זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות חלבוני קישור של מולקולות קטנות באמצעות גשש בעל זיקה פוטוכימית (photoaffinity probe), המסוגל להיקשר למטרתו בתאים חיים, ובכך לאפשר את בידודם וזיהוים של המטרות לאחר מכן. שיטה זו יכולה לשמש להבהרה של מנגנון הפעולה המולקולרי של תרופות או מולקולות קטנות אחרות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהקישור והסימון הקוולנטי של חלבוני המטרה מתרחשים בתוך הסביבה התאית הטבעית, מה שמסיר את הסיכון לפגיעה במבנה החלבון הטבעי ובתנאי הקישור בעת ליזיס של התאים.

התחילו את הפרוצדורה על ידי הכנת צלחות תרבית תאים סטריליות בקוטר שישה סנטימטרים, עבור מספר הדגימות הרצוי. בדרך כלל, נעשה שימוש בצלחת תאים אחת לכל תנאי טיפול. לצורך הדגמה זו יוכנו שלוש צלחות תאים: ביקורת שלילית עם DMSO בלבד, המסומנת כ-D, טיפול בחומרה (probe) בלבד, המסומנת כ-P, וחומרה בתוספת מתחרה (competitor), המסומנת כ-C. לכל צלחת תרבית, הוסיפו 3.5 מיליון תאי HEK 293 T בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית.

דגרו את התאים למשך לילה. לפני הטיפול בתאים, חלקו מראש את הכמויות הנדרשות של התרופות לשפורי מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter. עבור הטיפול המקדים בתחרות (competitor), הוסיפו ארבעה microliters של DMSO לכל אחד משני שפורים, וארבעה microliters של competitor בריכוז 10 millimolar לשפור אחד.

עבור הטיפול בגשש, הוסיפו 16 µL של DMSO למבחנה אחת, ו-16 µL של גשש פוטו-אפיניטי בריכוז 15 µM לכל אחת משתי המבחנות. העבירו את צלחות תרבית התאים למנדף תרביות התאים לצורך הוספת התרופות שחולקו מראש. שאבו 1 mL של מצע תרבית מצלחת הטיפול בתחרות, העבירו אותו למבחנת המיקרו-צנטריפוגה המכילה את המתחרה שחולק מראש, וערבבו מחדש את התרופה בתוך המצע.

הוסיפו בעדינות את תערובת המצע והתרופה בטיפות חזרה אל הצלחת. באופן דומה, הוסיפו DMSO הן לצלחת הביקורת השלילית והן לצלחת הגשוש (probe). החזירו את הצלחות לאנקובטור למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, העבירו את הצלחונות בחזרה למכבן המדפיק והחשיכו את האורות. הוסיפו את ה-DMSO שמסופק במנובים מראש לצלחון הביקורת השלילית, ואת הגשוש (probe) לצלחוני הגשוש והתחרות. החזירו את הצלחונות לאינקובטור למשך שעה אחת.

לאחר שעה, הניחו את הצלחות על קרח. שטפו בעדינות את התאים בכל צלחת עם 5 milliliters של PBS קר מאוד כדי להסיר שאריות של הגש. כסו שוב את התאים ב-4 milliliters של PBS קר מאוד.

הניחו צלחת תאים, במרכז, שלושה סנטימטרים מתחת למנורת ה-UV על גבי מאreקר קרח, כדי למזער את החימום מהמנורה, והקרינו למשך שלוש דקות. הסירו את הצלחת והניחו אותה על קרח. באופן זה, הקרינו את כל הדגימות.

לאחר הקרנת כל הדגימות, שאבו את ה-PBS מהתאים, והוסיפו 200 µL של PBS קר מאוד עם מעכבי פרוטאז לכל צלחת. הפרדו את התאים מהצלחת באמצעות מגרדת גומי, והעבירו אותם למבחנות מיקרו-צנטריפוגה מסומנות מראש על קרח. הוסיפו SDS לכל דגימה עד לריכוז סופי של 0.4%. lysed את התאים על ידי סוניקציה של התו suspension למשך 10 פולסים, דגירה על קרח למשך דקה אחת, ולאחר מכן סוניקציה למשך 10 פולסים נוספים.

הרתיחו את הדגימות על גבי בלוק חימום המוגדר ל-95 °C למשך חמש דקות כדי להשלים את ליסיס התאים ולדנטורציה של כל החלבונים. לאחר מדידת ריכוז החלבון בכל דגימה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, נרמלו את ריכוז החלבון ל-2.5 mg/mL, על ידי הוספת PBS pH 8.5 בתוספת 0.4% SDS לפי הצורך. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו 40 µL מכל ליסיס תא, שהוכן במקטע הקודם, לשפרורת מיקרוצנטריפוגה חדשה.

הוסף את הרכיבים הבאים לפי הסדר: 0.2 µL של flour-azide, כ-0.58 µL של TCEP, ו-3.38 µL של TBTA. ערבב באמצעות וורטקס (Vortex). הוסף 1.14 µL של נחושת(II) סולפט פנטהידרט כדי להתחיל את התגובה.

ערבבו קצר במערבל (Vortex) והדgridיגו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. הוסיפו 50 µL של 2X SDS sample buffer כדי לעצור את התגובה. הריצו את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE, וכשחזית הצבע תגיע לסוף הג'ל, המשיכו להריץ את הג'ל למשך חמש דקות נוספות כדי להבטיח שכל עודפי ה-flour-azide שלא הגיב יצאו לחלוטין מהג'ל.

לאחר שטיפת כל שאריות ה-flour-azide, הניחו את הג'ל על פלטת זכוכית וסרקו אותו באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי, בהתאם להוראות היצרן. לצורך הצמדת תג biotin, השתמשו בכמות המקסימלית של ליזאטים של תאים לאחר נרמול חלבונים, כך שכל הדגימות יהיו בנפח זהה. בצעו Preclear לליזאטים על ידי הוספת כל דגימה לשפופרת חדשה, המכילה 50 microliters של חרוזי streptavidin agarose בקיבולת גבוהה שנשטפו מראש.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C תוך כדי סיבוב. השקיפו את החרו지를 באמצעות סרכזגה. העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה למיקרוסנטריפוגה על קרח, והשליכו את החרוזים.

עבור כל 500 µL של ליזט, הוסף את הרכיבים הבאים: 1.38 µL של biotin-azide, 5.5 µL של TCEP ו-32.5 µL של TBTA. ערבב באמצעות וורטקס. הוסף 11 µL של נחושת גופית פנטהידרט (copper sulfate pentahydrate) לכל 500 µL של ליזט וערבב קצרות בוורטקס.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו ארבעה נפחים של אצטון מהנפח של הדגימה, מקורר ל-20 °C, ערבבו את הדגימות במערבל vortex, ודגרו למשך לילה ב-80 °C, כדי להשקיע את החלבונים לחלוטין ולהסיר biotin-azide שלא הגיב. למחרת, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 17,000 x g למשך 15 דקות ב-4 °C כדי להוביל למשקע של החלבונים שהושקעו.

שאבו את העילאי לחלוטין, הוסיפו 150 µL של PBS pH 7.4 ו-1% SDS לכל דגימה, והמיסו מחדש את החלבונים באמצעות סוניקציה. הוסיפו 600 µL של PBS לכל דגימה כדי לדלל את ריכוז ה-SDS ל-0.2%, ולאחר מכן העבירו את הדגימה לפקום חדש המכיל 30 µL של חרוזי streptavidin agarose בקיבולת גבוהה שנשטפו מראש. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C תחת סיבוב.

לאחר שעה, השקיעו את החרוזים באמצעות צנטריפוגציה ב-1000 x g למשך שלוש דקות. שאבו והשליכו את העילאי, המכיל חלבונים שאינם קשורים. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר שטיפה לחרוזים, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר תחת סיבוב.

סבבו במערך צנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון (supernatant), ושטפו שוב עם תמיסת שטיפה. לאחר השטיפה הסופית, שאבו את תמיסת השטיפה לחלוטין מהחרוזים, והוסיפו 30 µL של 2X SDS sample buffer. דגרו במשך חמש דקות בבלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C, כדי לשחרר את החלבונים מהחרוזים.

סבבו את החרוזים בצנטריפוגה ב-13000 x g בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. שאבו בזהירות את באפר הדגימה, המכיל חלבונים, מהחרוזים עבור SDS-PAGE. הוויזואליזציה של החלבונים לאחר סימון בתג פלואורסצנטי מוצגת בג'ל סרוק פלואורסצנטי זה.

פס the העיקרי של חלבון קישור ספציפי, בכ-35 kilodaltons, מופיע רק בנתיב הגשש (probe lane), ונעלם בנוכחות עודף של התרכובת ההורית. אותו פס של 35 kilodalton נצפה באמצעות צביעה בכסף לאחר biotin pulldown, וזוהה לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסות כחלבון הממברנה VDAC1. זהותו של החלבון אומתה בהמשך באמצעות נוגדן ספציפי ל-VDAC1.

האות קיים בנתיב הגשש (probe lane) ופחית בנתיב התחרות (competition lane). הכללת חלק מהקלט (input fraction) מבטיחה שהנוגדן פועל וניתן לזהות את החלבון המבוקש בליזאט. העלייה הקלה במשקל המולקולרי של דגימות ה-pulldown נובעת מהגשש הקשור באופן קוולנטי.

ההשלכות של ביצוע לא נכון של שלבים מסוימים בפרוטוקול מוצגות כאן. הסרה חלקית של עודפי flour-azide גורמת למריחות שחורות גדולות בתחתית הג'ל שנסרק פלואורסצנטית, בעוד שניקוי מוקדם (preclearing) לא מספק של הליזאטים ו/או שטיפה לא מספקת של החרו지를 גורמים לג'ל צבוע בכסף עם רקע גבוה מאוד. מההתחלה ועד לסיום, ניסוי ה-pulldown אורך יומיים עד שלושה ימים.

לאחר בידוד וזיהוי החלבון מטרה באמצעות ספקטרומטריית מסות או Western blotting, יש לבצע ניסויי תיקוף ספציפיים למטרה כדי להעריך את הרלוונטיות של המטרה לפנוטיפ המושרה על ידי התרופה.