לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציג באופן ויזואלי ולכמת ישירות את הפעילות של חלבוני קשירת DNA בתאי חיידקים חיים. דבר זה מושג על ידי הדמיה של תאים המבטאים חלבון פלואורסצנטי המופעל באור (photo activated), המהודבך לחלבון קשירת DNA רצוי. השלב השני של הפרוצדורה הוא רכישת סרט של חלבונים בודדים המופעלים באור בזמן שהם נדגמים.

לאחר מכן, הנתונים מנותחים כדי לקבוע את מיקומי החלבונים ולעקוב אחר חלבונים בתוך תאים בודדים. אירועי קישור ל-DNA מזוהים על ידי שינוי במקדם הדיפוזיה של חלבונים בודדים כאשר הם באים במגע עם כרומוזומים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק מדד כמותי של אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA ברמת התא הבודד, על ידי ספירת מספר החלבונים הקשורים והחלבונים המדיפים לכל תא.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון שיעורי תיקון in vivo וההפצה המרחבית של אתרי התיקון. כעת נדגים את השיטה על ידי מדידת פעילות התיקון של DNA polymerase one בתאי e coli חיים. ראשית, הכינו זכוכית כיסוי ללא חלקיקים פלואורסצנטיים ברקע בתנור בטמפרטורה של 500 °C למשך שעה אחת. שרפו מלאי של זכוכית כיסוי בעובי מספר 1.5, ואשרו אותם בטמפרטורת החדר בתוך נייר אלומיניום.

הם נשמרים למשך שבועות. כעת, רכזו מיליליטר אחד של E coli מהמושבה AB 1157 poly a PA m cherry בשלב אקספוננציאלי מוקדם בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-2,300 G למשך חמש דקות.

הסיר את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משק תאי התאים ב-20 µL של מצע שאריות, וערבב את התאים באמצעות וורטקס עד להמסה. לאחר מכן, הכן תמיסת aros בריכוז של 1.5% עם פלואורסצנציה נמוכה במים מזוקקים. ערבב 500 µL של aeros מומס עם 500 µL של מצע מינימלי בריכוז פי שניים (two x minimal medium) על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה מספר פעמים, עבור ניסויי נזק ל-DNA המשתמשים ב-methyl methane sulfonate או MMS, תוך נקיטת אמצעי זהירות.

הוסף 8.3 µL של MMS ל-500 µL של מצע מינימלי לפני הערבוב עם ה-aros, וזאת לפני שהתערובת תתקרר. פרס את התערובת על כיסוי זכוכית (cover slip) שנשרף. פרס אותה באופן אחיד ובמרכז, ללא יצירת בועות.

שטחו את הרפידה באמצעות כיסוי זכוכית שרוף שני. לאחר הקירור, הסירו את הכיסוי העליון מהרפידה והוסיפו מיקרוליטר של תרחיף תאים רכז. קבעו את התאים על ידי כיסוי הרפידה בכיסוי זכוכית שרוף חדש ולחיצה עדינה מאוד כלפי מטה.

יש לצלם את התאים תוך 45 דקות לפני שיתייבשו. כדי להאריך זמן זה, ניתן לאטום את הרפידה בתוך אטם סיליקון עבור ניסויי נזקי DNA. לפני צילום התאים, יש להדגיר אותם על הרפידה למשך 20 דקות.

בתוך מכל עם לחות בטמפרטורת החדר, המיקרוסקופ כולל לייזר להפעלה פוטו-כימית ב-405 ננומטר ולייזר עירור ב-561 ננומטר. רגישות למולקולה בודדת מושגת על ידי עירור פלואורופורים בלבד בתוך שכבה דקה מעל פני זכוכית הכיסוי באמצעות הארה בזווית נטייה גבוהה, ופליטת הפלואורסצנציה מוקלטת על ידי מצלמת CCD בעלת כפל אלקטרונים. מקמו את הדגימה על שולחן המיקרוסקופ והביאו את התאים למיקוד.

תחת תאורה של אור תמסור, הגדירו שדה ראייה חתוך כדי להקטין את נפח הנתונים ולהגביר את מהירות הקריאה של המצלמה. הגנו על הדגימה מאור סביבתי והפעילו את הגבר (gain) של מצלמת ה-electron multiplying CCD לצורך זיהוי של פלואורופור בודד. הגדירו את קצב הפריימים ל-15.26 מילישניות לפריים.

זה כולל את זמן קריאת המצלמה של 0.26 מילישניות. זמני החשיפה חייבים להיות קצרים מספיק כדי לצפות בנקודות פלורסצנטיות חדות עם מעט טשטוש תנועה. מאידך, יש לדגום את המסלולים במרווחי זמן ארוכים מספיק כדי להבחין בבירור בין המולקולות הקשורות לאלו המפיצות. כעת, הציגו את נתוני המצלמה כדי לבדוק את אות הרקע החשוך.

הפעל את הלייזר באורך גל של 561 nanometer ובדוק את אות הרקע של העירור. הפעל את הלייזר באורך גל של 405 nanometer לצורך הפעלה פוטונית של חלבוני איחוד ה-Paul one PA M cherry והעלה את העוצמה עד להופעת נקודות פלורסצנטיות של מולקולות בודדות. כעת כוון את זווית קרן העירור כך שתאיר רק פרוסה דקה של הדגימה.

סגרו את פני השטח של כיסוי הזכוכית. שיטה זו מסתמכת על זיהוי ומיקום מדויק של חלבונים פלואורסצנטיים בודדים, לכן התאמה אופטימלית ורגישות של המיקרוסקופ יהיו קריטיות לאיכות הנתונים. לשם כך, מיקדו את קרן הלייזר במישור המוקד האחורי של עדשה בעלת הגדלה של 100x ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.4.

הזזת עדשת המיקוד בניצב לקרן מרחיקה את המיקוד ממרכז העדשה, מה שגורם לקרן לצאת מהעדשה בזווית. יש לשאוף לכך שהקרן תמקסם את עוצמת הפלואורסצנציה ותמזער את הרקע. מצאו שדה ראייה חדש של תאים במצב מיקרוסקופיה באור תמסור והתמקדו בתמונה.

בצעו צילום במצלמה כדי לתעד את מת outlines של התאים. הפעילו את הלייזר באורך גל של 561 ננומטר והפחילו (bleach) את הפלואורסצנציה העצמית של התאים ואת נקודות הרקע על כיסוי הזריקה למשך מספר שניות.

לפני תחילת רכישת הנתונים, התחילו ברכישת סרט PALM תחת עירור רציף של 561 ננומטר. הפעילו את לייזר ה-405 ננומטר והגבירו בהדרגה את העוצמה במהלך הסרט עד להגעה לשער של 1 ווט לסנטימטר רבוע. הימנעו מעוצמות גבוהות יותר של 405 ננומטר הגורמות לאוטופלורסצנציה תאית.

שימו לב לצפיפות המולקולות הפלואורסצנטיות. חשוב לשמור על קצבי הפעלה נמוכים כך שהנקודות הפלואורסצנטיות יהיו מבודדות בבירור בכל פריים. הקליטו כ-10,000 פריימים לכל סרטון, מה שבשדה ראייה חתוך אורך בדרך כלל עד שלוש דקות ותופס עד גיגה-בייט אחד של שטח אחסון בדיסק הקשיח.

שימו לב שברגע ששדה ראייה צולם, הפלואורופורים של pa m cherry עוברים דהייה (bleaching) בלתי הפיכה ולא ניתן יהיה לצפות בהם שוב. שוב, ההליך הבא משתמש בתוכנה מותאמת אישית ב-matlab. פלואורופורים בודדים מופיעים כפונקציות פיזור נקודתיות או psfs.

בסרטון, psfs מזוהים תחילה בתמונה שעברה סינון פס-מעבר באמצעות גרעין גאוסיאני בעלות קוטר של שבעה פיקסלים; מיקומי מועמדים תואמים ל-P SFS עם עוצמות שיא של פיקסלים הגבוהות פי 4.5 מהסטיית התקן של הרקע. הפיקסל הבהיר ביותר באופן מקומי עבור כל PSF מועמד משמש כהערכה ראשונית להתאמה של פונקציית גאוסיאן אליפטית. פרמטרי ההתאמה החופשיים הם מיקום X, מיקום y, רוחב X, רוחב Y, זווית סיבוב, אמפליטודה והיסט רקע.

המסיכה הגאוסיאנית האליפטית מתחשבת בתנועת המולקולות במהלך זמן החשיפה, אשר גורמת לטשטוש ולעיוות של גרף ה-PSF. הלוקליזציות של ציר XY המתקבלות מכל הפריימים של סרט ה-PALM על גבי תמונת מיקרוסקופיית האור המועבר של אותו שדה ראייה, של לוקליזציות של mCherry-PAM, צריכות להופיע בתוך האזור המרכזי של תאי E. coli. מעקב אוטומטי מודד את תנועת החלבונים, אך בחירה נכונה של חלון המעקב היא קריטית.

ראשית, הפעילו את אלגוריתם המעקב עבור טווח של פרמטרי חלון מעקב. שרטטו את מספר המסלולים הנמדדים לכל תא אל מול חלון המעקב כדי לזהות את חלון המעקב הקטן ביותר האפשרי שאינו מפצל מסלולים, והציגו את המסלולים שהתקבלו על גבי תמונת מיקרוסקופיה של אור תמסור של אותו שדה ראייה. כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של תנועת המולקולות בתוך התאים, על המסלולים להראות דיפוזיה המוגבלת לתאים בודדים; אם חלק מהמסלולים נראים כחוצים בין תאים, הדבר מרמז כי מולקולות נפרדות קושרו בטעות מכיוון שחלון המעקב שנבחר היה גדול מדי ו/או שקצב הפוטו-אקטיבציה היה גבוה מדי.

שרטטו את ההתפלגות המצטברת של אורכי הצעדים בין מיקומים עוקבים. העקומה עולה ונרווית בצורה חלקה עבור חלונות מעקב גדולים מספיק, אך מראה קצה חסימה אם החלון שנבחר היה קטן מדי. לאחר שבחרתם חלון מעקב מתאים, ניתן לנתח את מאפייני הדיפוזיה של Paul one.

חשבו את ממוצע ריבועי ההעתק (mean square displacement) או MSD בין לוקליזציות עוקבות עבור כל מסלול עם סה"כ n צעדים; השתמשו רק במסלולים בעלי לפחות חמש לוקליזציות כדי להפחית את אי-הוודאות הסטטיסטית של ה-MSD. לאחר מכן, חשבו את מקדם הדיפוזיה הנראה עבור כל מסלול מתוך ה-MSD. האיבר השני מתקן עבור שגיאת הלוקליזציה המוערכת.

אלה הם הערכים עבור האיבר השני. בדוגמה זו, שרטט כעת היסטוגרמה של ערכי מקדם הדיפוזיה שנמדדו מכל העקבות בשדה הראייה עבור pol one בתאים לא פגומים ועבור pol one בתאים תחת טיפול של נזק ל-DNA באמצעות MMS; הפסים האדומים מזהים את אוכלוסיית מולקולות ה-pol one הבודדות שנראות כקשורות לכרומוזום ומפעפעות במהירות של פחות מ-0.15 square microns per second, בעוד שמולקולות במחזור דיפוזיה חופשי נעות במהירות של כ-0.9 square microns per second.

לאחר שזוהו מולקולות Pol 1 קשורות, ניתן להדמיא את מיקומי אתרי הקישור בתאים ללא פגע ובתאים עם נזקי MMS. חלקן של העקבות הקשורות ביחס למספר העקבות הכולל שנצפו מספק מדד כמותי ישיר לפעילות תיקון ה-DNA של pol.

הפעלה פוטו-כימית in vivo של חלבוני היתוך pol one PA m cherry בוצעה בתאי e coli חיים. ניתן היה להגביל את ההפעלה הפוטו-כימית לفلורופור PA m cherry בודד בתא אחד, כאשר שיעורי הפעלה פוטו-כימית גבוהים יותר חשפו מספר רב יותר של מולקולות פלואורסצנטיות. ניתוח לוקליזציה בוצע עבור כל פריים של סרט PALM.

הדיוק נמדד באמצעות מולקולות שאינן ניידות בתאים מקובעים או מולקולות קשורות בתאים חיים, ונמצא כי הוא 40 nanometers, במידה התואמת את התחזית התאורטית. לאחר מכן, נקבע סף הלוקליזציה; כאשר הסף היה נמוך מדי, פסגות אקראיות ברעש הרקע נבחרו בטעות כמיקומים פוטנציאליים, בעוד שכאשר הסף היה גבוה מדי, חלק מהנקודות הוחמצו.

מיקומי ה-Paul one שהתקבלו תפסו את האזור המרכזי של התא, ובמידה רבה שחזרו את הארגון המרחבי של הנוקליואיד ב-e coli. מרבית מסלולי ה-Paul one בתאים שאינם פגועים מראים דיפוזיה. תא טיפוסי מכיל כמה מאות מסלולי Paul one, דבר התואם למספר עותקים של כ-400 מולקולות Paul one לכל תא e coli.

ניתן לזהות סוגים שונים של תנועה מולקולרית על ידי חישוב ערכי MSD בטווח של זמני השיהיה (lag times); תנועה מכוונת מביאה לעקומה פרבולית. תנועה בראונית מאופיינת בקו ישר. עקומת דיפוזיה מוגבלת מגיעה למישור (plateau), וההיסט של עקומת ה-MSD עבור חלקיקים נייחים מייצג את אי-הוודאות של הלוקליזציה.

עקומת ה-MSD שהתקבלה עבור Paul one עלתה באופן ליניארי בזמני השהיה (lag times) קצרים, דבר המעיד על תנועה בראונית, והגיעה לרוויה בזמני השהיה ארוכים יותר עקב הגבלה תאית. באמצעות שיטות אלו, נמדדה פעילות תיקון ה-DNA של Paul one בתגובה לנזקי אלקיליציה חיצוניים של DNA בתאים ללא פגיעה. היסטוגרמת מקדם הדיפוזיה של Paul one מראה אוכלוסייה דומיננטית של מולקולות המבצעות דיפוזיה.

ייתכן שהמולקולות המעטות שנקשרו מעורבות בשכפול DNA ובתיקון נזקים אנדוגניים של ה-DNA תחת נזק מתמשך של MMS בריכוז 100 millimolar. השכיחות של עקבות עם מקדמי דיפוזיה הקרובים לאפס עולה באופן משמעותי. דבר זה תומך במודל שבו יותר ממולקולה אחת של Paul חייבת להיות מעורבת בתיקון ה-DNA בנוכחות מוטגן בעקבות פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות לניתוח נתונים, כגון לוקליזציה (localization) וצבירה (clustering), כדי לכמת את ההתפלגות המרחבית של חלבונים בתא ולבחון את נוכחותם של קומפלקסים חלבוניים גדולים יותר המעורבים בתיקון DNA.