העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ניתוח מקביל בתפוקה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות מרובות חברים בסביבות סגורות באמצעות מערכי בארות מיקרו סיליקון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקרנה מקבילה מאוד לתפוקה גבוהה של אינטראקציות מיקרוביאליות מקומיות עדינות שהן משמעותיות לתעשייה, לרפואה ולסביבה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האקולוגיה הביו-רפואית והמיקרוביאלית כגון כיצד אילוצים מרחביים הטבועים בקנה מידה עדין מניעים פרמטרים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים של התפתחות קהילתית ומהן ההשפעות העיקריות שלהם על שפע וארגון החברים המיקרוביאליים?

התחל בהכנת מערכי באר המיקרו. ראשית, חתוך שבבי מערך מיקרו בארות בודדים מפרוסות סיליקון המודפסות במספר מערכים באמצעות סופר יהלומים. כל שבב בודד מכיל תת-מערכי בארות בקוטר שנע בין חמישה ל-100 מיקרון בשלוש צפיפויות מרווח שונות.

על כל שבב חוזר גם מוטיב הבארות השלם ארבע פעמים. לאחר מכן, הכינו תא לח בעזרת קופסת קצה פיפטה ומגבון ספוג PBS. לאחר מכן מרחו טיפה של 150 מיקרוליטר של תמיסת BSA על כל שבב ודגרו את השבבים בקופסה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

בינתיים מכינים את החיידקים. סובב תרבית ותלה אותה מחדש ב-500 מיקרוליטר של מדיום R2A טרי עם שני אחוז גליצרול. לאחר מכן מדוד את צפיפות התרבות ב-600 ננומטר והתאם את הריכוז לצפיפות אופטית של 0.02.

לאחר הדגירה של השבב, הסר את תמיסת ה-BSA ושטוף את הצ'יפס שלוש פעמים עם PBS. לאחר השטיפות יש לייבש את השבבים בגז חנקן ולהחזיר אותם לתא הלח. לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטר תרחיף תרבית לכל שבב יבש ודגרו את השבבים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כך שהחיידקים יספיקו להיצמד לבארות, אך חלוקת התאים של כל זיהום אפשרי איטית.

להכנת שבב להדמיה, הכינו תחילה החלקת כיסוי מצופה אגרוז לכל שבב. נוזל נפח קטן של אגרוז, יש צורך בכחמישה מיליליטר לכל החלקת כיסוי. לאחר מכן, שטפו צד אחד של תלוש כיסוי עם אתנול ורכזו אותו על מגלשת זכוכית כשהצד השטוף כלפי מעלה.

לאחר מכן מקם שני מרווחי PDMS בעובי מילימטר אחד לאורך הקצוות הארוכים של החלקת הכיסוי והעבר את החלקת הכיסוי כך שמילימטר אחד יתלה מהמגלשה. כעת, שפכו מספיק אגרוז על תלוש הכיסוי כדי לכסות אותו לחלוטין. לאחר מכן השתמש בשקופית זכוכית שנייה כדי לשטח את האגרוז לעובי אחיד.

הכן כמה מכלולי שקופיות כאלה במקביל. כאשר האגרוז מתחיל להתמצק, העבירו את המכלולים לארבע מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות של קירור, חתוך את עודפי האגרוז סביב החלקות הכיסוי.

לאחר מכן, הכניסו את המכלולים לצלחות פטרי ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שהשבבים דגרו עם החיידקים, טבלו את הצ'יפס במים טהורים במיוחד בזה אחר זה למשך 10 שניות כל אחד. לאחר מכן הניחו את הצ'יפס הרטוב על הקצוות שלהם על טישו עד שרוב הנוזל התנקז.

כעת, הסר את החיידקים שלא התיישבו בבארות. חותכים פיסת סרט באורך שבב הסיליקון ומדביקים אותה לשכבת הפארילן שעל הסיליקון. לאחר מכן מקלפים את הסרט כדי להסיר את שכבת הפארילן ומתכוננים מיד להיפוך השבב.

כעת, הנח את השבב על מכלול שקופיות כך שבארות המיקרו יהיו במגע עם האגרוז. היזהר מאוד לא להזיז או להזיז את השבב לאחר מגע עם האגרוז. כעת, העבר את המכלול השלם למחזיק השקופיות של תא בקרה סביבתי על הבמה וקבל תמונות זמן-lapse במהלך 24 השעות הבאות במרווח הרצוי ובהגדלה של פי 10.

עבדו את אוספי התמונות באמצעות תוכנה קונבנציונלית הזמינה בחינם. ראשית, ייבא את רצף התמונות. לצורך חישוב ממוצע, טען את התיקון או את תמונות השדה הכהה.

לאחר מכן בצע חיסור ברקע. ספק ערך רדיוס כגון 135 פיקסלים ובחר פרבולואיד הזזה. לאחר מכן, הסר את תמונת השדה הכהה הממוצעת מתמונת שדה התאורה הממוצעת על ידי בחירת שתי התמונות ושימוש בפעולת החיסור.

כעת, החל תיקון הארה באופן הבא. הגדר את הפעולה לחלוקה, הגדר את i1 לתמונת הבאר, הגדר את i2 לתמונת התיקון, הגדר את k1 לממוצע תמונת התיקון והגדר את k2 לאפס. לאחר מכן לחץ על צור חלון חדש.

כדי לכמת את גידול החיידקים בבארות המיקרו, בחר תחילה את אזורי העניין עם חיבור מערך המיקרו. בתפריט המפה, לחץ על איפוס רשת וציין את השורות, העמודות וקוטר הבאר. לאחר מכן, מתפריט צורת החזר ההשקעה, בחר עיגול.

כדי להתאים את מערך ה-ROI לתמונה, ניתן להזיז את מערך ה-ROI על ידי לחיצה על מקש ALT או ALT+SHIFT ובחירת ה-ROI השמאלי העליון עם העכבר. כדי לשנות את גודל ההחזר על ההשקעה, לחץ על מקש Shift תוך כדי בחירת הפינה השמאלית התחתונה של מערך ה-ROI. כדי לכוונן את המרווח בין החזר ה-ROI, לחץ על מקש Shift תוך גרירת הצד העליון או התחתון של המערך.

לאחר שמערך ההחזר על ההשקעה מתאים לבארות של התמונה, לחץ על מדידת RT. לאחר מכן תופק טבלה עם כל המדידות עבור כל תמונה או נקודת זמן וניתן להעתיק אותה לגיליון אלקטרוני לניתוח. הושוותה צמיחתם של שני זנים של Pseudomonas aeruginosa. זן אחד מבטא באופן מכונן חלבוני אפקטור רעילים הקשורים להפרשות מסוג 6.

השני רגיש לפתוגנזה מסוג שש עקב אובדן תפקוד. שניהם מבטאים חלבון פלואורסצנטי שונה. תרבויות משותפות נחקרו לאורך ובגדלים שונים של בארות.

החיידקים גודלו בנפרד וכתרבית משותפת. 20 שעות של גדילה צולמו במרווחים של 30 דקות. לאחר שבוצעו תיקוני תוכנה על נתוני ההדמיה, שורטטו מסלולי צמיחה כמותיים.

בתרבות המשותפת, הנתונים אינם מצביעים על שינוי גדול מדי בצמיחה. כדי לקדם את הניתוח, כל מסלול הותאם לפונקציה לוגיסטית שונה עם שלושה פרמטרים, אות מקסימלי, קצב מקסימלי וזמן השהיה. ניתוח זה מצביע על כך שלתרבות המשותפת של מינים אלה הייתה השפעה זניחה על צמיחתם הכוללת והשונות שלהם הנראית בעקומות הגדילה נובעת ככל הנראה מגורמים סביבתיים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את ההתקנה תוך מספר שעות בלבד אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שיהיו תאים הגדלים בצורה חזקה כדי להתאים כראוי את ערכי ה-OD הסופיים של התא כך שיהיו להם שכבות מקדחה אחידות במכלולי השבב ולהיות מודעים במהלך שלב קילוף הפארילן. בעקבות הליך זה, ניתן לטפל בשאלות כמו כיצד ביטוי גנים בתוך כל קהילה משתנה כפונקציה של הרכב וארגון הקהילה, על ידי ניתוח חומר גנטי.

אל תשכח שעבודה עם Pseudomonas aeruginosa עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש להשתמש באמצעי זהירות כגון כפפות, ז'קט, משקפי מגן וטכניקות אספטיות מתאימות בעת ביצוע הליך זה.