אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשלב מבנה DNA רצוי בכרומוזום החיידקי בלוקוס שנקבע מראש. זה מושג על ידי פרוטוקול הזדווגות הכולל ארבעה זני חיידקים מהונדסים. לזן הנמען יש רצף משטח נחיתה המורכב מגן עמידות למיצין מפרט וגן אי קולי בטא גלוקורונידאז המוקף באתרי ATP המשולבים בכרומוזום שלו.

זן התורם P JH 10 נושא פלסמיד המכיל באתרי B המאגפים גן חלבון פלואורסצנטי אדום ממלא, וגן עמידות לאנטיביוטיקה. זן התורם השני של PJC נושא פלסמיד המכיל את האינטגראז הספציפי לאתר מהסטרפטומיצס פאג' C 31 בשליטת מקדם ה-LAC. הזן הרביעי MT 616 מספק את גני ההעברה הנדרשים לצימוד, העברת פלסמידים מתא לתא, וכתוצאה מכך יצירת טרנס דרך הזנים המקבלים.

רכישת שני הפלסמידים הנדרשים להחלפת קלטות בתיווך אינטגראז. החלפת קלטת התורם מהפלסמיד PJ H one 10 עם הסמנים של קלטת משטח הנחיתה על הכרומוזום מביאה לאובדן סמני משטח הנחיתה, SPR ו-UIDA ותחזוקה של קלטת התורם RFP ו-GMR במהגר הטרנס שנוצר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כמו רקומבינציה הומולוגית הוא הקלות והיעילות של הפרוטוקול.

הוא גם ניתן להעברה למגוון רחב של חיידקים. הזן המקבל המשמש בסרטון זה הוא זן S milli latte יומיים לפני הליך ההזדווגות ליצירת אינטגרינים טרנס מחוסנים ממושבה בודדת לחמישה מיליליטר של מדיה TY עם ספקט מיצין דוגר על זן S milli ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים עם ניעור ביום שלפני הליך ההזדווגות לחסן כל אחד מזני ה-e coli הבאים לחמישה מיליליטר של חומר נוזלי LB בתוספת עם האנטיביוטיקה המתאימה DH חמש אלפא המכילה את פלסמיד ביטוי האינטגראז למדיה עם טטרציקלין MT 616 הביניים של המגייזר עם כלורמפניקול ו-DH חמש אלפא המכיל את פלסמיד קלטת התורם למדיה עם גנטמיצין דגירה על שלושת זני ה-e Coli למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד כדי להכין את התאים להליך ההזדווגות. העבירו 1.5 מיליליטר מכל אחת מארבע התרביות לתוך צינור וצנטריפוגה ב-17,000 פעמים G למשך 30 שניות כדי לאסוף את גלולת התא, להשליך את המדיה ולהשעות מחדש כל כדור תא במיליליטר אחד של צנטריפוגה סטרילית של 0.85% נתרן כלורי את הצינורות שוב לאחר השלכת ה-Resus הסופרנטנט להשעות כל כדור ב-100 מיקרוליטר של נתרן כלורי סטרילי 0.85% נתרן כלורי באמצעות פיפטה בנפרד 10 מיקרוליטר של תרבית שטופה לכל אחד מסננים על צלחת אגר TY רגילה.

כתמים אלה הם נקודות בקרה. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר מכל זן, למעט אי קולי DH חמש אלפא המכיל Pjc 2 בצינור סטרילי וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 120 מיקרוליטר של תערובת זו על צלחת אגר TY רגילה. נקודה זו היא השליטה השלילית ללא אינטגראז.

לבסוף, מוסיפים 40 מיקרוליטר מכל אחד מארבעת הזנים בתערובת צינור סטרילית ונקודתיים. 160 מיקרוליטר מתערובת זו על אותה צלחת אגר TDY. נקודה זו היא נקודת ההזדווגות של חילופי קלטות בתיווך אינטגראז.

הניחו את הצלחת במנדף זרימה למינרית והניחו לכתמים להתייבש כ-20 דקות לאחר מכן. אטמו את הצלחת ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במהלך הלילה שלאחר רצף פרוטוקול ההזדווגות. שתי נקודות הבקרה ונקודת ההזדווגות IMCE על צלחות אגר TY בתוספת סטרפטומיצין וגנטמיצין.

הזן המקבל S milli נושא מוטציה המעניקה עמידות ברמה גבוהה לסטרפטומיצין לחישוב יעילות IMCE Resus משהה כרבע מנקודת ההזדווגות של IMCE ב-500 מיקרוליטר של סטרילי 0.85% נתרן כלורי מבצע דילולים סדרתיים פי עשרה ל-10 לצלחת השביעית השלילית דילולים נוטים לשלילי שניים עד 10 לחמש השליליים על צלחות אגר TY בתוספת סטרפטומיצין, Gentamycin, ו-XGL לבחירת מהגרים טרנסג'נדרים. דילול צלחות נוטה ל-3 עד 10 השלילי לשבע השלילי בלוחות אגר TY, בתוספת סטרפטומיצין ו-xgl לבחירה הן עבור מהגרים טרנסג'נדרים והן עבור נמענים פוטנציאליים. סך כל מקבלי IE דוגרים על צלחות ב-30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

צפה בטרנס RFP באור ירוק ובאמצעות מסנן אדום חשב את אחוז יעילות ה-IMCE כ-CFU של מהגרים טרנסג'נדרים בהשוואה ל-CFU של סך כל המקבלים, כמחצית מהטרנסים יעברו חילופי דברים אמיתיים מה שהופך אותם ללבנים וחסרי רגישות לאחר שלושה ימים של דגירה על טיי בתוספת סטרפטומיצין וגנטמיצין, לא אמורה להיות צמיחה בזני הביקורת הבאים, אין בקרת אינטגראז s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH חמש אלפא המכיל P JH אחד 10 בקרה ו e coli DH חמש אלפא המכיל PJC שני בקרה. לעומת זאת, פס ה-IMCE מנקודת ההזדווגות אמור להיות בעל צמיחה משולבת על פס הראש ומושבות רבות בפס השני. שתי התמונות הבאות מציגות השעיית רסוס של דילול של 10 לשני השלילי של נקודת ההזדווגות על TY סטרפטומיצין xgl אגר, ועל סטרפטומיצין TY Gentamycin xgl אגר על הסטרפטומיצין TY Gentamycin xgl agar.

המושבות הכחולות הן רקומביננטות בודדות. בעוד שהמושבות הלבנות הן אינטגרינים טרנס שעברו חילופי קלטות אמיתיים כאשר הם נראים באור ירוק ודרך מסנן אדום, הנטייה לדילול השלילי של השעיית ה-resus של נקודת ההזדווגות על TY strept cin xgl agar חסרה פלואורסצנטיות. לעומת זאת, הדילול של 10 עד מינוס שתיים של השעיית החייאת נקודת ההזדווגות על סטרפטומיצין Ty Gentamycin Xgl Agar מראה שתי רמות של פלואורסצנטיות.

המושבות הבהירות יותר תואמות למושבות כחולות ובעלות ביטוי RFP גבוה יותר, ככל הנראה עקב קידום קריאה ממקדם ה-LAC בווקטור. המושבות הפחות בהירות תואמות את המושבות הלבנות, שעברו החלפת קלטות אמיתיות ומכילות RFP עם המקדם המיידי שלו בלבד וללא קריאה ממקדם ה-LAC. מגמות אלה מהגרים צריכים להיות גם רגישים לכתמים.

היעילות של אינטגרציה טרנסג'נדרית המתבטאת באחוז המהגרים הטרנסג'נדרים לסך הנמענים צריכה להיות בטווח של 0.5%לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בצימוד חיידקים באמצעות הזנים המהונדסים שלנו כדי להחדיר מבני DNA לכרומוזום החיידקי.