד, גורמת למריחות שחורות גדולות בתחתית הג'ל הסרוק הפלואורסצנטי, בעוד שניקוי מוקדם לא מספיק של הליזטים ו/או שטיפת החרוזים, מביא לג'ל מוכתם בכסף עם כתמי רקע גבוהים מאוד. מתחילתו ועד סופו, ניסוי המשיכה לוקח יומיים-שלושה.

לאחר שחלבון המטרה בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה או כתמים מערביים, יש לבצע ניסויי אימות ספציפיים נוספים למטרה כדי להעריך את הרלוונטיות של המטרה לפנוטיפ המושרה על ידי תרופה.