ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להתבונן בהתפלגות המרחבית של זנים מיקרוביאליים במהלך swarming, sliding או יצירת ביופילם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה החברתית, כגון האופן שבו הפרדה מרחבית משפיעה על אינטראקציה מיקרוביאלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך בקלות את הכושר ההישרדותי (fitness) ואת ההתפלגות המרחבית של זנים מיקרוביאליים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות וניתוח תמונות של תת-מקטעים.

את הפרוצדורה תדגים תרזה הולשר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. ביום שלפני הניסוי, הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע LB לפקעת תרבית והדליקו אותה מתוך מאגר קפוא של B.subtilis. חזרו על הדלקה זו בפקעת נפרדת עבור כל זן רלוונטי.

הניחו את המבחנות באינקובטור עם ניעור אופקי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להכנת פתגניות עבור ניסויי התפשטות (swarming) והחלקה (sliding), שפכו 20 מיליליטר של מצע LB בטמפרטורה מתאימה אל תוך צלחת פטרי מפוליסטירן בקוטר 90 מילימטר. סגרו את הצלחת מיד והניחו אותה בצד תחת מ Какת המגירה הסטרילית לkירור למשך שעה אחת לפחות.

בשלב הבא, הכינו פתחים לניסויי ביופילם של מושבות על ידי מזיגת 25 milliliters של מצע SG עם אגר בריכוז כפול לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 millimeter. סגרו את הפתחים מיד והניחו להם להתקרר בערימות של ארבעה או פחות למשך שעה אחת לפחות. כדי להתחיל, הניחו את פתחי אגר ה-LB ל-swarming ו-sliding במכסה זרימה למינרית והסירו את המכסים.

השאירו את הפלטות להתייבש למשך 20 דקות. הלחות של הפלטות בניסויים אלו היא קריטית. בעוד שלחות מוגברת מאפשרת לחיידקים לשחות, ייבוש ממושך מונע התפשטות (swarming) והחלקה (sliding).

באופן דומה, מבנה הביופיל של המושבה תלוי במידת היובש של המצע. באמצעות ספקטרופוטומטר, קבעו את הצפיפות האופטית של תרביות התנע שהודגרו בן לילה באורך גל של 600 nanometers. בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter, ערבבו כמויות מנורמליות של צפיפות של זני החיידקים המייצרים חלבון פלואורסצנטי ירוק ואדום, לנפח כולל של 200 microliters.

ערבבו את המבחנה במכשיר Vortex למשך שלוש שניות. באמצעות מיקרו-פיפט, טפטפו 2 µL מהתרבית המעורבבת למרכזו של מצע LB agar בקוטר 90 מילימטר שיובש מראש, בתוך מנדף זרימה למינרית. השאירו את המצע לייבוש למשך 10 דקות.

לבסוף, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C במצב אנכי כדי למנוע הצטברות של עיבוי על פני השטח של האגר. ראשית, הניחו את צלחות אגר ה-2x SG במכסה זרימה למינרית למשך 15 דקות לייבוש. לאחר מכן, העבירו 100 µL מכל אחד מתרביות ההתנעה של זן הביופילם של *B.subtilis* 168 המפיק חלבון פלואורסצנטי ירוק ואדום אל מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

ערבבו את המבחנה במערבל Vortex למשך שלוש שניות. הכינו מבחנות עם 100 µL של מצע LB ובעזרת התרבית המעורבבת, צרו סדרת דילול של פי 10 עבור התהליכים. באמצעות מיקרו-פיפטה, טפטפו 2 µL של התרבית המעורבבת ללא דילול על פלטת אגר SG בריכוז פי שניים.

חזור על פעולה זו עם תרביות עבור הדילול 10 to the one, 10 to the two, 10 to the three, ו-10 to the four, תוך השארת מרווחים שווים בין הנקודות כדי לאפשר גדילה של שש עד תשע מושבות בצלחת אחת. דגרו את הצלחות במצב אנכי בטמפרטורה של 30 °C למשך יום אחד עד שלושה ימים. לתחילת העבודה, הניחו את הצלחות על פלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ עם גילוי פלואורסצנציה.

עבור ניסויי החלקה (sliding) ונשיאה (swarming), הגדירו את נקודת ההורויה, מרכז צלחת הפטרי, בפינת השדה הגלוי כדי לאפשר מדידה של התרחבות רדיאלית של המושבה. התאימו את ההגדלה לרזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת דימוי של האזור הגדול ביותר האפשרי בצלחת של 90 millimeter. התאימו את זמן החשיפה בהתאם, בהתאם לעוצמת האות הפלורסצנטי.

לניתוח הביופילם, מקמו מושבה רצויה במרכז שדה הראייה. הגדירו את ההגדלה לרזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת צפייה במושבה כולה. המושבות מוכנות כעת למדידה ולניתוח.

לבסוף, יש לנתח את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. איור זה מראה את הצמיחה של מושבה טיפוסית של Bacillus subtilis שהוחדרה משני זנים. תופעת ה-swarming, שהיא תנועה שטחית קולקטיבית התלויה בשוטונים, מובילה לאוכלוסייה מעורבבת מאוד.

בסרטון זה בשיטת צילום השהיה (time-lapse), הPlaced של התרבית הראשונית בוצע במרכז הפיזור על הפלטה. ניתן להבחין בבירור בתופעת swarming בשכבה דקה, וככל שהמושבה מתפתחת, שני הזנים הפלואורסצנטיים האדום והירוק נראים מעורבבים וחופפים. לעומת זאת, תמונות של התנהגות גלישה (sliding) מראות מגזרי צמיחה מוגדרים התואמים לזנים הפלואורסצנטיים המסומנים באופן שונה.

סרטון זה מציג את הצמיחה של מושבה משותפת עם זריעה כפולה המתרחדת, שבה לשבטים חסרים שוטים תפקודיים. מושבות אלו עדיין מסוגלות להתפשט באמצעות שילוב של אקסו-פוליסכריד מופרש, הידרופובין וסורפקטין. המושבות שנוצרו מציגות מיון צמיחה מרחבי מובחן בהשוואה לשבט המבצע תנועת swarming.

צפיפויות התאים ההתחלתיות של מושבות המייצרות ביופילם השפיעו רבות על המיון המרחבי של המושבות שהתקבלו. מושבות שהחלו בצפיפות תאים גבוהה של אוכלוסיות מעורבות הראו מיון מרחבי מזערי או לא הראו מיון כלל. לעומת זאת, כאשר צפיפות התאים בעת ההתחלה הייתה נמוכה, ניתן היה לזהות סקטורים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים ברורים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את השפעיות היחסיות של זנים המסומנים פלואורסצנטית במושבות מיקרוביאליות, לבחון הפרדה מרחבית וללמוד את השפעת צפיפות תאי המייסדים.