פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes במבחנה

המטרות הכלליות של שיטה זו הן לייצר ולזהות פגוציטים ענקיים בתרבית מבחנה שמקורם בנויטרופילים אנושיים במחזור לצורך חקירת תפקידם בתגובות חיסוניות דלקתיות ואנטי דלקתיות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשיג ולזהות תת-אוכלוסייה חדשה של פגוציטים ענקיים המתפתחים מנויטרופילים אנושיים כדי לשמור על תנאי תרבית ארוכי טווח. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור עוד יותר את המשמעות והתפקודים של פגוציטים ענקיים, כמו גם כדי לענות על שאלות מפתח לגבי הפעלתם ופלסטיותם.

המדגימות את ההליך יהיו אווה לדר, עוזרת המחקר שלנו, ואוקסנה רוגובוי, פוסט-דוקטורנטית, שתיהן מהמעבדה שלי. השתמש בסט ורידים סטרילי בקרקפת כדי להשיג לפחות 40 מיליליטר של דם ורידי ממתנדב צעיר ובריא. לאחר מכן מערבבים בעדינות את הדם במכסה זרימה למינלי לבטיחות ביולוגית.

יש לדלל 10 עד 12 מיליליטר של כל דגימת הדם לנפח סופי של 24 מיליליטר עם PBS נטול יונים מחומם מראש המכיל 2% FCS מושבת בחום. לאחר מכן הוסף 12% מיליליטר פוליסוכרוז 1119 לתחתית צינור צנטריפוגה חרוטי פוליפרופילן סטרילי אחד של 50 מיליליטר לכל דגימת דם, ואחריו שכבה זהירה של 12 מיליליטר פוליסוכרוז 1077 על גבי תמיסת השיפוע פוליסוכרוז 1119. פיפטה בזהירות 24 מיליליטר מהדם המדולל על צינורות בודדים של תמיסות שיפוע הצפיפות והפרידו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

יש להבחין בשתי שכבות אטומות שנוצרו. השליכו את הנוזל עד 0.5 סנטימטרים מעל שכבת התאים החד-גרעיניים בכל צינור. לאחר מכן העבירו את התאים החד-גרעיניים מכל דגימה לצינור חדש אחד.

לאחר מכן, השליכו את הנוזל הנותר עד 0.5 סנטימטרים מעל התא הפולימורפו-גרעיני או שכבת ה-PMN והעבירו את ה-PMNs מכל דגימה לצינור חדש אחר. שטפו את ה-PMNs בנפח סופי של 30 מיליליטר PBS המכיל 2% FCS מושבת חום ואחריו ליזה של כדוריות הדם האדומות עם שלושה מיליליטר של קרח סטרילי, קר, היפוטוני, 0.2% נתרן כלורי. לאחר 30 שניות על קרח, החזר את האיזוטוניות עם שלושה מיליליטר של קרח סטרילי 1.6% נתרן כלורי.

לאחר מכן הוסף שישה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI 1640 בינוני בתוספת FCS מושבת בחום ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS מושבת בחום. לאחר הספירה, התאם את הריכוז ל -1.25 עד 1.5 פעמים 10 עד ה-PMN השישי למיליליטר של מדיום תרבית וצלחת מיליליטר אחד של תאים לבאר לבארות בודדות של צלחת של 24 בארות.

לאחר מכן הניחו את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני לח של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והזינו את התרביות על ידי החלפה עדינה של מחצית מהמדיום ב-RPMI 1640 Medium טרי בתוספת 10% FCS מושבת חום כל שלושה ימים. הנויטרופילים יתמיינו לפגוציטים ענקיים תוך שבעה ימים מהתרבית. ביום השביעי לתרבות, הסר בזהירות מחצית מהמדיום מכל באר.

לאחר מכן פיפטה חזקה את המדיום שנותר כדי להסיר את הפגוציטים הענקיים שנדבקו קלות. העבירו את התאים המנותקים משתיים עד ארבע בארות של כל קבוצת טיפול לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מילימטר ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה, תוך השעיית הכדורים ב-100 עד 120 מיקרוליטר של מדיום לכל צינור. לאחר מכן ציידו שניים עד שלושה מחזיקים לכל קבוצת טיפול בשקופיות מיקרוסקופ, כרטיסי סינון ומשפכים.

לאחר מכן, הוסף את כל נפח התאים מכל צינור למשפך הציטוספין המתאים. לאחר מכן טען את המחזיקים על ציטוספין וסובב את התאים על השקופיות. יבש את המגלשות המסתובבות למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש בטוש יציב מים כדי לצייר מחסום הידרופובי סביב התאים ולקבע את הדגימות עם 4% פרפורמלדהיד מתחת למכסה כימי בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות יש לשטוף בקצרה את השקופיות שלוש פעמים עם כ-100 מיקרוליטר PBS לכל כביסה. לאחר מכן לחדור לתאים עם 0.5% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן חמש שטיפות PBS כפי שהודגם זה עתה.

חסום את הקישור הלא ספציפי עם סרום עיזים רגיל של 10% ב-RPMI 1640 Medium לפרק הזמן המתאים ואחריו שטיפת PBS אחת. כעת, הוסיפו כמות קטנה של מים לקופסה כדי לשמור על הלחות ולאחר מכן סמנו את התאים בכ-100 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המתאים המעניין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. לאחר מכן, בצע שטיפת PBS בודדת ולאחר מכן הוסף את הנוגדן המשני המצומד הפלואורסצנטי המתאים.

לאחר 40 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, שטפו את הדגימות כדי להסיר את הנוגדן העודף והרכיבו את השקופיות עם טיפה אחת של מדיום הרכבה לכל דגימה וכיסוי. נתח את השקופיות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת לייזר קונפוקלי תוך 30 עד 120 דקות תחת מטרת שמן אפרסיון פי 40. לאחר מכן חשב את שטח התא, עוצמת הקרינה והלוקליזציה המשותפת באמצעות התוכנה המתאימה.

ניתן לראות התפתחות נויטרופילים לפגוציטים ענקיים תוך שבעה ימים מהתרבית בתמונות אלה. פגוציטוזיס אוטומטי ניכר כבר 90 דקות לאחר תרבית נויטרופילים עם כתמי ממברנה פלואורסצנטיים עם קוטר תא מוגדל מאוד הנראה בימים הרביעי עד השביעי. עם זאת, אם משלימים את תרביות הנויטרופילים GM-CSF ו-IL-4, התאים מפגינים קוטר קטן יותר והקרנות ציטופלזמיות הדומות לתאים דמויי תאים דנדריטיים.

מיקרוסקופ זמן-lapse של הפגוציטים הענקיים בימי התרבית השלישי עד הרביעי ובימים הרביעי עד החמישי חושף תאים ללא תאים או תאים נצמדים קלות עם יכולת תנועה מוגבלת הבולעים באופן פעיל את שאריות הנויטרופילים והפסולת שמסביב. בתרבות נויטרופילים מונוציטים מעורבת זו, ניתן להשוות את הנדידה של מקרופאג זוחל באופן פעיל לתנועה כמעט נייחת של פגוציטים ענקיים המסומנים באופן פלואורסצנטי באותה באר תרבית. ניתן לאמת את מקורם הנויטרופילי של פגוציטים ענקיים על ידי ביטוים החיובי ללא סמני נויטרופילים וחוסר הביטוי שלהם של סמני תאים מונוציטים ודנדריטיים.

פגוציטים ענקיים מייצרים גם מיני חמצן תגובתי בסיסיים ומגיבים לגירוי זימוזאן ו-PMA על ידי פרץ חמצוני. עם זאת, בניגוד למונוציטים או נויטרופילים, הם מגיבים גם על ידי התפרצויות חמצון לגירוי ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מחומצן. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שישה עד שבעה ימים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להחליף מחצית מהמדיום בעדינות בעת הזנת תרביות הנויטרופילים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות צביעה אחרות כדי לענות על שאלות לגבי הפונקציות הנוספות של תאים מסקרנים אלה במבחנה כמו גם in vivo. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הנויטרופילים לחקור את ההפעלה והפלסטיות של נויטרופילים ולזהות תאים אלה in vivo בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים בבני אדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג ולזהות פגוציטים ענקיים בתרבית. אנא אל תשכח שעבודה עם דם אנושי עלולה להיות מדבקת וכי אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות והשלכת כל הנוזלים ושימוש בציוד חד פעמי למיכלי הסכנה הביולוגית המתאימים הם חובה בעת ביצוע הליך זה.