מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

המטרה הכוללת של בדיקת הזדווגות זו היא להעריך את ההשפעות של מוטציות בתוך גן ההעברה המצומדת על יכולתו להשפיע על העברת פלסמיד בהקשר של קומפלקס הפרשה פונקציונלי מסוג 4. שיטה זו מאפשרת לשאול שאלות ספציפיות לחלבון, כגון זיהוי אזורים של אינטראקציות חלבון-חלבון המתרחשות בין חלבוני העברה כשהם מרכיבים מערכת הפרשה פונקציונלית מסוג ארבע בצמידות חיידקים. בטכניקה זו, גנים על פלסמידים מצומדים גדולים נופלים על ידי רקומבינציה הומולוגית.

תפקוד הגן מוערך על ידי מתן גן המטרה לנוק-אאוט על פלסמיד קטן יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שארגון והגדרה הם המפתח לביצוע מוצלח של הליך זה. הכנה ניסויית נכונה נחוצה כדי לקבל תוצאות ניתנות לפרשנות.

התחל פרוטוקול זה בהכנת הפלסמיד המעוכל pBAD33 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יש להריץ כל תקציר על ג'ל אגרוז. בעזרת ארון UV וסכין גילוח סטרילי, חתכו מהג'ל את רצועת הבסיס של 2.8 קילו המתאימה לרצף הצנתורים.

עבוד במהירות כדי למזער את חשיפת ה-UV של ה-DNA. חלץ את ה-DNA מפרוסת הג'ל החתוכה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לפי פרוטוקול היצרן. כדי להגביר את קלטת החתול שחולצה על ידי תגובת שרשרת פולימראז או PCR.

מכינים את תערובת התגובה בצינור PCR סטרילי. השתמש בפריימרים המכילים תלויים הומולוגיים לרצף גן המטרה לצורך רקומבינציה הומולוגית. הגדר בקרה שלילית הנושאת את אותם רכיבים, למעט החלפת ה-DNA של התבנית במים מזוקקים כפולים.

כמו כן, הגדר בקרה חיובית באמצעות תבנית DNA ופריימרים שהוכחו כיעילים בתגובת PCR. מערבבים את כל תוכן התגובה בעדינות על ידי פיפטה. לאחר מכן, הגבירו את קלטת החתול שחולצה באמצעות פרמטרי ה-PCR המפורטים בפרוטוקול הטקסט.

השתמש רק בחמישה מיקרוליטרים מכל תגובה כדי לאשר את גודל ההגברה הנכון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. טהר את מגבר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR עם פרוטוקול היצרן. הוסף 300 ננוגרם של קלטת החתול המוגברת ל-50 מיקרוליטר של תאי DY330R בעלי יכולת חשמלית, המכילים את הפלסמיד pOX38-Tc על קרח.

פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. חזור על שלב זה באמצעות פלסמיד pBAD33 ללא שינוי כבקרה חיובית. לאחר מכן, העבירו את התאים לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש של מילימטר אחד.

אלקטרופוראט את התאים ב-1.8 קילו-וולט עם קבוע זמן של 5.5 מילישניות באמצעות אלקטרופורטור. מיד, לאחר מריחת הדופק, יש לדלל את התאים במיליליטר אחד של מדיה SOC ולהעביר לצינור מיקרופוגה טרי. דגרו על התאים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, יש למנות 100 מיקרוליטר מכל דגימה לצלחות אגר המכילות 10 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין ו -20 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול. מורחים את האליקוט על הצלחת בעזרת מפזר סטרילי. דגרו את הצלחת הפוכה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, בחר את הרקומביננטים המוצלחים. קלטת החתול המוכנסת לתא תעבור רקומבינציה הומולוגית עם הגן המעניין ותיצור את שיבוט הנוק-אאוט pOX38-Tc כלורמפניקול. הפרד את האלקטרופוראט 300 ננוגרם של גן pK184 או פלסמיד מוטנטי של גן pK184 ל-50 מיקרוליטר של תאי DY330R אלקטרו-קומפוטנטיים המכילים את פלסמיד הנוק-אאוט pOX38-Tc כלורמפניקול כמו קודם.

כדי ליצור את תאי התורם XK1200 מבצעים הזדווגות מצומדת ואחריה אלקטרופורציה ליצירת תאי XK1200 הפוגעים הן בנוק-אאוט של כלורמפניקול והן בפלסמיד PK184 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכנת תרבית לילה של תאי תורם XK1200 אלה ב -20 מיליליטר LB סטרילי עם כלורמפניקול וקנאמיצין. הכינו גם תאים של מקבלי MC4100 ב-50 מיליליטר LB עם 50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין באמצעות תאים ממאגר גליצרול או ממושבה בודדת בצלחת אנג אגר.

גדל את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס, רועד ב-200 סל"ד. הוסף גלוקוז לריכוז סופי של 100 מילימולר לכל תאי התורם. למחרת, הכינו 1 מכל 70 דילולים מכל תרבית לילה בנפרד בשני מיליליטר של LB סטרילי עם אותה אנטיביוטיקה.

לגדל את התאים לשלב הבול האמצעי ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. צנטריפוגה בתרבית התאים כדי לגלול את התאים ולהשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את כדור התא פעם אחת עם LB סטרילי קר כדי להסיר את האנטיביוטיקה.

לאחר צנטריפוגה בפעם השנייה כמו קודם, אנו משעים את התאים בשני מיליליטר של LB.In קר, סטריליים קרים כפולים, מביאים 100 מיקרוליטר של תאי תורם ו-100 מיקרוליטר של תאים נמענים ל-800 מיקרוליטר של מדיה סטרילית LB לנפח כולל של מיליליטר אחד. אפשרו לתאים להזדווג בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה מבלי לרעוד. לאחר שעה, מערבול את התאים למשך 30 שניות כדי לשבש את זוגות ההזדווגות.

לאחר מכן, הניחו את התאים על קרח למשך 10 דקות כדי למנוע הזדווגות נוספת. בעזרת תרביות העץ האמצעיות ו-LB סטרילי טרי, הכינו שישה דילולים סדרתיים של תאי התורם והמקבל מ-1 ו-100 ל-1 ו-10 מיליון. על כל אחד משני חצאי צלחת אגר המכילה חומצה נלדיקסית, כלורמפניקול וקנאמיצין, הבחינו ב-10 מיקרוליטר של כל דילול של תאי תורם XK1200.

חזור על איתור לדילולים של תאי MC4100 הנמענים על צלחות אגר המכילות סטרפטומיצין. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בעזרת תערובת המערבולת ו- LB סטרילי טרי, הכינו שישה דילולים של הטרנסקונג'וגנטים.

בחר את תאי ה-MC4100 הטרנס-מצומדים המכילים את ה-pOX38-Tc כלורמפניקול נוק-אאוט וזיהה עשרה מיקרוליטרים של כל דילול בכל מחצית של לוחות האגר המכילים סטרפטומיצין וכלורמפניקול. חזור על הפעולה עבור שתי התערובות הכפולות. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

חשב את יעילות ההזדווגות על ידי ספירת מספר המושבות מאותו איתור דילול עבור כל תורם, מקבל ותאי טרנס-קונג'וגנטים על הצלחות שלהם. כמו כן, ספרו את המושבות המקבלות כדי לבדוק כל הטיה הנובעת ממספר גדול יותר של טרנסקונג'וגנטים מאשר הנמענים באותו דילול נתון. חשב את יעילות ההזדווגות כמספר המושבות הטרנס-מצומדות חלקי מספר המושבות התורמות, כפול 100 כדי לקבל את ערך היעילות לכל 100 תאי תורם.

כאשר מערכת ההפרשה מסוג 4 gene-tra-F נופלת מהפלסמיד pOX38-Tc, זה גורם לאובדן העברה מצומדת של pOX38-Tc traF כלורמפניקול דופק פלסמיד מתורם לתאים מקבלים. עם זאת, כאשר הגן traF מסופק בטרנס על ידי הפלסמיד PK184 traF והתאים התורמים, נצפית התאוששות של העברה מצומדת של פלסמיד הנוק-אאוט pOX38-Tc traF כלורמפניקול. כאשר מסופק עם מוטציות דילול של traF והפלסמיד PK184 בתאי התורם, ניתן לראות אובדן העברה מצומדת של פלסמיד הנוק-אאוט pOX38-Tc traF כלורמפניקול.

אובדן העברה מצומדת מצביע על אזור החלבון החשוב לאינטראקציות חלבון-חלבון בתוך מערכת ההפרשה המצומדת מסוג ארבע. לאחר מכן ניתן לחקור אזור זה ביתר פירוט על ידי מוטציות נקודתיות המשפיעות על יעילות ההעברה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ביום עבודה אחד עם זמני צמיחה צפויים.

פרוטוקול זה יכול להיעשות על תאים אחרים מאלה שהודגמו כאן. ההיבט הקריטי, בשלב זה, הוא שתאי התורם והמקבל אינם מכילים את הפלסמיד המעניין. כך שכאשר אתה מוסיף את הפלסמיד הנוק-אאוט, אתה לא מקבל תוצאות סותרות.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב להיות מאורגן מאוד מכיוון שישנם תנאי גידול ואנטיביוטיקה שונים לתאים תורמים, מקבלי וטרנס-מצומדים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון קריסטלוגרפיה, NMR או ספקטרומטריית מסה על מנת לקבל תמונה מבנית ותפקודית מפורטת של החלבון המבוקש.