Name: לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: למד לדמיין ולכמת אינטראקציות חלבון-DNA בתאי Escherichia coli חיים באמצעות מיקרוסקופיית מיקום מופעלת-אור ומעקב מולקולה בודדת. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של פעילות תיקון DNA ברמת התא הבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים ג&#39;סטין פינקני ויוהנס Hohlbein לעזרה בבנייה של מיקרוסקופ העידו ושיימוס הולדן עבור תוכנת הלוקליזציה. רודריגו רייס-למוט הוא הודה למתן א זן חיידק. המחקר מומן על ידי הבריאות-F4-2008-201,418 נציבות האירופיות תכנית המסגרת השביעית גרנט FP7/2007-2013, בריטניה ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה המועצה למחקר גרנט BB/H01795X/1, והמועצה האירופית למחקר גרנט 261,227 לANK. DJS מומן על ידי Wellcome Trust Program גרנט WT083469. SU נתמכה על ידי דוקטורט MathWorks.

<ol><li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriedberg%2C+EC+%22DNA+Repair+and+Mutagenesis%22">DNA Repair and Mutagenesis</a>. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li>
<li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAOSTORM%3A+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li>
<li>Wieser, S., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do%27s+and+Don%27t%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li>
<li>Arnauld, S., Nicolas, B., Hervé, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2008.128">http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2008.128</a> (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li>
<li>Elmore, S., Müller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li>
<li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו דנים כמה שיקולים מרכזיים להצלחה של הניסוי. בחירה וביטוי של חלבון היתוך הניאון: יש לוח גדול של חלבוני ניאון photoactivatable וphotoswitchable 17. הבחירה הספציפית תלויה במאפייני מיקרוסקופ, במיוחד הלייזרים והמסננים זמינים. השילוב של 405 ננומטר ו561 ננומטר הוא אידיאלי עבור חלבוני ניאון photoactivatable משותפים. בחרנו PAmCherry 6 כי זה monomeric ולא הראיתי צבירה בתאים. יתר על כן, photoactivation בלתי הפיך מאפשר לספור את מספר fluorophores הופעל כדי למדוד מספרי עותק חלבון לכל תא. במקום להביע את חלבון ההיתוך מפלסמיד, אנו מעדיפים החדרה הכרומוזומלי של הגן המקודד לחלבון ההיתוך במוקד wild-type. זה מבטיח החלפה של החלבון של עניין להשלים עם הניאון version ושמירה על רמת ביטוי wild-type. שיעור photoactivation: חשוב להתאים את קצב כזה photoactivation כי בממוצע פחות ממולקולה אחת לכל תא נמצאת במצב הניאון בכל מסגרת של הסרט. זה תלוי בעוצמת 405 ננומטר ומספר המולקולות עזב כדי להיות מופעל. בצפיפויות הדמיה נמוכות מאוד, עם זאת, לא כל המולקולות יהיו צילמו לפני סוף הסרט או סרטים ארוכים מאוד צריכים להיות נרכשים. מספר המסגרות שנרשמו לכל סרט תלוי במספר העותק של חלבוני היתוך לכל תא וכל החיים הממוצעים photobleaching של PAmCherry בתנאי העירור בשימוש. עותק מספר Pol1 הוא ~ 400 מולקולות / הערך הממוצע של התפלגות החיים photobleaching מעריכי תא 1 והיה ~ 4 מסגרות. על ידי הגדלת עוצמת 405 ננומטר בהדרגה, ההפעלה מופצת באופן שווה על פני 10,000 המסגרות של הסרט. לכן, כל תא הוא occupמטען על ידי מולקולות ניאון עבור סכום כולל של ~ 1,600 מסגרות, להבטיח חפיפה מועטת של PSFs וסיבוכים מעקב בסרט של 10,000 מסגרות. עוצמות זמן חשיפה ועירור: בראש ובראשונה, זמני חשיפה צריכה להיות קצר מספיק כדי להתבונן PSFs החד בתנועה קצת טשטוש. עם זאת, יש לבחור את מסגרת הדולר להניב תנועה מולקולרית נצפית בין מסגרות רצופות מעבר לחוסר ודאות הלוקליזציה, אחרת פוטונים חיוניים מבוזבזים על ידי oversampling המסלול. התנועה של מולקולות מאוגדים יש נדגם במרווחי זמן ארוך מספיק כדי להיות מובחן מהתנועה הנראית של מולקולות מחויבות בשל אי וודאות הלוקליזציה באופן ברור. כשהזמן החשיפה מוגדר, צריכה להיות מותאמת עוצמת כוחות הביטחון הפלסטיניים. דיוק הלוקליזציה של כוחות הביטחון הפלסטיניים עולה עם מספר הפוטונים זוהו על משך הזמן של מסגרת. עוצמות עירור גבוהות יותר להגדיל את bu שיעור פליטת הפוטוןt גם שיעור photobleaching ואות רקע. השתמש בעוצמת העירור הנמוכה ביותר שנותנת את דיוק הלוקליזציה הרצויה. לPol1-PAmCherry בחרנו 15.26 msec / מסגרת ו3.5 עירור mW 561 ננומטר (400 W / 2 סנטימטר). זה חשוב כדי לאשר תא כדאיות לתנאי הדמיה מסוימים על ידי ניטור צמיחת תאים ומורפולוגיה לפני ואחרי רכישת נתונים (ראה מידע נוסף בUphoff et al. 7). Pol1 מפגין זמן מחייב של ~ 2 שניות למצע ה-DNA ומרווחות in vivo 7, ולכן אנו מצפים שרוב המולקולות להיות גם במדינה המאוגדת או לא מאוגדת עבור כל משך הזמן של מסלול. מולקולות Bound מופיעות בעצם נייחות כי יש לי אתרי כרומוזום מקדם הדיפוזיה כמה סדרי גודל נמוך יותר (~ 10 -5 מיקרומטר 2 / sec, אלמור ואח&#39;. 18) מאשר דיפוזיה Pol1 בציטופלסמה (~ 1 מיקרומטר 2 </sעד&gt; / sec). ניתוח דיפוזיה: * D מקדם הדיפוזיה לכאורה מחושב מMSD של שירים בודדים, בממוצע למינימום של 4 שלבים (5 מסגרות) כדי להפחית את השגיאה הסטטיסטית. שים לב ש~ 75% ממולקולות אקונומיקה בתוך פחות מ -5 מסגרות לתנאי ההדמיה מתוארות. מסלולים קצרים כל כך לא מספקים ודאות סטטיסטית מספיק כדי להבחין מולקולות מאוגדת ומאוגדות. עם זאת, שברים היחסי של מולקולות מאוגדים ולא מאוגדים שידווחו על פעילות החלבון אינם תלויים במספר הכולל של מסלולים מנותחים. זה שימושי כדי להסביר את שגיאת לוקליזציה כוחות הביטחון הפלסטיניים (loc σ) בחישוב * D בגלל חוסר הוודאות מוסיפה צעד אקראי לכאורה זה לזה לוקליזציה של מולקולה 15. כדי לשפר את הסיווג של מולקולות מאוגדים ולשדר, אנו ממליצים על חישוב D בוט *שעות מההתקות בשלב יחיד וההתקות לאורך הזמן של שתי מסגרות. אז זה אפשרי לקבוע שני ספים נפרדים D *: * D (15 אלפיות שני) &lt;0.15 מיקרומטר 2 / sec ו* D (30 אלפיות שני) &lt;0.075 מיקרומטר 2 / sec. שים לב ש* D הוא מקדם הדיפוזיה ברורה שהוא מושפע כליאת תא של המסילה ותנועת טשטוש עקב דיפוזיה בזמן החשיפה. כדי לחלץ מקדמי דיפוזיה משוחד מדויקים, היא הוכיחה שימושית כדי להשוות את ההצעה שנצפתה לנתונים מלאכותיים המבוססים על 5,7 מודל תנועה הבראונית סטוכסטיים. גם נתוני סימולציה יכולים לשמש כדי לבדוק את נהלי ניתוח נתונים. יישומים אפשריים של שיטה זו: אנחנו תיארתי גישה כללית המאפשר הדמיה וכימות אינטראקציות-DNA חלבון in vivo על ידי השינוי בניידות של חלבון על כריכה לכרומוזום. הפעילויות של ה-DNA אומחייב חלבוני RNA המעורבים בתיקון, שכפול, שעתוק, ותחזוקת כרומוזום לכן יכולים להיות מיושמים בזמן אמת ברמת התא הבודד עם רזולוציה מרחבית מתחת לגבול ההשתברות האופטית. מעקב מולקולה בודדת photoactivated מרחיב שיטות מעקב קונבנציונליות, כי הם מוגבלים לכמה מולקולות שכותרת לכל תא. שיטה חלופית המודדת דיפוזיה מולקולרית in vivo היא שחזור הקרינה לאחר Photobleaching (FRAP). בעוד FRAP הוא שימושי מאוד למדידת מאפייני הדיפוזיה העולמית בתאים גדולים, הוא מוגבל ביכולתה כדי לפתור כמה מינים מולקולריים עם mobilities שונה בסביבה מרחבית הטרוגנית, במיוחד לתאי חיידקים קטנים. יש לנו ליישם מולקולה בודדת photoactivated מעקב כדי למדוד את פעילות ה-DNA מחייבת ומגוירים subcellular של מגוון רחב של חלבונים שונים בE. coli כולל Pol1, האנזים DNA, חלבון ה-FIS, ה-DNAפולימראז III 7, כמו גם תחזוקה המבנית של חלבוני כרומוזומים MukB, E, ו-F 19. אנו צופים את השיטה גם יכולה להיות מותאמת לסוגי תאים אחרים.

פרוטוקול זה מתאר מדידה הישירה של אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חי Escherichia coli. הטכניקה מנצלת את השינוי במקדם הדיפוזיה של חלבון יחיד שכותרתו fluorescently כפי שהוא קושר את כרומוזום (איור 1). כדי להדגים את השיטה שאנו משתמשים DNA פולימרז (Pol1), חלבון קושר DNA טיפוסי שממלא את פערי דנ&quot;א בשכפול גדיל מפגר ומסלולי תיקון כריתת 1. כניסתו של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר מאפשרת הדמיה של מבנים מולקולריים בתאים עם רזולוציה ננומטר. Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) מעסיק חלבוני ניאון שיכול להיות מופעל ממדינה חשוכה ראשונית למצב ניאון (איור 2). רק קבוצת משנה של כל המולקולות שכותרתו מופעלת בכל עת כדי לקבוע את עמדותיהם באופן רציף, באופן בלתי תלוי tהוא בסך הכל ריכוז של מולקולות שכותרתו במדגם 2. דיוק הלוקליזציה לכל מולקולה בעיקר תלוי בגודל של פונקצית התפשטות נקודת הניאון (כוחות הביטחון הפלסטיניים), מספר הפוטונים שנאספו, ואות רקע 3. יישומים של שיטה זו רבים להתמקד בויזואליזציה המשופרת של מבנים הסלולר. ההבנה שניתן לשלב PALM עם מולקולה בודדת מעקב 4 נפתחו אפיקים חדשים לעקוב באופן ישיר את התנועה של מספרים שרירותיים של חלבונים שכותרתו בתאים חיים. רגישות מוגברת והחלטה זמנית של מיקרוסקופים הקרינה מאפשרים כעת מעקב של חלבוני ניאון לשדר אחת בציטופלסמה חיידקי 5. כאן, אנחנו מעסיקים PAmCherry, חלבון פלואורסצנטי מהונדס שאופן בלתי הפיך ממיר ממדינת nonfluorescent ראשונית למצב ניאון על הקרנה עם 405 ננומטר אור 6. fluorophores PAmCherry הופעל יכול להיות תמונהד על ידי עירור ב 561 ננומטר ולעקוב אחריו במשך כמה מסגרות עד photobleaching. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה לזיהוי אירועים-DNA מחייבת חולפים של חלבונים בודדים באמצעות שילוב של Pol1 וPAmCherry. טיפול בתאים עם methanesulfonate מתיל (MMS) גורם נזק מתילציה דנ&quot;א שהפך למצעי DNA ומרווחים על ידי אנזימים לתיקון בסיס כריתה. השיטה שלנו מראה ברורה מחייבת של מולקולות Pol1 אחת בתגובה לנזק MMS 7.

<table><tbody><tr><td>E. coli זן הנושא החדרה כרומוזומלית לחלבון</td><td></td><td></td> היתוך קושר DNA PAmCherry שנוצר על ידי חומצות אמינו <td>MEM רקומבינציה של למבדה-אדום</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td>תוסף בינוני מינימלי</td></tr><tr><td>ויטמינים MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11120-052</td><td>תוסף בינוני מינימלי</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>161-3100</td><td>כיסויי מיקרוסקופ מוסמכים בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>מס' 1.5 עובי</td><td>מנזל</td><td>BB024060SC</td><td>להסיר חלקיקי רקע על ידי חימום שקופיות בתנור בטמפרטורה של 500 מעלות; C למשך שעה</td></tr><tr><td>אחת מתיל מתאן סולפונאט (MMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129925</td><td>זהירות:</td></tr><tr><td>מערך PALM</td> רעיל <td>שנבנה</td><td></td> בבית <td>מתואר ב-Uphoff et al.7</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>לניתוח נתונים והדמיה</td></tr><tr><td>תוכנת לוקליזציה</td><td>כתובה בהתאמה אישית, זמינה באינטרנט</td><td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td><td>חבילת התוכנה MATLAB ו-C++ הניתנת להתאמה לניתוח לוקליזציה. צטט את Holden et al.13 אם נעשה בו שימוש בפרסום.</td></tr><tr><td>תוכנת מעקב</td><td>זמינה באינטרנט</td><td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td><td>MATLAB על ידי בלייר ודופרסן. ציטוט קרוקר & Grier12 אם נעשה בו שימוש בפרסום.</td></tr></tbody></table>

לדמיין אינטראקציות החלבון-dna בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

אינטראקציות החלבון-DNA הן בלב של תהליכים תאיים רבים יסודיים. לדוגמא, שכפול הדנ&quot;א, השעתוק, ותיקון, והארגון של כרומוזום נשלטים על ידי חלבוני קושרי DNA שמזהים מבני DNA ספציפיים או רצפים. בניסויים במבחנה סייעו לייצר מודלים מפורטים עבור הפונקציה של סוגים רבים של חלבוני ה-DNA מחייבת, ובכל זאת , המנגנונים של תהליכים אלה והארגון שלהם בסביבה המורכבת של התא החי המדויקים יישארו הרבה פחות מובן. לאחרונה הציגו שיטה לכימות פעילות ה-DNA-תיקון בתאי חיידקי Escherichia חיים באמצעות photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת. הגישה הכללית שלנו מזהה אירועים-DNA מחייבת פרט על ידי השינוי בניידות של חלבון יחיד על קשר עם כרומוזום. את החלק היחסי של מולקולות מאוגדים מספק מדד כמוני ישיר לפעולת החלבוןivity ושפע של מצעים או אתרי קישור ברמת התא הבודד. כאן, אנו מתארים את הרעיון של השיטה ונדגים הכנת מדגם, רכישת נתונים, ונהלי ניתוח נתונים.

הרעיון של מולקולה בודדת photoactivated מעקב כדי לחקור אינטראקציות-DNA חלבון in vivo מודגם באיור 1. חלבוני היתוך PAmCherry מזוהים בE. החי coli תאים באופן רציף על ידי photoactivating מולקולות בודדות stochastically עם ננומטר אור 405 בתדר של מולקולה פחות מאחוז אחד לכל תא בכל פעם. מולקולות הופעל הם צילמו תחת עירור ננומטר הרציף 561. תנועה מולקולרית בתא יכולה להיות במעקב על ידי חיבור מגויר סמוך בסדרה של מסגרות עד photobleaching בלתי הפיך. בגלל דיפוזיה של חלבוני ה-DNA מחייבת מואטת על כריכת כרומוזום, מקדם הדיפוזיה לכאורה D * המתקבל למסלול ישירות מדווח על אינטראקציות החלבון-DNA בודדים. איור 2 מדגים photoactivation של חלבוני היתוך Pol1-PAmCherry בא &#39;בשידור חי תאי coli. השפעת עוצמת 405 ננומטר on הצפיפות של מולקולות ניאון שניתן לראות באיור 4. שים לב שהצפיפות אינה נקבעה אך ורק על ידי עוצמת 405 ננומטר אלא גם במספר המולקולות שאינן זמינים עבור הפעלה; הבריכה של מולקולות הנותרות יאזל במהלך סרט PALM. ניתוח לוקליזציה מתבצע לכל מסגרת של סרט PALM כפי שמודגם באיור 5. מדדנו את רמת דיוק הלוקליזציה באמצעות מולקולות נייחות בתאים קבועים או מולקולות מאוגדות בתאים חיים. הגדרות הרכישה שלנו נתנו דיוק לוקליזציה של loc = 40 ננומטר σ, בהסכם עם התחזית התיאורטית 3. מגוירי Pol1 וכתוצאה מכך לכבוש את האזור המרכזי של התא (איור 6 א), באופן רחב משחזר ארגון המרחבי של א &#39; coli nucleoid 7. רוב Pol1 עוקב בתאי ניזוק להציג difהיתוך כפי שמוצג באיור 6 ג. תא טיפוסי מכיל כמה מאה מסלולים Pol1 (איור 6 ד &#39;), עולים בקנה אחד עם מספר העותק של כ 400 מולקולות Pol1 לE. . תא coli 1 נתוני 6B ו6E-F לספק הדרכה בבחירת חלון מעקב פרמטר מתאים - אם חלון המעקב הוא גדול מדי, מולקולות שונות נוטה יותר להיות בטעות קשורה למסלול, אם חלון המעקב הוא קטן מדי, מסלולים בצעדים ארוכים יותר יהיה מפוצל. עקומת MSD לPol1 עולה באופן ליניארי לפעמים בפיגור קצר ומרווה בזמנים השהיה ארוכות יותר בשל תא כליאה (איור 6G). סוגים שונים של תנועה מולקולרית יכולים להיות מזוהים על ידי ניתוח MSD. תנועת בימוי נותנת עקומת parabolic; תנועה הבראונית מאופיינת בקו ישר; עקומת הדיפוזיה מוגבלת מגיעה לרמה; קיזוז של עקומת MSD עבור חלקיקים נייחים מייצגת את lחוסר ודאות ocalization (איור 6 שעות). ניתן למצוא מידע נוסף על טיפים למעקב ופתרון בעיות חלקיק יחיד בArnauld et al. 16 אנחנו מוחלים בעבר את השיטה כדי למדוד את פעילות ה-DNA-תיקון Pol1 בתגובה לנזקי DNA אקסוגני אלקילציה 7. D היסטוגרמה * של Pol1 עוקבת בתאי ניזוק מראה אוכלוסייה דומיננטית של לשדר מולקולות (איורים 7 א-C). חלק קטן של מולקולות Pol1 כפותות .2.7% הוא סביר מעורב בשכפול גדיל מפגר ותיקון של נזק לדנ&quot;א אנדוגני. תחת נזק מ&quot;מ MMS רציף 100, האוכלוסייה של מסלולים עם D * ~ 0 מיקרומטר עליות 2 / sec ל13.8% (איור 7D). מסלולים אלה מייצגים מולקולות Pol1 בודדות ביצוע סינתזת תיקון דנ&quot;א כדי למלא פערי נוקלאוטיד יחיד כחלק ממסלול תיקון בסיס כריתה. עמדותיהם של מסלולים כרוכים מראות את מיקומם של הפרטנזק לדנ&quot;א ותיקון אתרים (איור 7E-F). <img alt="איור 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> איור 1. ייצוג גרפי של השיטה. () PAmCherry החלבון פלואורסצנטי ניתן photoactivated ממדינת nonfluorescent ראשוני על הקרנה עם 405 ננומטר אור. המדינה בהירה היא נרגשת ב561 ננומטר ופולטת הקרינה סביב 600 ננומטר עד מלביני fluorophore באופן בלתי הפיך. (ב) שליטה על שיעור photoactivation מאפשרת הדמיה רק חלבון יחיד הופעל stochastically היתוך PAmCherry לכל תא בכל עת תוך הבריכה הגדולה באופן שרירותי של מולקולות שעדיין לא הופעלו או כבר מולבנת נותר במצב חשוך. (ג) עמדתה של מולקולת הניאון נקבעה ממרכז כוחות הביטחון הפלסטיניים וTR המבודדיםacked במשך כמה מסגרות עד photobleaching. מסלולים (ד &#39;) של מולקולות רבות נרשמים באופן רציף. (EF) האינטראקציה של חלבון קושר DNA עם רצף יעד כרומוזומליות או מבנה עוצרת את תנועת diffusive האקראית. מולקולות מאוגדים ולא מאוגדים נבדלות במקדם דיפוזיה לכאורה D * חולץ משירים בודדים. את החלק יחסי של מולקולות מאוגדים וכתוצאה מכך נותן מדד כמוני לפעילות של חלבון ה-DNA מחייבת in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. Photoactivation של Pol1-PAmCherry בא &#39;בשידור חי תאי coli. ברים סולם: 1 מיקרומטר. שרטוטים מוצגים מתחת לכל פנל. (<html> א) מועבר בתמונת מיקרוסקופ אור של תאים משותקים על כרית agarose. (ב) Phototactivating fluorophore PAmCherry אחת בתא אחד. (ג) שיעור photoactivation גבוה יותר מגדיל את מספר מולקולות ניאון. הקרינה המשולבת PAmCherry מסרט PALM (ד &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> איור 3. תרשים סכמטי של הרשת PALM מינימאלית לחלבוני photoactivating והיתוך PAmCherry ההדמיה D1:. מראה Dichroic (למשל 550 ארוך לעבור ננומטר). D2: מראה Dichroic (למשל 570 ארוך לעבור ננומטר). L1: עדשת collimating. L2: עדשת TIR. L3: עדשת צינור.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. נציג תמונות מסרט PALM עם 15.26 msec / מסגרת סולם ברים:. 1 מיקרומטר. (א) המועברים בתמונת אור של תאים משותקים על כרית agarose. (ב) תמונת רקע כהה שנמדדה על המצלמה EMCCD עם הלייזרים כבויה. תמונה (C) עירור רקע תחת עירור 561 ננומטר רציף לפני photoactivation. עוצמת ננומטר (DF) מוגבר 405 מובילה לשיעורים גבוהים יותר של photoactivation PAmCherry, צילמו תחת עירור ננומטר הרציף 561. האזורים התאגרפו מוצגים מוגדל להלן. (ד &#39;) בעצימות נמוכה ננומטר 405 פעילים (&lt;μW 1) מעט מאוד מולקולות ניאון לFOV. (ה) בינונית 405תוצאות photoactivation עוצמת ננומטר (~ 2 μW) בצפיפות כוחות הביטחון הפלסטיניים טובה ללוקליזציה ומעקב וניתוח. העצמה גבוהה 405 ננומטר (~ 10 μW) (F) מפעיל מולקולה יותר מאחד ניאון בחלק מהתאים, אשר מטשטשת לוקליזציה ומעקב וניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. איור של ניתוח הלוקליזציה. ברים סולם: 1 מיקרומטר () סינון הלהקה עובר מסיר רעש פיקסל מזויף ומשטח הדרגתיים בעוצמה על פני שדה הראייה.. (ב) PSFs מועמד מזוהה בתמונה המסוננת בהתבסס על סף המוגדרים על ידי משתמש, כי הוא נבחר כדי למזער לתגליות שליליות חיוביות ושקר שקר. Threshold תואם את עוצמת המינימום של פיקסל מועמד מחולקת בסטיית תקן הרקע (יחס אות לרעש, יחס אות לרעש). פיקסל המקומי הבהיר שעובר את הסף משמש כניחוש ראשוני לוקליזציה (צלב כתום) לשני ממדים בכושר גאוס סגלגל (C). סולם ברים: 0.5 מיקרומטר. לוקליזציה וכתוצאה מכך הרזולוציה סופר (צלב כחול) יש דיוק ממוצע של loc σ = 40 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. איור 6 איור של ניתוח מעקב סולם ברים: 1 מיקרומטר. (א) כל הגרסות המגוירות המזוהה של Pol1-PAmCherry בתא ירושלים. (ב) מספר המסלולים לזהותאד בתא, למשל כפונקציה של חלון המעקב. חלונות מעקב קטנים לפצל מסלולי מולקולה, מה שמוביל לartifactual מספר גבוה של מסלולים. הקו המקווקו מציין הבחירה שלנו לפרמטר חלון מעקב (0.57 מיקרומטר, 5 פיקסלים) - זה נותן פשרה טובה בין איתור ההתפלגות המלאה של צעדים ושמירה על המסלולים של מולקולות שונות בשלמותה. (ג) אחר דוגמא של מולקולת Pol1-PAmCherry אחת. (ד) כל המסלולים נמדדו מוצגים בצבעים אקראיים. ממצאי מעקב (ה) אם חלון המעקב נבחר גדול מדי (כאן 0.8 מיקרומטר, 7 פיקסלים) או הצפיפות של PSFs לכל מסגרת היא גבוהים מדי. (F) התפלגויות מצטברת של אורכי צעד לחלונות מעקב: 0.34 מיקרומטר (3 פיקסלים, קו אדום), 0.57 מיקרומטר (5 פיקסלים, קו כחול), ו0.80 מיקרומטר (7 פיקסלים, קו ירוק). שימו לב ש0.34 מיקרומטר חלון המעקב חותך את צעדים ארוכים יותר מ0.34 מיקרומטר אשר באופן ברורחותך את ההתפלגות המלאה של צעדים. חלון המעקב 0.57 מיקרומטר מזהה כמעט אותה ההתפלגות של צעדים כפי שעושה 0.80 מיקרומטר חלון המעקב. עקומה (G) MSD מציגה דיפוזיה מוגבלת של Pol1. עקומות (H) סכמטי MSD לתנועה מכוונת, תנועה בראונית, דיפוזיה מוגבלת, וחלקיקים נייחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. מדידה ישירה של פעילות תיקון DNA של Pol1 בא &#39;בשידור חי . Coli תאי סולם ברים: 1 מיקרומטר. (א) היסטוגרמה של * D מקדם הדיפוזיה לכאורה לכל המסלולים של 4 או יותר שלבים בFOV של תאים שלא נפגעו (N = 4,162 שירים). האוכלוסייה של מולקולות מסווגות כb<html> ound מסומן באדום. מסלולים (BC) של Pol1-PAmCherry מוצגים בתמונה מיקרוסקופית אור מועבר. מסלולים מסווגים כמחויב על פי מקדם הדיפוזיה שלהם מוצגים באדום. (ד) D * היסטוגרמה למסלולי Pol1 נמדדו בתאים משותקים על כרית agarose עם 100 מ&quot;מ MMS וטופחו במשך 20 דקות לפני ההדמיה (N = 2,128 שירים). האוכלוסייה של מולקולות מאוגדים העוסקות בתיקון DNA מוצגת באדום. (EF) Pol1-PAmCherry עוקב על תמונה במיקרוסקופ אור מועברת מראה את המסלולים של אירועי תיקון DNA Pol1 אחת באדום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="וידאו 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> סרט 1. בניית התקנת PALM העידו.&quot;Target =&quot; _blank JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בוידאו.

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציג באופן ויזואלי ולכמת ישירות את הפעילות של חלבוני קשירת DNA בתאי חיידקים חיים. דבר זה מושג על ידי הדמיה של תאים המבטאים חלבון פלואורסצנטי המופעל באור (photo activated), המהודבך לחלבון קשירת DNA רצוי. השלב השני של הפרוצדורה הוא רכישת סרט של חלבונים בודדים המופעלים באור בזמן שהם נדגמים.לאחר מכן, הנתונים מנותחים כדי לקבוע את מיקומי החלבונים ולעקוב אחר חלבונים בתוך תאים בודדים. אירועי קישור ל-DNA מזוהים על ידי שינוי במקדם הדיפוזיה של חלבונים בודדים כאשר הם באים במגע עם כרומוזומים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק מדד כמותי של אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA ברמת התא הבודד, על ידי ספירת מספר החלבונים הקשורים והחלבונים המדיפים לכל תא.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון שיעורי תיקון in vivo וההפצה המרחבית של אתרי התיקון. כעת נדגים את השיטה על ידי מדידת פעילות התיקון של DNA polymerase one בתאי e coli חיים. ראשית, הכינו זכוכית כיסוי ללא חלקיקים פלואורסצנטיים ברקע בתנור בטמפרטורה של 500 °C למשך שעה אחת. שרפו מלאי של זכוכית כיסוי בעובי מספר 1.5, ואשרו אותם בטמפרטורת החדר בתוך נייר אלומיניום.הם נשמרים למשך שבועות. כעת, רכזו מיליליטר אחד של E coli מהמושבה AB 1157 poly a PA m cherry בשלב אקספוננציאלי מוקדם בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-2,300 G למשך חמש דקות.הסיר את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משק תאי התאים ב-20 µL של מצע שאריות, וערבב את התאים באמצעות וורטקס עד להמסה. לאחר מכן, הכן תמיסת aros בריכוז של 1.5% עם פלואורסצנציה נמוכה במים מזוקקים. ערבב 500 µL של aeros מומס עם 500 µL של מצע מינימלי בריכוז פי שניים (two x minimal medium) על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה מספר פעמים, עבור ניסויי נזק ל-DNA המשתמשים ב-methyl methane sulfonate או MMS, תוך נקיטת אמצעי זהירות.הוסף 8.3 µL של MMS ל-500 µL של מצע מינימלי לפני הערבוב עם ה-aros, וזאת לפני שהתערובת תתקרר. פרס את התערובת על כיסוי זכוכית (cover slip) שנשרף. פרס אותה באופן אחיד ובמרכז, ללא יצירת בועות.שטחו את הרפידה באמצעות כיסוי זכוכית שרוף שני. לאחר הקירור, הסירו את הכיסוי העליון מהרפידה והוסיפו מיקרוליטר של תרחיף תאים רכז. קבעו את התאים על ידי כיסוי הרפידה בכיסוי זכוכית שרוף חדש ולחיצה עדינה מאוד כלפי מטה.יש לצלם את התאים תוך 45 דקות לפני שיתייבשו. כדי להאריך זמן זה, ניתן לאטום את הרפידה בתוך אטם סיליקון עבור ניסויי נזקי DNA. לפני צילום התאים, יש להדגיר אותם על הרפידה למשך 20 דקות.בתוך מכל עם לחות בטמפרטורת החדר, המיקרוסקופ כולל לייזר להפעלה פוטו-כימית ב-405 ננומטר ולייזר עירור ב-561 ננומטר. רגישות למולקולה בודדת מושגת על ידי עירור פלואורופורים בלבד בתוך שכבה דקה מעל פני זכוכית הכיסוי באמצעות הארה בזווית נטייה גבוהה, ופליטת הפלואורסצנציה מוקלטת על ידי מצלמת CCD בעלת כפל אלקטרונים. מקמו את הדגימה על שולחן המיקרוסקופ והביאו את התאים למיקוד.תחת תאורה של אור תמסור, הגדירו שדה ראייה חתוך כדי להקטין את נפח הנתונים ולהגביר את מהירות הקריאה של המצלמה. הגנו על הדגימה מאור סביבתי והפעילו את הגבר (gain) של מצלמת ה-electron multiplying CCD לצורך זיהוי של פלואורופור בודד. הגדירו את קצב הפריימים ל-15.26 מילישניות לפריים.זה כולל את זמן קריאת המצלמה של 0.26 מילישניות. זמני החשיפה חייבים להיות קצרים מספיק כדי לצפות בנקודות פלורסצנטיות חדות עם מעט טשטוש תנועה. מאידך, יש לדגום את המסלולים במרווחי זמן ארוכים מספיק כדי להבחין בבירור בין המולקולות הקשורות לאלו המפיצות. כעת, הציגו את נתוני המצלמה כדי לבדוק את אות הרקע החשוך.הפעל את הלייזר באורך גל של 561 nanometer ובדוק את אות הרקע של העירור. הפעל את הלייזר באורך גל של 405 nanometer לצורך הפעלה פוטונית של חלבוני איחוד ה-Paul one PA M cherry והעלה את העוצמה עד להופעת נקודות פלורסצנטיות של מולקולות בודדות. כעת כוון את זווית קרן העירור כך שתאיר רק פרוסה דקה של הדגימה.סגרו את פני השטח של כיסוי הזכוכית. שיטה זו מסתמכת על זיהוי ומיקום מדויק של חלבונים פלואורסצנטיים בודדים, לכן התאמה אופטימלית ורגישות של המיקרוסקופ יהיו קריטיות לאיכות הנתונים. לשם כך, מיקדו את קרן הלייזר במישור המוקד האחורי של עדשה בעלת הגדלה של 100x ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.4.הזזת עדשת המיקוד בניצב לקרן מרחיקה את המיקוד ממרכז העדשה, מה שגורם לקרן לצאת מהעדשה בזווית. יש לשאוף לכך שהקרן תמקסם את עוצמת הפלואורסצנציה ותמזער את הרקע. מצאו שדה ראייה חדש של תאים במצב מיקרוסקופיה באור תמסור והתמקדו בתמונה.בצעו צילום במצלמה כדי לתעד את מת outlines של התאים. הפעילו את הלייזר באורך גל של 561 ננומטר והפחילו (bleach) את הפלואורסצנציה העצמית של התאים ואת נקודות הרקע על כיסוי הזריקה למשך מספר שניות.לפני תחילת רכישת הנתונים, התחילו ברכישת סרט PALM תחת עירור רציף של 561 ננומטר. הפעילו את לייזר ה-405 ננומטר והגבירו בהדרגה את העוצמה במהלך הסרט עד להגעה לשער של 1 ווט לסנטימטר רבוע. הימנעו מעוצמות גבוהות יותר של 405 ננומטר הגורמות לאוטופלורסצנציה תאית.שימו לב לצפיפות המולקולות הפלואורסצנטיות. חשוב לשמור על קצבי הפעלה נמוכים כך שהנקודות הפלואורסצנטיות יהיו מבודדות בבירור בכל פריים. הקליטו כ-10,000 פריימים לכל סרטון, מה שבשדה ראייה חתוך אורך בדרך כלל עד שלוש דקות ותופס עד גיגה-בייט אחד של שטח אחסון בדיסק הקשיח.שימו לב שברגע ששדה ראייה צולם, הפלואורופורים של pa m cherry עוברים דהייה (bleaching) בלתי הפיכה ולא ניתן יהיה לצפות בהם שוב. שוב, ההליך הבא משתמש בתוכנה מותאמת אישית ב-matlab. פלואורופורים בודדים מופיעים כפונקציות פיזור נקודתיות או psfs.בסרטון, psfs מזוהים תחילה בתמונה שעברה סינון פס-מעבר באמצעות גרעין גאוסיאני בעלות קוטר של שבעה פיקסלים; מיקומי מועמדים תואמים ל-P SFS עם עוצמות שיא של פיקסלים הגבוהות פי 4.5 מהסטיית התקן של הרקע. הפיקסל הבהיר ביותר באופן מקומי עבור כל PSF מועמד משמש כהערכה ראשונית להתאמה של פונקציית גאוסיאן אליפטית. פרמטרי ההתאמה החופשיים הם מיקום X, מיקום y, רוחב X, רוחב Y, זווית סיבוב, אמפליטודה והיסט רקע.המסיכה הגאוסיאנית האליפטית מתחשבת בתנועת המולקולות במהלך זמן החשיפה, אשר גורמת לטשטוש ולעיוות של גרף ה-PSF. הלוקליזציות של ציר XY המתקבלות מכל הפריימים של סרט ה-PALM על גבי תמונת מיקרוסקופיית האור המועבר של אותו שדה ראייה, של לוקליזציות של mCherry-PAM, צריכות להופיע בתוך האזור המרכזי של תאי E. coli. מעקב אוטומטי מודד את תנועת החלבונים, אך בחירה נכונה של חלון המעקב היא קריטית.ראשית, הפעילו את אלגוריתם המעקב עבור טווח של פרמטרי חלון מעקב. שרטטו את מספר המסלולים הנמדדים לכל תא אל מול חלון המעקב כדי לזהות את חלון המעקב הקטן ביותר האפשרי שאינו מפצל מסלולים, והציגו את המסלולים שהתקבלו על גבי תמונת מיקרוסקופיה של אור תמסור של אותו שדה ראייה. כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של תנועת המולקולות בתוך התאים, על המסלולים להראות דיפוזיה המוגבלת לתאים בודדים; אם חלק מהמסלולים נראים כחוצים בין תאים, הדבר מרמז כי מולקולות נפרדות קושרו בטעות מכיוון שחלון המעקב שנבחר היה גדול מדי ו/או שקצב הפוטו-אקטיבציה היה גבוה מדי.שרטטו את ההתפלגות המצטברת של אורכי הצעדים בין מיקומים עוקבים. העקומה עולה ונרווית בצורה חלקה עבור חלונות מעקב גדולים מספיק, אך מראה קצה חסימה אם החלון שנבחר היה קטן מדי. לאחר שבחרתם חלון מעקב מתאים, ניתן לנתח את מאפייני הדיפוזיה של Paul one.חשבו את ממוצע ריבועי ההעתק (mean square displacement) או MSD בין לוקליזציות עוקבות עבור כל מסלול עם סה"כ n צעדים; השתמשו רק במסלולים בעלי לפחות חמש לוקליזציות כדי להפחית את אי-הוודאות הסטטיסטית של ה-MSD. לאחר מכן, חשבו את מקדם הדיפוזיה הנראה עבור כל מסלול מתוך ה-MSD. האיבר השני מתקן עבור שגיאת הלוקליזציה המוערכת.אלה הם הערכים עבור האיבר השני. בדוגמה זו, שרטט כעת היסטוגרמה של ערכי מקדם הדיפוזיה שנמדדו מכל העקבות בשדה הראייה עבור pol one בתאים לא פגומים ועבור pol one בתאים תחת טיפול של נזק ל-DNA באמצעות MMS; הפסים האדומים מזהים את אוכלוסיית מולקולות ה-pol one הבודדות שנראות כקשורות לכרומוזום ומפעפעות במהירות של פחות מ-0.15 square microns per second, בעוד שמולקולות במחזור דיפוזיה חופשי נעות במהירות של כ-0.9 square microns per second.לאחר שזוהו מולקולות Pol 1 קשורות, ניתן להדמיא את מיקומי אתרי הקישור בתאים ללא פגע ובתאים עם נזקי MMS. חלקן של העקבות הקשורות ביחס למספר העקבות הכולל שנצפו מספק מדד כמותי ישיר לפעילות תיקון ה-DNA של pol.הפעלה פוטו-כימית in vivo של חלבוני היתוך pol one PA m cherry בוצעה בתאי e coli חיים. ניתן היה להגביל את ההפעלה הפוטו-כימית לفلורופור PA m cherry בודד בתא אחד, כאשר שיעורי הפעלה פוטו-כימית גבוהים יותר חשפו מספר רב יותר של מולקולות פלואורסצנטיות. ניתוח לוקליזציה בוצע עבור כל פריים של סרט PALM.הדיוק נמדד באמצעות מולקולות שאינן ניידות בתאים מקובעים או מולקולות קשורות בתאים חיים, ונמצא כי הוא 40 nanometers, במידה התואמת את התחזית התאורטית. לאחר מכן, נקבע סף הלוקליזציה; כאשר הסף היה נמוך מדי, פסגות אקראיות ברעש הרקע נבחרו בטעות כמיקומים פוטנציאליים, בעוד שכאשר הסף היה גבוה מדי, חלק מהנקודות הוחמצו.מיקומי ה-Paul one שהתקבלו תפסו את האזור המרכזי של התא, ובמידה רבה שחזרו את הארגון המרחבי של הנוקליואיד ב-e coli. מרבית מסלולי ה-Paul one בתאים שאינם פגועים מראים דיפוזיה. תא טיפוסי מכיל כמה מאות מסלולי Paul one, דבר התואם למספר עותקים של כ-400 מולקולות Paul one לכל תא e coli.ניתן לזהות סוגים שונים של תנועה מולקולרית על ידי חישוב ערכי MSD בטווח של זמני השיהיה (lag times); תנועה מכוונת מביאה לעקומה פרבולית. תנועה בראונית מאופיינת בקו ישר. עקומת דיפוזיה מוגבלת מגיעה למישור (plateau), וההיסט של עקומת ה-MSD עבור חלקיקים נייחים מייצג את אי-הוודאות של הלוקליזציה.עקומת ה-MSD שהתקבלה עבור Paul one עלתה באופן ליניארי בזמני השהיה (lag times) קצרים, דבר המעיד על תנועה בראונית, והגיעה לרוויה בזמני השהיה ארוכים יותר עקב הגבלה תאית. באמצעות שיטות אלו, נמדדה פעילות תיקון ה-DNA של Paul one בתגובה לנזקי אלקיליציה חיצוניים של DNA בתאים ללא פגיעה. היסטוגרמת מקדם הדיפוזיה של Paul one מראה אוכלוסייה דומיננטית של מולקולות המבצעות דיפוזיה.ייתכן שהמולקולות המעטות שנקשרו מעורבות בשכפול DNA ובתיקון נזקים אנדוגניים של ה-DNA תחת נזק מתמשך של MMS בריכוז 100 millimolar. השכיחות של עקבות עם מקדמי דיפוזיה הקרובים לאפס עולה באופן משמעותי. דבר זה תומך במודל שבו יותר ממולקולה אחת של Paul חייבת להיות מעורבת בתיקון ה-DNA בנוכחות מוטגן בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות לניתוח נתונים, כגון לוקליזציה (localization) וצבירה (clustering), כדי לכמת את ההתפלגות המרחבית של חלבונים בתא ולבחון את נוכחותם של קומפלקסים חלבוניים גדולים יותר המעורבים בתיקון DNA.

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

מקור: ברטון, ב. פ. ואחרים, הדמיה תלת-ממדית של תאי חיידק לייצוגים תאיים מדויקים ומיקום חלבונים מדויק. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון הזה מדגים את השיטה לרכישת וניתוח תמונות פלואורסצנציה תלת-ממדיות של תאי חיידק כדי לחקור ארגון חלבונים ברמת התא היחיד.

הדמיית התפלגות חלבוני חיידק בשלושה ממדים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה

הסרטון מתאר את טכניקת ההדמיה FLIM-FRET כדי לקבוע את האינטראקציה חלבון-חלבון בחיידקים חיים המבטאים חלבונים ציטופלזמיים המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים, eGFP תורם ומקבל mCherry. הטכניקה המשולבת מאפשרת גם לכמת את החלבונים המקיימים אינטראקציה.

הדמיית FLIM-FRET לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למד לדמיין ולכמת אינטראקציות חלבון-DNA בתאי Escherichia coli חיים באמצעות מיקרוסקופיית מיקום מופעלת-אור ומעקב מולקולה בודדת. שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של פעילות תיקון DNA ברמת התא הבודד.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

גלה סרטונים נוספים