ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

שיטה זו משתמשת בגידול משותף של bacillus sutilis המסומן פלואורסצנטי כדי לנטר את ההתרחבות המשובטת המהירה וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות באוכלוסיית תאי חיידקים לאורך זמן. ראשית, הכינו את התרביות המוקדמות של החיידקים לניסוי התחרות. מערבבים כמויות שוות של הזנים המסומנים בפלואורסצנט ומטפחים יחד את החיידקים בתנאים תזונתיים שונים.

לאחר מכן אוספים את הדגימות בנקודות זמן שונות, מדללים כראוי ומפיצים את התאים על צלחות אגר. כעת דמיין וספור את הזנים ששרדו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לקבוע את אחוז החיידקים השורדים ביחס למספר השלם של המושבות שנספרו.

בניגוד לניטור תחרות בין מינים באמצעות קלטות אנטיביוטיקה שונות לסימון זנים. בשיטה זו, זני מתחרים בעלי תווית פלואורסצנטית הם איזוטוניים כמעט לחלוטין ומסוגלים להתבשל על אותן לוחות AGA. ההליך המקדים יוצג על ידי לורנה, שהיא דוקטורנטית במעבדה שלי לחסן את ארבעת המיליליטר של מדיום LB במיקרוליטר אחד של חיידקים ממינוס 80 מעלות צלזיוס, מלאי קריו, ולגדל את התרביות המוקדמות בן לילה ב-28 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד לדלל 0.1 מיליליטר של תרבית ל-0.9 מיליליטר של מדיום LB ב-1.5 מיליליטר, ולקבוע את הצפיפות האופטית.

לאחר מכן, כדי להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות לניסויי התחרות, יש לחסן צלוחיות שייק של 100 מיליליטר המכילות 20 מיליליטר של CGLC ו-CGLC. מדיום מינימלי ביחס של אחד לאחד, העבירו 10 מיליליטר מהתרבויות לצינורות פלסטיק של 15 מיליליטר. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 4,000 והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-0.5 מיליליטר של מדיום LB טרי, והעבירו את התאים לכוס תגובה סטרילית של 1.5 מיליליטר הוסיפו 0.5 מיליליטר של 50% גליצרול סטרילי. מערבבים את התרחיף על ידי מערבולת קפדנית ומאחסנים את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. התרבית הבאה, החיידקים הנותרים בצלוחיות השייק.

שמור את צלוחיות הניעור בחושך כדי למנוע הלבנה פוטו-הלבנה של דגימת כוח הצומח 0.1 מיליליטר של התרביות לאחר שבע שעות ו-24 שעות של מדידת גידול ושים לב לצפיפות האופטית של דילול אחד עד 10 של הדגימות הופכות מלאי קריו של הדגימות לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר איסוף כל הדגימות, יש להפשיר את מלאי הקריו ולדלל את התאים בתמיסת מלח של 0.9% לכל לוחית מתח. 0.1 מיליליטר מהדילול החמישי השלילי של 10 על צלחת אגר בינונית SP, ולהפיץ את התאים באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית.

דגרו על הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בחושך עד שהופיעו מושבות בודדות בעזרת עט שחור. חלקו את החלק התחתון של צלחת האגר לארבעה חלקים להתמצאות טובה יותר תוך ספירת הניצולים תחת מיקרוסקופ הקרינה הסטריאו. כעת, הניחו את הצלחת הפוכה מתחת למיקרוסקופ והביאו את המושבות למיקוד באמצעות מקור האור הקר.

לאחר שהמושבות ממוקדות, עבור לערכת המסננים המתאימה עבור CFP Flora 4. כדי לדמיין את התאים השורדים של הזן המסומן CFP, ספרו את השורדים של זן זה על ידי תיוג המושבות בעט. ושימו לב למספר.

הסר את התוויות עם אתנול. לאחר מכן עבור לערכת מסנני YFP. כדי לדמיין את התאים השורדים של הזן המסומן YFP.

ספרו שוב את הניצולים על ידי סימון המושבות בעט. ושימו לב למספר. פתח את התמונות מנקודה אחת שצולמו עם ערכת מסנני CFP וערכת מסנני YFP.

מטב את הניגודיות והבהירות כדי להפחית את הקרינה ברקע מהמדיה. עבור אל אחת התמונות ובחר את כולן. העתק את התמונה והדבק אותה בתמונה האחרת.

מיזוג התמונות על ידי בחירה בתפריט השכבות באפשרות צבע בהיר יותר. בניסוי זה, אוכלוסיית תאים המורכבת משני זני BCI סומנה עם Fluor CFP ו-YFP כדי להעריך את ההשפעה של מקורות חנקן שונים על הצמיחה על ידי ציפוי דילול מתאים על לוחות אגר. ניתן לקבוע במדויק את ההרכב המשובט של אוכלוסיית תאים לאורך זמן פשוט על ידי ספירת המושבות הפלואורסצנטיות הצהובות והכחולות.

פעילות האנזים גלוטמט דהידרוגנאז משפיעה מאוד על כושר האוטוס בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני. בהיעדר גלוטמט אקסוגני, פעילות GDH ברמה גבוהה היא חיסרון עבור החיידקים מכיוון שהאנזימים מנדנדים G ו-B טוב מפרקים גלוטמט הדרוש באנבוליזם. לעומת זאת, סינתזה של שני gdhs פונקציונליים מועילה לחיידקים כאשר גלוטמט אקסוגני זמין מכיוון שבנוסף לגלוקוז G גלוטמט משמש כמקור פחמן.

תוצאות דומות התקבלו בניסוי מתג מת. שוב, חיידקים המצוידים בפעילות GDH ברמה גבוהה התחרו על ידי תאים עם פעילות GDH מופחתת במצעי גדילה חסרי גלוטמט. לעומת זאת, חיידקים המסנתזים רק GDH פעיל אחד סולקו מהתרבית.

כאשר המדיום הוסיף גלוטמט, ברור שההרכב הראשוני של אוכלוסיית התאים המעורבים נשאר כמעט קבוע לאורך זמן. ללא קשר לפלואור ביחד. השימוש ב-Flora Force הוא כלי רב עוצמה לניטור תחרות בין מינים באוכלוסיית תאי חיידקים לאחר יצירת חוזקות המתחרים.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.