Name: אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למד שיטה לשילוב DNA ספציפי לכרומוזום בקטריאלי באמצעות ΦC31 integrase וקוניוגציה. השיטה משתמשת בזנים מהונדסים עם landing pad להנדסה גנטית מדויקת בחיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כדי מרגרט סי סמית עבור חביב מתן שיבוט integrase גיוס תמיכה של: הגנום קנדה / הגנום Prairie NSERC גילוי מענקים פרויקט אסטרטגי

1. הפקה של תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת נוזלי סטריליים: TY במילה 10 (5 גר &#39;/ ליטר tryptone, 3 גר&#39; / ליטר תמצית שמרים, 0.44 גר &#39;/ ליטר כלוריד מייבשים סידן), וכן 11 LB (10 גר&#39; / ליטר tryptone, 5 גר &#39;/ ליטר תמצית שמרים, 5 גר&#39; / נתרן כלורי, pH 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מהמושבה אחת: SmUW227 (ס &#39;meliloti LP-זן: בנייה יתוארו במקום אחר, להתאמץ פרטים בנייה זמינים לפי בקשה) () לתוך 5 מ&quot;ל של TY התקשורת עם מיקרוגרם 50 / spectinomycin מ&quot;ל. לחסן את הזנים הבאים לתוך 5 מ&quot;ל של התקשורת נוזלי LB, להשלים עם אנטיביוטיקה שניתנה: E. coli DH5α 12 המכיל pJC2, הביטוי integrase פלסמיד, עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל טטרציקלין, א &#39; coli MT616 13, mobilizer, עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol, וא &#39; coli DH5α המכיל pJH110, קלטת התורם פלסמיד, עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה א &#39; קולי זנים לילה ב 37 &amp;מעלות: C עם הרעידות קבוע. דגירה ס meliloti מאמץ על 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים עם רעד. אפשר לקבל ש meliloti לילה עם הבידוד גדול יותר (1:500 תת התרבות רווי) תרבות. </li></ol> 2. תרבות הכנה ערבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1.5 מ&quot;ל של תרבות זן זה על ידי איסוף תאים גלולה ידי צנטריפוגה ב XG 17,000 במשך 30 שניות resuspending ב 1 מ&quot;ל NaCl 0.85% סטרילי, חוזר פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl של NaCl 0.85% סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לזהות 10 μl של תרבות שטוף עבור זן אחד על צלחת אגר רגיל TY. נקודות אלו הן נקודות השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של זן זה כולל א coli DH5α 12 המכיל pJC2 בצינור תערובת סטרילי, ו 120 במקום μl של תערובת זו על צלחת אגר רגיל TY. נקודה זו היא שליטה ללא integrase שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של כל זן לא סטריליתאובה, לערבב, ו במקום 160 μl של תערובת זו על צלחת אגר רגיל TY. במקום זה המקום ההזדווגות IMCE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר נקודות לייבוש מכסה המנוע זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם צלחות דגירה על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. הבידוד של טרנס integrants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת פס כתמים ספוט IMCE על גבי צלחות אגר TY במילה השלימו עם 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין (SmUW227 מבוסס על Rm1021 שנושא מוטציה המקנה ברמה גבוהה התנגדות סטרפטומיצין 14) ו - 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך חישוב יעילות IMCE, resuspend כ ¼ של המקום ההזדווגות IMCE ב 500 μl NaCl 0.85% סטרילית. תן של פי 10 עד 10 דילולים סדרתי -7. דילולים פלייט -2 10 עד 10 -5 על צלחות אגר TY במילה השלימו עם 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ו סטרפטומיצין 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל גנטמיצין, כדי לבחור את טרנס integrants. צלחת דילולים 10 thr -3ough 10 -7 על צלחות אגר TY במילה השלימו עם 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין, כדי לבחור הן טרנס integrants ומקבלי פוטנציאליים, מקבלי בסך הכל כלומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בידוד של טרנס integrants markerless resuspend כרבע במקום הזדווגות IMCE ב μl 500 של NaCl 0.85% סטרילית. תן של פי 10 דילולים סדרתי עד 10 -6. צלחת דילולים 10 -4 עד 10 -6 על ארבע צלחות אגר TY במילה השלימו עם 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ו סטרפטומיצין 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל X-gluc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפייה RFP טרנס integrants תחת אור ירוק (525 ננומטר) ודרך פילטר אדום (&gt; 610 ננומטר) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יעילות IMCE אחוזים CFU של טרנס integrants לעומת CFU מכלל המקבלים. כמחצית טרנס integrants לא עברו חילופי קלטת נכון מה שהופך אותם לבן spectinomycin רגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחפש את markerless טרנס integrants (Wכאן וקטור התורם אינו מכיל GM r כמו pJH110) מסך מושבה לבן (תקופת הדגירה ממושכת, 1-2 ימים נוספים בטמפרטורת החדר, ישפר את הבידול של המושבות באמצעות X-gluc, זה הכרחי ש &#39; meliloti SmUW227), לאשר את הרגישות spectinomycin של המושבה על ידי הקרנה על צלחת אגר TY ללא אנטיביוטיקה צלחת אגר TY המכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל spectinomycin. </li></ol> 4. נציג תוצאות אחרי שלושה ימים של דגירה על TY השלימו עם סטרפטומיצין ו גנטמיצין את הפסים שליטה צריך שום צמיחה. פס IMCE צריך הצמיחה confluent על פס הראש מושבות רבות על פס 2, כפי שניתן לראות באיור 2. את היעילות של שילוב, טראנס, מבוטא באחוזים של טרנס integrants לנמענים הכל, צריך להיות בטווח של 0.5%. כמחצית טרנס integrants יהיה spectinomycin רגיש לבןמראה שהם עברו חילופי קלטת נכון. טרנס integrants המכילים את הקלטת RFP הבוחן תורם pJH110 צריך להציג להבחין הקרינה RFP כאשר הוא מוצג באור ירוק (525 ננומטר) ועל דרך מסנן אדום (&gt; 610 ננומטר) 15. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. דמות הצמידה תערובת איור: בעזרת הביטוי של הגנים העברה pRK600, כל פלסמידים מועברים באופן אקראי מתא לתא. העברת התוצאה היא יצירה של טרנס integrants בתערובת, באמצעות רכישה של LP-זן של שני פלסמידים הנדרשים IMCE, integrase (int) pJC2 עוזר הפלסמיד ואת pJH110 התורם פלסמיד. קלטת התורם מתורם ללא שכפול הפלסמיד (pJH110) הוא החליף אגב פעילות ΦC31 integrase עם סמנים של קלטת LP-על כרומוזום, וכתוצאה מכך אובדן של LP-סמנים (פ&quot;מR ו uidA) ושמירה על קלטת התורם (RFP ו-GM R) ב שהתקבל חוצה integrant. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. : B במקום הזדווגות צלחת על צלחת TY הלא סלקטיבי מראה תערובות תאים יבשים על פני אגר:. נקודות הזדווגות מפוספסים בצלחת סטרפטומיצין גנטמיצין-X-gluc-, מלמעלה בכיוון השעון נשאר כל שליטה integrase, IMCE אל ס meliloti, א coli DH5α המכיל השליטה pJC2, א coli DH5a המכיל pJH110 שליטה, א &#39; MT616 השליטה coli, וס &#39; . meliloti UW227 השליטה C: 10 -2 דילול resuspension במקום הזדווגות על סטרפטומיצין TY-X-gluc אגר D:. 10 -2 דילול resuspension במקום הזדווגות על אגר סטרפטומיצין, גנטמיצין, X-gluc TY (מושבות כחולות הם recombinants בודדים, מושבות לבנים עברו האמיתי. החלפת קלטת) E: 10 -2 דילול resuspension ההזדווגות כתם על אגר סטרפטומיצין-X-gluc TY מראה חוסר הקרינה F:. 10 -2 דילול resuspension במקום הזדווגות על אגר סטרפטומיצין, גנטמיצין, X-gluc TY מראה שתי רמות של הקרינה (מושבות בהירים מתאימות מושבות כחולות יש יותר ביטוי RFP ככל הנראה בשל מקדם לקריאה אם כי מתוך רצף וקטור, שם מושבות שעברו נכון, הקלטת חילופי מכילים RFP עם האמרגן רק המיידית ללא לקריאה באמצעות האמרגן של לאק ב וקטור, אשר נעדר.).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
<li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li>
<li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li>
<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
<li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li>
<li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19%3A+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li>
<li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase%2Finvertase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li>
<li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+mobilizable+cosmid+vector%2C+pRK7813%2C+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li>
<li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li>
<li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+theatre%3A+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li>
<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הטכניקה IMCE מאפשר שילוב יעיל של קלטת ה-DNA בודד מוקף attB לתוך לוקוס-LP של זן מהונדס בעבר. ברגע מבנה הרצוי משובט במקום RFP ליצור את הקלטת התורם, הטכניקה אינה דורשת טיהור שינוי ה-DNA עתידיים, מה שהופך אותו מאוד חזקים. זה קריטי, כי בקרות מתאימות הצמיחה כלולות, כדי להיות בטוח עמידות לאנטיביוטיקה בשל הקמתה של טרנס integrants וגורמים אחרים לא. IMCE מייצרת טרנס integrants ביעילות כ 0.5%. לעומת זאת, מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> אגר כיתה בקטריולוגית </td><td&gt; Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Tryptone </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום כלוריד </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td> גולד ביוטכנולוגיה בע&quot;מ </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli MT616 זן </td><td> ניתן להזמין </td><td></td><td> משמש גם מחוץ למעבדה שלנו </td></tr><tr><td> E. coli pJC2 זן </td><td> בבית, זמין לפי בקשה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli pJH110 זן </td><td> בבית, זמין על ידי requesלא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 זן </td><td> בבית, זמין לפי בקשה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: Φc31 מתווכת integrase קלטת exchange (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

כרומוזום חיידקי ניתן להשתמש כדי לשמור על דנ&quot;א זר ביציבות בטווח מגה בסיס 1. אינטגרציה לתוך הכרומוזום עוקף בעיות כגון שכפול הפלסמיד, יציבות הפלסמיד, אי התאמה פלסמיד, ושונות פלסמיד מספר עותק. שיטה זו משתמשת integrase באתר ספציפי של הפאג Streptomyces (Φ) C31 2,3. Integrase ΦC31 מזרז רקומבינציה ישירה בין שני אתרי DNA ספציפיים: attB ו attP (34 ו - 39 נ&quot;ב, בהתאמה) 4. רקומבינציה זו יציבה ולא לחזור 5. &quot;משטח נחיתה&quot; (LP) הרצף המורכב של הגן spectinomycin עמידות, aadA (SPR), וכן א &#39; SS-coli glucuronidase גן (uidA) מוקף אתרים attP שולב הכרומוזומים של Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, ו tumefaciens Agrobacterium באזור intergenic, אניPC לוקוס, ואת מוקד תטא, בהתאמה. ס meliloti נעשה שימוש בפרוטוקול זה. וקטורים התורמות Mobilizable המכילים אתרי attB משני צדי אדום stuffer חלבון פלואורסצנטי (RFP) גנים גן עמידות לאנטיביוטיקה יש גם לבנות. בדוגמה זו pJH110 גנטמיצין פלסמיד עמיד משמש. הגן RFP 6 עשוי להחליף את המבנה הרצוי באמצעות SPH אני Pst א לחלופין מבנה סינתטי מוקף אתרים attB יכול להיות תת משובטים לתוך וקטור mobilizable כגון pK19mob 7. הביטוי של הגן ΦC31 integrase (משובטים מ pHS62 8) הוא מונע על ידי האמרגן לאק, על מגוון רחב מארח mobilizable פלסמיד pRK7813 9. פרוטוקול ההזדווגות tetraparental משמש להעברת קלטת התורם אל זן LP ובכך להחליף את סמני ברצף LP עם קלטת התורם. תאים אלה הם טראןS-integrants. טרנס integrants נוצרים ביעילות אופיינית של 0.5%. טרנס integrants נמצאות בדרך כלל בתוך 500-1,000 מושבות הראשונים שהוקרנו על ידי רגישות לאנטיביוטיקה או כחול לבן ההקרנה באמצעות 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-beta-D-glucuronic חומצה (X-gluc). פרוטוקול זה מכיל את ההזדווגות ובחירת נהלים ליצירה בידוד טרנס integrants.

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ&quot;א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

ניתן להשתמש בכרומוזום הבקטריאלי כדי לשמר באופן יציב DNA זר בטווח של מגה-בסיסים1. אינטגרציה לכרומוזום עוקפת בעיות כגון...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשלב מבנה DNA רצוי בכרומוזום החיידקי בלוכוס שנקבע מראש. דבר זה מושג באמצעות פרוטוקול הזדווגות הכולל ארבעה זנקי חיידקים מהונדסים. לזנק המקבל יש רצף "landing pad" המורכב מגן עמיד לספקמיצין ומגן e coli beta glucuronidase, המוקפים באתרים של ATP ששולבו בכרומוזום שלו.זן התורם P JH one 10 נושא פלסמיד המכיל אתרי B המקיפים גן "stuffer" של חלבון פלואורסצנטי אדום, וגן לעמידות לאנטיביוטיקה. זן התורם PJC two נושא פלסמיד המכיל את האינטגרז הספציפי לאתר מהפאג C 31 של streptomyces תחת בקרתו של פרומוטר LAC. הזן הרביעי, MT 616, מספק את גני ההעברה הדרושים לקוניוגציה – העברת פלסמידים מתא לתא, אשר מביאה ליצירת טרנסגנים דרך זני המקבל.השגת שני הפלסמידים הדרושים להחלפת קסטה המתווכת על ידי אינטגראזה. ההחלפה של קסטת התורמה מהפלסמיד PJ H one 10 עם הסמנים של קסטת נחיתת המטרה (landing pad) על הכרומוזום גורמת לאובדן סמני נחיתת המטרה, SPR ו-UIDA, ולשימור קסטת התורמה RFP ו-GMR בטרנס-אימיגראנט המתקבל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו רקומבינציה הומולוגית, הוא הפשטות והיעילות של הפרוטוקול.הוא ניתן להעברה גם למגוון רחב של חיידקים. זן המקבל המשמש בסרטון זה הוא זן S. milli latte. יומיים לפני הליך ההזדווגון ליצירת trans integrins, יש להעביר מושבה בודדת אל תוך 5 mL של מצע TY עם spect mycin. יש לדגור את זן ה-S. milli בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עם ניעור. ביום שלפני הליך ההזדווגון, יש להעביר כל אחד מזני ה-e coli הבאים אל תוך 5 mL של מצע LB נוזלי בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה: DH5α המכיל את פלסמיד ביטוי האינטגראז למצע עם tetracycline; את MT616, המובליזטור, למצע עם chloramphenicol; ואת DH5α המכיל את פלסמיד קסטת התורם למצע עם Gentamycin. יש לדגור את שלושת זני ה-e coli למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור קבוע. כדי להכין את התאים להליך ההזדווגון, העבירו 1.5 mL מכל אחת מארבע התרביות לשפופרה וסבבו בצנטריפוגה ב-17,000 ×g למשך 30 שניות לאיסוף משק התאים. השליכו את המצע והשעיכו מחדש כל משק תאים ב-1 mL של 0.85% sodium chloride סטרילי. סבבו את השפופרות שוב בצנטריפוגה, ולאחר השלכת הנוזל העליון, השעיכו מחדש כל משק ב-100 µL של 0.85% sodium chloride סטרילי. בעזרת פיפטה, טפטפו באופן פרטני 10 µL מתרבית שטופה של כל זן על פלטת TY agar רגילה.נקודות אלו הן נקודות בקרה. לאחר מכן, העבירו 40 µL מכל זן, למעט e coli DH5α המכיל Pjc2, למבחנה סטרילית וערבבו באמצעות פיפטינג מעלה ומטה; טפטפו 120 µL מתערובת זו על פנית TY agar חלקה. נקודה זו היא בקרת השלילה ללא אינטגרז.לבסוף, העבירו 40 µL מכל אחד מארבעת הזנקים לשפופרת ערבוב סטרילית וערבבו. טפטפו 160 µL מתערובת זו על אותה צלחת אגר TDY. נקודה זו היא נקודת ההזדווגות להחלפת קסטה בתיווך אינטגראז (integrase mediated cassette exchange).הניחו את הפלטה במכסה זרימה למינרית והמתינו כ-20 דקות עד להתייבשות הנקודות. אטמו את הפלטה והדגרימו בטמפרטורה של 30 °C למשך לילה, יום לאחר ביצוע פרוטוקול הריסוס של ההשבחה. רססו את שתי נקודות הבקרה ואת נקודת ההשבחה של ה-IMCE על פלטות אגר TY המועשרות בסטרפტომייצין ובגנטמיצין.זן המקבל S milli נושא מוטציה המקנה עמידות ברמה גבוהה לסטפטומייסין לצורך חישוב יעילות ה-IMCE. השביה בערבוב (Resus suspend) כרבע מנקודת ההזדווגות של ה-IMCE ב-500 microliters של 0.85% Sodium chloride סטרילי. בצע מהלולי דילול עשריים עד לדילול של 10 to the negative seventh. זרע את הדילוחיות מ-10 to the negative two ועד 10 to the negative five על מצעי TY agar המועשרו בסטפטומייסין, גנטמיצין ו-xgl כדי לבחור את התרנסימיגרנטים (trans immigrants). זרע את הדילוחיות מ-10 to the negative three ועד 10 to the negative seventh על מצעי TY agar המועשרו בסטפטומייסין ו-xgl כדי לבחור הן תרנסימיגרנטים והן מקבלים פוטנציאליים. סכום המקבלים הכולל (IE total recipients). דגור את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך שלושה ימים.צפו ב-RFP trans תחת אור ירוק ובאמצעות מסנן אדום; חשבו את אחוז יעילות ה-IMCE כ-CFU של trans immigrants בהשוואה ל-CFU של סך המקבלים. בערך מחצית מה-trans יעברו החלפה אמיתית, מה שיהפוך אותם ללבנים ולא רגישים לאחר שלושה ימי דגירה על TY המועשר בסטפטומייצין וגנטמיצין. לא אמורה להיות צמיחה בזני הבקרה הבאים: בקרת no integrase s milli latte UW 2 27, בקרת e coli MT 616, בקרת e coli DH five alpha המכילה P JH one 10, ובקרת e coli DH five alpha המכילה PJC two. בניגוד לכך, למריחת ה-IMCE מנקודת ההזדווגות צמיחה רציפה (confluent) במריחה הראשונית ומושבות רבות במריחה השנייה. שתי התמונות הבאות מראות תרחיפי resus של דילול 10⁻² של נקודת ההזדווגות על agar TY streptomycin xgl, ועל agar TY streptomycin Gentamycin xgl; על ה-TY streptomycin Gentamycin xgl agar.המושבות הכחולות הן רקומביננטים בודדים. בעוד שהמושבות הלבנות הן טרנס-אינטגרינים שעברו החלפת קסטה אמיתית כאשר הם נצפים תחת אור ירוק ובמסננת אדומה, הרי שהדילול 10⁻² של תרחיף ה-resus של נקודת ההזבב על מצע TY strept cin xgl אינו מראה פלואורסצנציה. לעומת זאת, הדילול 10⁻² של תרחיף ה-resus של נקודת ההזבב על מצע Ty streptomycin Gentamycin Xgl מראה שתי רמות של פלואורסצנציה.המושבות הבהירות יותר תואמות למושבות כחולות ובעלות ביטוי RFP גבוה יותר, ככל הנראה עקב קריאה רציפה (read through) מהפרומוטור LAC בווקטור. המושבות הפחות בהירות תואמות למושבות לבנות, שעברו החלפת קסטה אמיתית ומכילות את ה-RFP עם הפרומוטור המיידי שלו בלבד, ללא קריאה רציפה מהפרומוטור LAC. מגמות אלו אמורות להיות גם רגישות לספקטימיצין.היעילות של השילוב הטרנסגני (trans integration), המבוטאת כאחוז המהגרים הטרנסגניים מכלל המקבלים, צריכה להיות בטווח של 0.5%. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי השימוש בקונג'וגציה חיידקית באמצעות הזנים ההנדסיים שלנו להחדרת מבני DNA לכרומוזום החיידקי.

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מדגימים שילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר בתיווך phiC31 בעובר אנופלס באמצעות מיקרו-הזרקה. שיטה זו מסייעת להחדיר גנים רצויים למערכת מארחת למחקר וליישומים תעשייתיים.

phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: טכניקת מיקרו-הזרקה לשילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר לווקטור אנופלס

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של אינטגרונים מסוג 1 וקלטות הגנים הקשורות אליהם במזון.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג&#39;ין קלטות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנוקאאוט של גן מעניין המעורב בצימוד פלסמיד ולאחר מכן מנתחים את השפעת היעדרו באמצעות מבחני הזדווגות. תפקוד הגן נחקר עוד יותר לאזור ספציפי ברצף שלו באמצעות מחיקה או מוטציות נקודתיות.

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

המובאת כאן היא שיטה פשוטה ליצירת ספריית ההכנסה transposon בצפיפות גבוהה ב- Escherichia coli או שיגלה flexneri באמצעות קוניוגציה. פרוטוקול זה מאפשר היצירה של אוסף של מאות אלפי מוטציות ייחודיות של חיידקים על ידי החדרת גנומית אקראי transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

פיתחנו מטריצה ​​ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ​​ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.

נוהל הנדסה ריאות

למד שיטה לשילוב DNA ספציפי לכרומוזום בקטריאלי באמצעות ΦC31 integrase וקוניוגציה. השיטה משתמשת בזנים מהונדסים עם landing pad להנדסה גנטית מדויקת בחיידקים.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

גלה סרטונים נוספים