Name: העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד ניתוח במהירות גבוהה של קהילות מיקרוביאליות רב-חברתיות בסביבות סגורות באמצעות מערכי בארות סיליקון. שיטה זו מאפשרת מעקב מקבילי אחר אלפי אינטראקציות מיקרוביאליות ליישומים תעשייתיים, רפואיים וסביבתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מערכים Microwell היו מפוברקות מאופיין במרכז חומרים Nanophase מדעי משתמש מתקני החטיבה, משרד בסיסי מדעי האנרגיה, מחלקת האנרגיה של ארה&quot;ב. תמיכה כספית לעבודה זו נמסרה באמצעות Oak Ridge National Laboratory מנהל מחקר ופיתוח הקרן. המחברים גם רוצים להודות למעבדה ג &#39;יי מוגז (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, WA) על אספקת זנים פ aeruginosa המשמשים מחקרים אלה.

<ol><li>Zhou, J., Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity%2C+succession%2C+and+environmental+perturbations+in+a+fluidic+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem.</a> Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).</li>
<li>Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analysis+of+microbial+community+organization+through+combinatorial+labeling+and+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+structure+of+bacterial+and+archaeal+communities+and+their+in+situ+activities+in+anaerobic+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+spatial+structure+stabilizes+a+synthetic+multispecies+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).</li>
<li>Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+bacterial+communities+and+their+relationships+with+the+micro-architecture+of+soil%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil.</a> FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).</li>
<li>Grundmann, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scales+of+soil+bacterial+diversity+-+The+size+of+a+clone%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone.</a> FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).</li>
<li>Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bacterial+Communities+Emerging+from+Different+Sources+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).</li>
<li>Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+Scales+in+Gastrointestinal+Microbial+Ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li>
<li>Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+local%3A+technologies+for+exploring+bacterial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).</li>
<li>Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of polymicrobial infection.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).</li>
<li>Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+block+copolymer+surfaces+for+control+of+microbe+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation.</a> Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).</li>
<li>Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-functionalized+poly%28glycidyl+methacrylate%29-+block+-poly%28vinyldimethyl+azlactone%29+surface+scaffolds+for+high+avidity+microbial+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture.</a> Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).</li>
<li>Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstencils+to+generate+defined%2C+multi-species+patterns+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria.</a> Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).</li>
<li>Zhang, Q., Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+Emergence+of+Bacterial+Antibiotic+Resistance+in+Connected+Microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+flagella+explore+microscale+hummocks+and+hollows+to+increase+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+Leads+to+Alternative+Communities+with+Distinct+Functions+in+a+Bioreactor+Microbial+Community%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community.</a> MBio. 4 (2), 1-8 (2013).</li>
<li>van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+interactions+and+culture+history+on+the+colonization+of+structured+habitats+by+competing+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations.</a> BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).</li>
<li>Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Nanoculture+as+an+Artificial+Microniche%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche.</a> Sci Rep. 6, 30578(2016).</li>
<li>Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+of+Bacteria+in+Microwell+Arrays+Reveals+the+Importance+of+Confinement+in+Community+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development.</a> PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).</li>
<li>Hood, R. D., Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Type+VI+Secretion+System+of+Pseudomonas+aeruginosa+Targets+a+Toxin+to+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).</li>
<li>LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+characterization+of+bacterial+interactions+reveals+type+VI+secretion+is+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).</li>
<li>Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+pathways+guide+effector+export+through+the+type+VI+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system.</a> Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).</li>
<li>Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+Single-Cell+Kinetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16348228">Modeling of the Bacterial Growth Curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308753041_Development_of_transparent_microwell_arrays_for_optical_monitoring_and_dissection_of_microbial_communities">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה הציג מכשיר מערך microell ופרוטוקולים ניסיוניים שנועדו לאפשר תפוקה גבוהה תוכן גבוהה לחיות תא הדמיה מבוסס ניתוח של פיתוח הקהילה חיידקים. בעוד שמיקוד ההפגנה כאן היה לבחון את ההשפעות של הפרשת סוג 6 על פיתוח הקהילה, המערכים נועדו להיות גמישים ולהתאים את המחקר למגוון רחב של קהילות חיידקים ואינטראקציות חיידקים מיקרוביאליים. העבודה כאן מתמקדת אך ורק בשימוש בחיידקים המבטאים באופן קונקרטי סמנים פלואורסצנטיים על מנת לאפשר מעקב פייסני של שפע החברות ומיקומן. עם זאת, הזדמנויות למדגם חומ...

קהילות מיקרוביאליות מעוצבות על ידי גורמים דטרמיניסטיים, כגון מבנה הסביבה ותהליכים סטוכסטיים, הקשורים למוות תאים, חלוקה, ריכוז חלבון, מספר האברונים, ומוטציה 1 . בתוך הסביבה הטבעית, זה כמעט בלתי אפשרי לנתח את ההשפעה הפרטנית של השפעות אלה על הרכב הקהילה ופעילותה. המסתתרים על ידי מבנים טבעיים ונקברים בתוך סביבה כימית וביולוגית, זיהוי חברי הקהילה והמשך פתרון הפיצול הספטיוטמפוראלי שלהם בתוך הסביבה הטבעית הם מאתגרים ביותר. עם זאת, המאמצים האחרונים הדגישו את חשיבותו של הארגון המרחבי על תפקוד הקהילה והצביעו על הצורך לתת דין וחשבון על שפע הארגון וארגונו במחקרים מתמשכים 2 , 3 , 4 . זהברור כי הסביבה הכימית המקומית ( כלומר , הזמינות של חומרים מזינים וחילוף חומרים משני), המבנה הפיזי ( למשל, ארכיטקטורה של אדמה, שורשי צמחים, חלקיקי האוקיינוס ​​או מיקרוביילי המעי), נוכחות או היעדר חמצן והכנסת מינים פתוגניים משפיעים על הרכב, ארכיטקטורה ותפקוד של קהילות מיקרוביאליות 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, טכניקות מסורתיות עבור תרבויות הזנחה ללכוד גורמים אלה ממשיכים לגבור. הרכב הקהילה ( למשל, נוכחות של מינים תלויי תלות), התקשרות פיזית, ריכוז מולקולה איתות, קשר ישיר תא סלולרי הם כל הגורמים החשובים לעיצוב קהילה חיידקים והוא יכול ללכת לאיבוד גתנאי התרבות האונבנציונלית. מאפיינים אלה קשה לשכפל בתרבות נוזלי בתפזורת או על צלחת אגר. הזמינות של טכניקות microfluidic, micropatterning ו- nanofabrication המאפשרות שכפול של תכונות פיסיקליות וכימיות עיקריות של סביבות טבעיות אפשרה לחוקרים רבים לבנות קהילות חיידקים כדי לחקור את האינטראקציות שלהם 12 , 13 , 14 ולפתח סביבות מלאכותיות לחקות את התנאים הטבעיים 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק מכשיר מערך microell ומספק נהלים ניסיוניים מפורט שניתן להשתמש בהם כדי פונקציונליE wells במערך לגדל חיידקים, הן כמושבות יחיד מינים בקהילות מרובות חברים. עבודה זו גם ממחישה כיצד חיידקים שונה כדי לייצר חלבונים הכתב ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על צמיחה חיידקים בתוך בארות לאורך זמן. מערך דומה הוצג בעבר הראה כי ניתן לעקוב אחר הצמיחה של מינים בודדים מינים של Pseudomonas aeruginosa ( פ aeruginosa) ב microwells. על ידי שינוי גודל וצפיפות זריעה היטב, התנאים ההתחלתיים של אלפי ניסויים הצמיחה יכול להיות מגוונות במקביל כדי לקבוע כיצד תנאי חיסון ראשוני להשפיע על היכולת של חיידקים לגדול 21 . העבודה הנוכחית משתמשת בגירסה שונה מעט של מערך microwell אשר בונה על העבודה הקודמת בכך שהוא מאפשר השוואה בו זמנית של מערכים מרובים באמצעות פרוטוקול ניסיוני חזק יותר. המערך שבו נעשה שימוש בעבודה זו מכיל מספר תת-מערכות משנה, או מערך אנסםBles, המכיל בארות בגדלים שונים, הנעים בין 15-100 מיקרומטר בקוטר, אשר מסודרים על שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, ו 4x קוטר). מערכים הם חרוט לתוך סיליקון, ואת הצמיחה של חיידקים seeded במערכי הסיליקון מאופשר על ידי איטום מערכים עם coverslip כי כבר מצופה עם ג&#39;ל agarose בינונית חדורים. P. aeruginosa מוטנטים שנועדו ללמוד את מערכת הפרשת סוג VI משמשים בהפגנה זו. התוצאות המוצגות כאן לבנות לקראת המטרה האולטימטיבית של ניתוח קהילות multimember בתוך מערכים microwell, המאפשר לחוקרים לפקח על שפע וארגון של חיידקים באתרם תוך שליטה וחוקר הסביבה הכימית. זה צריך בסופו של דבר לספק תובנות את &quot;הכללים&quot; אשר קובעים פיתוח הקהילה ואת הירושה.

<table><tbody><tr><td>Parylene N</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>CAS מס': 1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי פארילן</td><td>מערכות ציפוי מיוחדות</td><td>Labcoter 2 יחידת תצהיר פארילן PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>WRS חומרים</td><td>בקוטר 100 מ"מ, 500-550&mu; עובי מ', פריים, התנגדות 10-20, N / Phos< 100>,</td><td></td></tr><tr><td>מקדם הידבקות</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 מקדם</td><td></td>הידבקות</tr><tr><td>טון חיובי פוטו-רזיסט</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (בבעלות דאו)</td><td>Microposit S1818 פוזיטיב פוטו-רזיסט (קוד 10018357)Quintel</td><td></td></tr> <tr><td>Contact</td><td>Aligner Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 מיישר</td><td></td>מסכות</tr><tr><td>כלי תחריט יונים תגובתי</td><td>אוקספורד מכשירים</td><td>מערכת פלזמלב 100 תחריט</td><td></td>יונים תגובתי</tr><tr><td>R2A מרק</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות מולטימוד</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלורסנט</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>שלב אוטומטי</td><td>לפני</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>תא בקרה סביבתי Stage-top</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלוח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 מ"מ מס' 1.5 כיסוי</td><td>Nexterion</td><td>ביצועים גבוהים #1.5H כיסויים</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות התייחסות פלואורסצנטיות</td><td>טד פלה</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>סטיילוס פיזי פרופילומטר</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני מעבדה</td><td>קימברלי קלארק</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE מותג, 34155</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה מסחרית</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal</td><td>Microscope Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוביות סינון</td><td>ניקון</td><td>ניקון FITC (96311), ניקון טקסס אדום(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך microell

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים מורכבים שיכולים לשנות באופן דרמטי את ההתפלגות המרחבית ואת פעילותם של חברי הקהילה. פיתחנו פלטפורמת מערך microell שניתן להשתמש בה במהירות להרכיב ולעקוב אחר אלפי קהילות חיידקים במקביל. פרוטוקול זה מדגיש את השירות של הפלטפורמה ומתאר את השימוש שלה עבור ניטור אופטי של פיתוח של קהילות פשוטות, שתי חברות בתוך אנסמבל של מערכים בתוך הפלטפורמה. הדגמה זו משתמשת בשני מוטציות של Pseudomonas aeruginosa , חלק מסדרה של מוטציות שפותחו כדי לחקור פתוגניות של סוג VI. הוספת כרומוזומלית של גנים mCherry או GFP או להקל על הביטוי המכונן של חלבונים ניאון עם אורכי גל פליטה שונים שניתן להשתמש בהם כדי לפקח על שפע הקהילה ואת המיקום בתוך microwell. פרוטוקול זה מתאר מת &#39;מפורטד להרכבת תערובות של חיידקים לתוך הבארות של המערך ושימוש זמן לשגות הדמיה פלואורסציה ניתוח כמותי התמונה כדי למדוד את הצמיחה היחסית של כל אוכלוסייה חבר לאורך זמן. זריעה והרכבה של פלטפורמת microwell, ההליכים הדמיה הכרחי לניתוח כמותי של קהילות חיידקים בתוך המערך, ואת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לחשוף אינטראקציות בין מינים באזור מינים כל דנו.

הפלטפורמה הניסויית המוצגת כאן מיועדת לתפוקה גבוהה ולחקר תוכן גבוה של קהילות חיידקים. התכנון מאפשר לנתח בו זמנית אלפי קהילות, הגדלות בארות בגדלים שונים. עם עיצוב מערך microwell זה, את התלות של הרכב הקהילה הסופי על צפיפות זריעת הראשונית, גם גודל, סביבה כימית ניתן לקבוע. עבודה זו מדגימה את הצמיחה של הקהילה שני חברים במערך microwell ומכניס שיטות לנתח את הרכב הקהילה וארגון. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:...

הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים, כולל אדריכלות סביבתית, שפע חבר, תכונות, ואינטראקציות. פרוטוקול זה מתאר סביבה סינתטי, microfabricated למעקב בו זמנית של אלפי קהילות הכלול בארות femtoliter, שבו גורמים מרכזיים כגון גודל נישה כליאה ניתן בקירוב.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא ניתוח מקבילי בעוצמה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות רב-חבריות בסביבות מוגבלות, באמצעות מערכי מיקרו-בארות מסיליקון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סריקה מקבילית בעוצמה גבוהה של אינטראקציות מיקרוביאליות ממוקמות בדיוק רב, בעלות משמעות לתעשייה, לרפואה ולסביבה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביומדספציה והאקולוגיה המיקרוביאלית, כגון כיצד מגבלות מרחביותה טבועות בקנה מידה זעיר מניעות פרמטרים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים של התפתחות הקהילה, ומהן ההשפעות המרכזיות על שפעיהם וארגונם של החברים המיקרוביאליים?התחילו בהכנת מערכי מיקרו-בארים. ראשית, חיתכו שבבי מערכי מיקרו-בארים בודדים מתוך פרוסות סיליקון המודפסות עם מערכים מרובים, באמצעות שורט יהלום. כל שבב בודד מכיל תת-מערכים של בארים בעל תבקריות הנעה בין 5 ל-100 מיקרון בשלוש צפיפויות ריווח שונות.בכל שבב, תבנית הבארות המלאה חוזרת על עצמה ארבע פעמים. לאחר מכן, צרו תא לח עם קופסת טיפים של פיפט ומטלית ספוגה ב-PBS. לאחר מכן, טפטפו 150 µL של תמיסת BSA על כל שבב והדגירו את השבבים בקופסה למשך שעה בטמפרטורת החדר.במקביל, הכינו את החיידקים. סובבו במרכזפוגה תרבית והשעיו אותה ב-500 µL של מצע R2A טרי עם 2% גליקרול. לאחר מכן, מדדו את צפיפות התרבית ב-600 nm וכווןו את הריכוז לצפיפות אופטית של 0.02.לאחר דגירת השבבים, הסר את תמיסת ה-BSA ושטוף את השבבים שלוש פעמים עם PBS. לאחר השטיפות, ייבש את השבבים בעזרת גז חנקן והחזר אותם לתא הלחות. לאחר מכן, הוסף 150 µL של ת сусפנסיית תרבית לכל שבב יבש ודגור את השבבים למשך שעה בטמפרטורה של 4 °C, על מנת לאפשר לחיידקים זמן להיקשר לבארים, אך להאט את חלוקת התאים של כל מזהם אפשרי.כדי להכין שבב להדמיה, הכינו תחילה כיסוי זכוכית מצופה באגרוז עבור כל שבב. הנמיכו נפח קטן של אגרוז, כ-5 mL נדרשים עבור כל כיסוי זכוכית. לאחר מכן, שטפו צד אחד של כיסוי זכוכית באתנול ומכמו אתו במרכז שקופית זכוכית כאשר הצד השטוף פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, מקמו שני ספייסרים של PDMS בעובי של 1 מילימטר לאורך הקצוות הארוכים של כיסוי הזכוכית (cover slip), והזיזו את כיסוי הזכוכית כך ש-1 מילימטר יבלוט מהשקופית. כעת, שפכו כמות מספיקה של אגרוז על כיסוי הזכוכית כדי לכסות אותו לחלוטין. לאחר מכן, השתמשו בשקופית זכוכית שנייה כדי להמיס את האגרוז לעובי אחיד.הכינו מספר הרכבי זכוכית כאלה במקביל. כאשר האגרוז מתחיל להתמצק, העבירו את ההרכבים לטמפרטורה של 4°C. לאחר 15 דקות של קירור, גזרו את עודפי האגרוז מסביב לכיסויי הזכוכית.לאחר מכן, העבירו את המכלולים לצלחוני פטרי ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 °C. לאחר דגירת השבבים עם החיידקים, טבלו כל אחד מהשבבים בנפרד במים אולטרה-טהורים למשך 10 שניות. לאחר מכן, הניחו את השבבים הרטובים על דפם מעל נייר סופג עד שרוב הנוזל ינוטק.כעת, הסירו את החיידקים שלא שקעו לתוך הבארות. גזרו חתיכת סרט דביק באורך השבב הסיליקון והדביקו אותה למעטפת הפרילן שעל הסיליקון. לאחר מכן, קלפו את הסרט כדי להסיר את מעטפת הפרילן והיערכו מיד להפיכת השבב.כעת, הנח את השבב על גבי מכלול של זכוכית כיסוי כך שהבארות המיקרוסקופיות יהיו במגע עם האגרוז. הקפד מאוד לא להזיז או להסיט את השבב מרגע שהגיע למגע עם האגרוז. כעת, העבר את המכלול השלם למחזיק הזכוכית של תא בקרת סביבה המותקן על הבמה, ורכוש תמונות במרווחי זמן (time-lapse) במהלך 24 השעות הבאות, במרווחים הרצויים ובהגדלה של 10x.עבדו את מחסניות התמונות באמצעות תוכנה קונבנציונלית הזמינה בחינם. ראשית, ייבאו את רצף התמונות. לצורך ביצוע ממוצע, טענו את תמונות התיקון או את תמונות השדה האפל.לאחר מכן בצעו חיסור רקע. הגדירו ערך רדיוס כגון 135 pixels ובחרו ב-sliding paraboloid. לאחר מכן, הסירו את תמונת השטח האפל הממוצעת מתמונת שדה ההארה הממוצעת על ידי בחירת שתי התמונות וביצוע פעולת חיסור (subtract).כעת, בצעו תיקון תאורה באופן הבא. הגדירו את הפעולה (operation) לחילוק (divide), הגדירו את i1 לתמונת הבאר, הגדירו את i2 לתמונת התיקון, הגדירו את k1 לממוצע של תמונת התיקון, והגדירו את k2 לאפס. לאחר מכן, לחצו על Create New Window.כדי לכמת את הצמיחה הבקטריאלית במיקרו-בארים, בחרו תחילה את אזורי העניין (regions of interest) באמצעות תוסף המיקרו-מערך (micro array plug in). בתפריט המפה, לחצו על "reset grid" והגדירו את השורות, העמודות וקוטר הבארים. לאחר מכן, מתפריט צורת ה-ROI, בחרו במעגל.כדי להתאים את מערך ה-ROI לתמונה, ניתן להזיז את מערך ה-ROI על ידי לחיצה על מקש ALT או ALT+SHIFT ובחירה ב-ROI השמאלי-עליון באמצעות העכבר. כדי לשנות את גודל ה-ROIs, לחצו על מקש shift תוך כדי בחירה בפינה הימנית-תחתונה של מערך ה-ROI. כדי להתאים את המרווחים בין ה-ROIs, לחצו על מקש shift תוך כדי גרירה של הצד העליון או התחתון של המערך.ברגע שמערך ה-ROI מתאים למערכות הבארים של התמונה, לחצו על Measure RT. לאחר מכן תוצג טבלה עם כל המדידות עבור כל תמונה או נקודת זמן, אותה ניתן להעתיק לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. השוואתו הצמיחה של שני זנים של Pseudomonas aeruginosa. זן אחד מבטא באופן קונסטיטוטיבי חלבון אפקטור רעיל הקשור להפרשות מסוג שש.השני רגיש לפתוגנזה מסוג שש עקב אובדן תפקוד. שניהם מבטאים חלבון פלואורסצנטי שונה. תרביות משולבות נחקרו לאורך זמן ובגדלים שונים של בארות.החיידקים גודלו באופן פרטני וכבתרבית משותפת. צמיחה למשך 20 שעות תועדה במרווחי זמן של 30 דקות. לאחר ביצוע תיקוני תוכנה על נתוני הדימוי, שורטטו מסלולי צמיחה כמותיים.בתרבית המשותפת, הנתונים אינם מעידים על שינוי משמעותי בצמיחה. כדי לקדם את הניתוח, כל מסלול הותאם לפונקציה לוגיסטית משופרת עם שלושה פרמטרים: אות מקסימלי, קצב מקסימלי וזמן השהיה (lag time). ניתוח זה מרמז כילתרבית המשותפת של מינים אלה השפיעה באופן זניח על צמיחתם הכוללת, וכי השונות שנצפתה בעקומות הצמיחה נובעת ככל הנראה מגורמים סביבתיים.לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את ההקמה תוך מספר שעות בלבד אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בתרביות תאים בעלות צמיחה חזקה כדי להתאים נכון את ערכי ה-OD הסופיים של התאים, במטרה להשיג שכבות מקדח אחידות במכלולי השבב, ולהיות ערני במהלך שלב הסרת הפרילן (parylene).יש לזכור כי עבודה עם Pseudomonas aeruginosa עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, חלוק, משקפי מגן וטכניקות אספטיות נאותות בעת ביצוע הליך זה.

assembly-tracking-microbial-community-development-within-microwell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.

ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

מקור: Fattahi, N., et al. ממשקי הידרוג'ל מתכלים לסינון, בחירה ובידוד חיידקים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש בהידרוג'לים מתכלים כדי לבודד מושבות חיידקים בתוך מערכי מיקרו-בארות סיליקון. תאי חיידקים נטענים תחילה למיקרו-בארות, עטופים בהידרוג'ל צולב ומתורבתים במושבות נפרדות. עם חשיפה לאור אולטרה סגול, פירוק ממוקד של ההידרוג'ל מאפשר מיצוי סלקטיבי של מושבות בודדות.

בידוד מבוסס הידרוג'ל מתכלה של מושבות חיידקים במערכי מיקרובאר

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

מתוארים פרוטוקולים לכימות אינטראקציות מכניות בין תאים דבקים ומצעים מיקרו-מובנים. אינטראקציות אלו קשורות קשר הדוק להתנהגויות תאים חיוניות כולל נדידה, התפשטות, התמיינות ואפופטוזיס. הפרוטוקולים מציגים תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח הנקראת MechProfiler, המאפשרת קביעת הכוחות המעורבים עבור כל מיקרו-פוסט.

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

אנו מציגים טכנולוגיה המשתמשת בהרכבה בסיוע נימי בפלטפורמה מיקרופלואידית כדי לעצב עצמים בגודל מיקרו המושעים בנוזל, כגון חיידקים וקוליואידים, למערכים שנקבעו על מצע פולידימתילסילוקסן.

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

מערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA) הוא מערכת תרבית בעלת תפוקה גבוהה, ניתנת להתאמה אישית, זרימה רציפה המאפשרת טיפוח של קהילות מיקרוביאליות מורכבות, ותומכת בניסויים מקבילים לחקר דינמיקת המיקרוביום, אינטראקציות טיפוליות ותגובות מיקרוביאליות לגורמים סביבתיים.

פרוטוקול מעודכן להרכבה ושימוש במערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA)

למד ניתוח במהירות גבוהה של קהילות מיקרוביאליות רב-חברתיות בסביבות סגורות באמצעות מערכי בארות סיליקון. שיטה זו מאפשרת מעקב מקבילי אחר אלפי אינטראקציות מיקרוביאליות ליישומים תעשייתיים, רפואיים וסביבתיים.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

גלה סרטונים נוספים