פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את ההרכב של קומפלקסים חלבונים המתאספים באופן ספציפי סביב זוג חלבונים אינטראקטיביים מעניינים באמצעות split-BioID, בדיקת השלמה של שברי חלבון הגורמת לביוטינילציה של חלבון תלוי קרבה בתוך תאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא כגון כיצד קומפלקסים של חלבונים מתחדשים באופן דינמי כדי לווסת פונקציות תאיות שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי קל של קומפלקסים חלבונים ספציפיים להקשר בסביבתם התאית המקורית וברזולוציה גבוהה מאוד.

לניתוח ספקטרומטרי המסה הסופי, יש לבצע את השלבים הבאים בתנאים נטולי קרטין וכל החומרים והריאגנטים צריכים להיות נטולי קרטין ככל האפשר. לאחר שיבוט ה-ORFs של שני חלבונים מעניינים לפלסמיד BioID המפוצל, ביצוע טרנספקציה חולפת ואז הוספת מדיום משלים ביוטין על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. הוסף 1.5 מיליליטר PBS לכל צלחת והשתמש במגרד כדי לקצור את התאים, ואז העביר את התאים לכל מצב לצינור נפרד של 15 מיליליטר וסובב את הצינורות בכוח הכבידה פי 1, 200 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנטים והקפיא את הכדורים בחנקן נוזלי. לאחר מכן אחסן את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. להכנת ליזאטים של תאים השתמש במיליליטר אחד של מאגר ליזה RT כדי להשעות מחדש את הכדורים.

לאחר מכן העבירו את התאים דרך מחט בגודל 25 10 עד 20 פעמים. לאחר מכן סוניקציה של הדגימות. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של 20% טריטון X-100 לכל 900 מיקרוליטר של ליזט סוניקטיבי משוחזר לריכוז סופי של 2%הוסף 2.3 מיליליטר של 50 מילי-מולרי טריס, pH 7.4, למיליליטר ליזאט כדי להתאים את ריכוז ה-NaCl ל-150 מילי-מולרי לקשירה לחרוזי סטרפטווידין.

לאחר מכן מחלקים את הליזטים המותאמים לצינורות של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה אותם בכוח הכבידה פי 16, 000 וארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. העבירו את הסופרנטנטים לצינור של 15 מיליליטר ושמרו 50 עד 100 מיקרוליטר כחומר קלט. כדי לבצע משיכת סטרפטווידין, עבור כל מצב העבירו 200 מיקרוליטר של מתלה חרוזים מגנטי בשילוב סטרפטווידין לצינור של 1.5 מיליליטר.

הנח את הצינורות על מתלה מגנטי והמתן כדקה לפני הסרת מאגר האחסון. עם מיליליטר אחד של מאגר שיווי משקל, שטפו את החרוזים על ידי ערבוב עדין. לאחר מכן שלח באופן שווה את החרוזים המאוזנים במספר הצינורות הדרוש והנח אותם בחזרה על המתלה המגנטי.

לאחר הסרת מאגר שיווי המשקל, השעו מחדש כל סט חרוזים בכמויות שוות של הליזטים התאים המתאימים. לאחר מכן דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב למשך הלילה. למחרת הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי.

המתן עד שהחרוזים נדבקים לצד הצינורות והעביר את הסופרנטנטים לצינור של 15 מיליליטר המסומן כזרימה. עם 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד, השעו מחדש את החרוזים בכל צינור ושלבו כל סט של חרוזים תלויים המתאימים למצב אחד בצינורות של 1.5 מיליליטר. השתמש במיליליטר אחד של מאגר כביסה אחד כדי לשטוף את החרוזים פעמיים על גלגל מסתובב למשך שמונה דקות.

לאחר מכן בצע שתי שטיפות כל אחת עבור חוצצי כביסה שתיים, שלוש וארבע. כדי לוודא שמאגר הכביסה מסולק לחלוטין לאחר שלב הכביסה האחרון, לאחר הסרת רוב הסופרנטנט סובב את הדגימות. לאחר מכן החזירו אותם לרשת המגנטית והסירו את המאגר שנותר.

הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים ואז דגר את הדגימות ב-98 מעלות צלזיוס למשך רבע שעה והעביר מיד את הצינורות למתלה המגנטי. העבירו את הדגימה המנופחת לצינור טרי ואחסנו את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. עבור כל דגימת קלט הכינו דגימת PAGE על ידי ערבוב כמויות שוות של חלבון עם הנפח המתאים של מאגר טעינה 3X SDS בנפח כולל של 28 מיקרוליטר.

לאחר מכן הכן דגימות PAGE על ידי ערבוב של חמישה מיקרוליטר מכל דגימת פליטה עם 2.5 מיקרוליטר של מאגר טעינה 3X SDS. טען את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS. לאחר מכן המשך לאלקטרופורזה וכתמים מערביים על פי פרוטוקול הטקסט.

כדי לבצע ניתוח SDS-PAGE לטרשת נפוצה, הוסף 6.25 מיקרוליטר של מאגר דגימה 4X ל-18.75 מיקרוליטר מכל דגימת פליטה והפעל את הדגימות על ג'ל SDS יצוק מראש של ארבעה עד 20% עד שהן נודדות שניים עד שלושה סנטימטרים לתוך הג'ל. בצלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר, מכתימים את הג'ל בכתם קולואידי Coomassie Brilliant Blue G250. השתמש באזמל נקי כדי לכרות את כל הנתיבים עבור כל דגימה, למעט רצועת הסטרפטווידין, והעביר את הרצועות שנכרתו לצינורות של 1.5 מיליליטר לניתוח טרשת נפוצה.

בנוסף לחלבונים ביוטיניליים אנדוגניים שזוהו בניסוי BioID, פיצול BioID, הרצועות העיקריות הנוספות שנצפו על ידי הכתם המערבי הן חלבוני ההיתוך שעברו ביוטינילציה עצמית, מה שמצביע על כך ששני החלבונים שנבדקו, בדוגמה זו Ago2 ו-TNRC6C או Ago2 ו-Dicer קיימו אינטראקציה בתאים. בנוסף, התוצאות של הכתם המערבי מצביעות על כך שחלבון היתוך NBirA*Ago2 בשילוב עם CBirA*היתוך ל-TNRC6C או Dicer יעיל יותר מהשילובים ההפוכים שבהם CBirA*Ago2 מזווג ל-NBirA*היתוך של שני החלבונים האחרים. יתר על כן, ההפעלה הייתה ספציפית, מכיוון שאף אחד מהיתוך ה-CBirA*GFP לא יכול היה להפעיל את חלבון ההיתוך הבקרה NBirA*GFP לרמות ניכרות.

בעת ביצוע הבידוד בפעם הראשונה, יש לנתח את כל שלבי הטיהור על ידי כתמים מערביים. כפי שמודגם כאן, הקישור לחרוזים צריך להיות כמעט כמותי ולמעשה אין להבחין בדליפה בשטיפות. כאשר החומר המוסר מופעל על ג'ל מוכתם של Coomassie לאחר ביטוי חלבון ומושרה ביוטינילציה, הרצועה החזקה ביותר שנצפתה פועלת בכ-17 קילודלטון ומתאימה לסטרפטווידין מונומרי.

אזור נתיב הדגימה מעל רצועת הסטרפטווידין במעלה באר הטעינה נכרת בדרך כלל לצורך ניתוח MS. בעת יישום הליך זה על שני חלבונים נתונים, חשוב לבדוק שילובים שונים של חלבוני היתוך. ואכן, לעתים קרובות ראינו שיעילות הביוטינילציה הכוללת יכולה להיות תלויה מאוד באיזה חלבון מצורף לשברי BirA הסופיים N או C.

חשוב באותה מידה להוסיף לפחות ניסוי בקרה שלילית אחד של פיצול BioID. לדוגמה, על זוג חלבונים המקיימים אינטראקציה שאינם קשורים לזוג החלבון המעניין. בעקבות הליך זה וספקטרומטריית מסה, יש ליישם ניתוח חישובי כדי לדרג את הפפטידים שזוהו כנגד ניסויי הבקרה השליליים.

אנו משתמשים, למשל, בתוכנות MaxQuant ו-Perseus שפותחו על ידי מעבדות קוקס ומאן במינכן, גרמניה.