לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת ישירות את הפעילות של חלבונים קושרי DNA בתאי חיידקים חיים. זה מושג על ידי הדמיה של תאים המבטאים חלבון פלואורסצנטי המופעל בפוטו המותך לחלבון קושר DNA מעניין. השלב השני של ההליך הוא רכישת סרט של חלבונים בודדים המופעלים תוך כדי הדמיה.

לאחר מכן הנתונים מנותחים כדי לקבוע לוקליזציות של חלבונים ולעקוב אחר חלבונים בתוך תאים בודדים. אירועי קשירת DNA מזוהים על ידי שינוי במקדם הדיפוזיה של חלבונים בודדים כאשר הם באים במגע עם כרומוזומים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק מדד כמותי של אינטראקציות DNA חלבון ברמת התא הבודד על ידי ספירת מספר החלבונים הקשורים והמפזרים לתא.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון שיעורי התיקון in vivo וההתפלגות המרחבית של אתרי תיקון. כעת נדגים את השיטה על ידי מדידת פעילות התיקון של DNA פולימראז אחד בתאי אי קולי בחיים ראשית בצע החלקות כיסוי ללא חלקיקים פלואורסצנטיים ברקע בתנור בטמפרטורה של 500 מעלות צלזיוס למשך שעה. שורפים מלאי של פתקי כיסוי בעובי מספר 1.5, מאחסנים אותם בטמפרטורת החדר בנייר אלומיניום.

הם טובים לשבועות הקרובים. לאחר מכן, רכזו מיליליטר של E coli בשלב אקספוננציאלי מוקדם בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר של הזן. AB 1157 poly a PA m צנטריפוגת דובדבן התאים ב -2, 300 גרם למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-20 מיקרוליטר של תווך שיורי ומערבל את התאים לתמיסה. לאחר מכן, הכינו תמיסת פלואורסצנטיות נמוכה של 1.5% במים מזוקקים. מערבבים 500 מיקרוליטר של האירוס המומס עם 500 מיקרוליטר של שני מדיום מינימלי על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה כמה פעמים לניסויי נזק ל-DNA באמצעות מתיל מתאן סולפונאט או MMS תוך נקיטת אמצעי זהירות.

הוסף 8.3 מיקרוליטר MMS ל-500 מיקרוליטר של מדיום מינימלי לפני ערבובם עם הארוס לפני שהתערובת מתקררת. מורחים אותו על פתק כיסוי שרוף. מורחים אותו באופן שווה ומרוכז מבלי ליצור בועות.

משטחים את הכרית עם החלקת כיסוי שרופה שנייה. לאחר שהתקרר, הסר את המכסה העליון מהרפידה והוסף מיקרוליטר של תרחיף תאים מרוכז. שתק את התאים על ידי כיסוי הכרית בהחלקת כיסוי שרופה חדשה ולחיצה כלפי מטה בעדינות רבה.

יש לדמות את התאים תוך 45 דקות לפני שהם מתייבשים. כדי להאריך את הזמן הזה, ניתן לאטום את הרפידה בתוך אטם סיליקון לניסויי נזק ל-DNA. לפני ההדמיה התאים דוגרים אותם על המשטח למשך 20 דקות.

במיכל לח בטמפרטורת החדר, המיקרוסקופ כולל לייזר להפעלת צילום של 405 ננומטר ולייזר עירור של 561 ננומטר. רגישות מולקולה בודדת מושגת על ידי מרגש רק ארבע פלואורו בתוך קטע דק מעל משטח החלקת הכיסוי באמצעות תאורה נוטה מאוד, פליטת הקרינה נרשמת במצלמת CCD המכפילה אלקטרונים. הנח את הדגימה על במת המיקרוסקופ והביא את התאים למיקוד.

תחת תאורת אור משודרת, הגדר שדה ראייה חתוך כדי להקטין את גודל הנתונים ולהגדיל את מהירות קריאת המצלמה. כסה את הדגימה מאור הסביבה והפעל את רווח מצלמת ה-CCD המכפיל את האלקטרונים לזיהוי פלואורו ארבע יחיד. הגדר את קצב הפריימים ל-15.26 אלפיות השנייה למסגרת.

זה כולל את קריאת המצלמה של 0.26 אלפיות השנייה זמני החשיפה בזמן צריכים להיות קצרים מספיק כדי לצפות בכתמי פלורסנט חדים עם מעט תנועה. מצד שני, יש לדגום את המסלולים במרווחי זמן ארוכים מספיק כדי להבחין בבירור בין המולקולות הקשורות לבין המולקולות המפזרות. כעת הצג את נתוני המצלמה כדי לבדוק את אות הרקע הכהה.

הפעל את הלייזר 561 ננומטר ובדוק את אות הרקע של העירור. הפעל את הלייזר 405 ננומטר להפעלת צילום של חלבוני היתוך הדובדבן של Paul one PA M והגביר את העוצמה עד להופעת כתמים פלואורסצנטיים של מולקולות בודדות. כעת כוונן את זווית קרן העירור כדי להאיר רק חלק דק מהדגימה.

סגור את משטח החלקת הכיסוי. שיטה זו מסתמכת על זיהוי ולוקליזציה מדויקת של חלבונים פלואורסצנטיים בודדים, כך שהיישור והרגישות האופטימליים של המיקרוסקופ יהיו חיוניים לאיכות הנתונים. לשם כך, מקד את קרן הלייזר במישור המוקד האחורי של צמצם מספרי 100 x 1.4.

תרגום עדשת המיקוד בניצב לקרן מרחיק את המיקוד ממרכז האובייקט, וגורם לקרן לצאת מהמטרה בזווית. כוון שהקרן תמקסם את עוצמת הקרינה ותמזער את הרקע. מצא שדה ראייה חדש של תאים במצב מיקרוסקופ אור מועבר ומקד את התמונה.

צלם תמונת מצלמה כדי לתעד את קווי המתאר של התאים. הפעל את הלייזר של 561 ננומטר והלבין את האוטופלואורסצנטיות הסלולרית וכתמי הרקע על הכיסוי. להחליק למספר שניות.

לפני תחילת רכישת הנתונים, התחל ברכישה של סרט כף יד תחת עירור רציף של 561 ננומטר. הפעל את הלייזר של 405 ננומטר והגדל בהדרגה את העוצמה במהלך הסרט עד וואט אחד לסנטימטר מרובע. הימנע מעוצמות גבוהות יותר של 405 ננומטר הגורמות לאוטופלואורסצנטיות תאית.

שימו לב לצפיפות של מולקולות פלואורסצנטיות. חשוב לשמור על שיעורי הפעלה נמוכים כך שהכתמים הפלואורסצנטיים מבודדים בבירור בכל מסגרת. הקלט כ-10,000 פריימים לסרט, שעם שדה ראייה חתוך לוקח בדרך כלל עד שלוש דקות ועד ג'יגה-בייט של שטח דיסק קשיח.

שימו לב שברגע שצולם שדה ראייה, הפלואורופורים של דובדבן ה-pa m מולבנים באופן בלתי הפיך ולא ניתן לצפות בהם. שוב, ההליך הבא משתמש בתוכנה מותאמת אישית ב-matlab. פלואורופורים בודדים מופיעים כפונקציות התפשטות נקודתיות או psfs.

בסרט, psfs מזוהים לראשונה בתמונה מסוננת של מעבר פס באמצעות גרעין גאוס עם קוטר שבעה פיקסלים מיקומים מועמדים תואמים ל-P SFS עם עוצמות פיקסלים שיא פי 4.5 מעל סטיית התקן של הרקע. הפיקסל הבהיר ביותר מבחינה מקומית לכל PSF מועמד משמש כניחוש ראשוני להתאמת פונקציה גאוסית אליפטית. פרמטרי ההתאמה החופשית הם מיקום X y, מיקום X רוחב, רוחב Y, סיבוב רוחב Y, זווית, משרעת והיסט רקע.

המסכה הגאוסית האליפטית אחראית על תנועת המולקולות בזמן החשיפה, מה שמטשטש ומעוות את עלילת ה-PSF. לוקליזציות ה-XY המתקבלות מכל הפריימים של סרט כף היד לתמונת מיקרוסקופ האור המועבר של אותו שדה ראייה לוקליזציות של פול PAM Cherry אחד צריכות להופיע באזור המרכזי של תאי אי קולי. מעקב אוטומטי מודד את תנועת החלבונים, אך בחירה מוצלחת של חלון מעקב היא קריטית.

ראשית, הפעל את אלגוריתם המעקב עבור מגוון פרמטרים של חלון מעקב. התווה את מספר המסלולים הנמדדים לתא לעומת חלון המעקב כדי לזהות את חלון המעקב הקטן ביותר האפשרי שאינו מפצל מסלולים, והצג את המסלולים המתקבלים בתמונת מיקרוסקופ האור המשודר של אותו שדה ראייה. כדי לדמיין את ההתפלגות המרחבית של תנועת מולקולות בתוך תאים, מסלולים P אחד צריכים להציג דיפוזיה מוגבלת בתוך תאים בודדים אם נראה שחלק מהמסלולים חוצה בין תאים, זה מצביע על כך שמולקולות נפרדות קושרו בטעות מכיוון שחלון המעקב נבחר גדול מדי או שקצב הפעלת הצילום היה גבוה מדי.

התוויית ההתפלגות המצטברת של אורכי הצעדים בין לוקליזציות עוקבות. העקומה עולה ורוויה בצורה חלקה עבור חלונות מעקב גדולים מספיק, אך מראה קצה חתך אם החלון נבחר קטן מדי. לאחר שנבחר חלון מעקב מתאים, ניתן לנתח את מאפייני הדיפוזיה של פאולוס.

חשב את התזוזה הריבועית הממוצעת או MSD בין לוקליזציות עוקבות עבור כל מסלול עם סך של n צעדים השתמש רק במסלולים עם לפחות חמישה לוקליזציות כדי להפחית את אי הוודאות הסטטיסטית של ה-MSD. לאחר מכן, חשב את מקדם הדיפוזיה לכאורה לכל רצועה מה-MSD. המונח השני מתקן את שגיאת הלוקליזציה המשוערת.

אלה הערכים עבור המונח השני. בדוגמה זו, כעת שרטטו היסטוגרמה של ערכי מקדם הדיפוזיה הנמדדים מכל המסלולים בשדה הראייה עבור pol one בתאים לא פגומים ועבור pol אחד בתאים המטופלים בנזק ל-DNA עם MMS, הפסים האדומים מזהים את אוכלוסיית המולקולות הבודדות pol one שנראות קשורות לכרומוזום ומתפזרות בפחות מ-0.15 מיקרון רבוע לשנייה. ואילו מולקולות מתפזרות בחופשיות נעות סביב 0.9 מיקרון רבוע לשנייה.

לאחר שאול הקשור זוהו מולקולה אחת. ניתן לדמיין את מיקומי אתרי הקישור בתאים לא פגומים ובתאים עם נזק מ"מ MS. חלק המסלולים הקשורים ביחס למספר הכולל של המסלולים שנצפו מספק מדד כמותי ישיר לפעילות תיקון ה-DNA של פול.

הפעלת צילום אחת in vivo של חלבוני היתוך דובדבן של pol one PA m בוצעה בתאי אי קולי חיים. הפעלת צילום יכולה להיות מוגבלת לפלואורופור דובדבן PA m יחיד בתא אחד, שיעורי הפעלת צילום גבוהים יותר חשפו יותר מולקולות פלואורסצנטיות. ניתוח לוקליזציה בוצע עבור כל פריים של סרט כף יד.

הדיוק נמדד באמצעות מולקולות נייחות בתאים קבועים או במולקולות קשורות בתאים חיים, ונמצא כי הוא תואם את התחזית התיאורטית. לאחר מכן, סף הלוקליזציה נקבע כאשר הוא היה נמוך מדי. שיאים אקראיים ברעשי הרקע נבחרו בטעות כמיקומים מועמדים, בעוד שאם הסף היה גבוה מדי, כמה נקודות הוחמצו.

הלוקליזציות שנוצרו על ידי פול אחד תפסו את האזור המרכזי של התא, ובאופן כללי סיכמו את הארגון המרחבי של נוקלואיד אי קולי. רוב המסלולים של פול אחד בתאים לא פגומים מציגים דיפוזיה. תא טיפוסי מכיל כמה מאות מסלולים של פול אחד התואמים את מספר ההעתקים של כ-400 מולקולות פול אחד לכל תא אי קולי.

ניתן לזהות סוגים שונים של תנועה מולקולרית על ידי חישוב ערכי MSD על פני טווח של זמני פיגור תנועה מכוונת נותנת עקומה פרבולית. תנועה בראונית מאופיינת בקו ישר. עקומת דיפוזיה מוגבלת מגיעה למישור והיסט של עקומת MSD עבור חלקיקים לא ניידים מייצג את אי הוודאות של הלוקליזציה.

עקומת ה-MSD שהתקבלה עבור פול עלתה באופן ליניארי לזמני פיגור קצרים המעידים על תנועה בראונית ורוויה בזמני פיגור ארוכים יותר עקב כליאת תאים. באמצעות שיטות אלה, פעילות תיקון ה-DNA של פול, נמדדה בתגובה לנזק אקסוגני של אלקילציה של DNA בתאים לא פגומים. ההיסטוגרמה של מקדם הדיפוזיה של פול 1 מראה אוכלוסייה דומיננטית של מולקולות מפזרות.

המולקולות הקשורות המעטות יכולות להיות מעורבות בשכפול DNA ותיקון של נזק DNA אנדוגני תחת נזק MMS מתמשך של 100 מילי-מולרי. תדירות המסלולים עם מקדמי דיפוזיה קרובים לאפס עולה משמעותית. זה תומך במודל שיותר מולקולות פול אחד חייבות להיות מעורבות בתיקון DNA עם מוטגן נוכח בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות ניתוח נתונים אחרות כמו לוקליזציה, אשכולות על מנת לכמת את ההתפלגות המרחבית של חלבונים בתא ולחקור את נוכחותם של קומפלקסים חלבונים גדולים יותר המעורבים בתיקון DNA.