אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשלב מבנה DNA רצוי בכרומוזום החיידקי בלוכוס שנקבע מראש. דבר זה מושג באמצעות פרוטוקול הזיווג הכולל ארבעה זני חיידקים מהונדסים. זן המקבל כולל רצף של "landing pad" המורכב מגן עמידות ל-spec mycin ומגן ה-e coli beta glucuronidase, המוקפים באתרים של ATP ששולבו בכרומוזום שלו.

זן התורם P JH one 10 נושא פלסמיד המכיל שני אתרי B המקיפים גן "stuffer" של חלבון פלואורסצנטי אדום, וגן לעמידות לאנטיביוטיקה. זן התורם PJC two נושא פלסמיד המכיל את האינטגראז הספציפי לאתר מהפאג C 31 של streptomyces תחת בקרתו של מקדם LAC. הזן הרביעי, MT 616, מספק את גני ההעברה הדרושים לקונז'וגציה – העברת פלסמידים מתא לתא, מה שמוביל ליצירת טרנספוסונים דרך זני המקבל.

השגה של שני הפלסמידים הדרושים להחלפת קסטה המתווכת על ידי אינטגראז. החלפת קסטת התורם מהפלסמיד PJ H one 10 עם הסמנים של קסטת נקודת הנחיתה (landing pad) על הכרומוזום מובילה לאובדן סמני נקודת הנחיתה, SPR ו-UIDA, ולשימור קסטת התורם RFP ו-GMR בטרנס-אימיגרנט שנוצר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון רקומבינציה הומולוגית, הוא הפשטות והיעילות של הפרוטוקול.

הוא ניתן להעברה גם למגוון רחב של חיידקים. זן המקבל המשמש בסרטון זה הוא זן S. milli latte. יומיים לפני הליך ההזדווגון ליצירת trans integrins, זרעו קולוניה בודדת לתוך 5 ml של מצע TY עם spect mycin. דגרו את זן ה-S. milli בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עם ניעור. ביום שלפני הליך ההזדווגון, זרעו כל אחד מזני ה-E. coli הבאים לתוך 5 ml של מצע LB נוזלי בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה: DH5α המכיל את הפלסמיד לביטוי integrase למצע עם tetracycline; MT616, המנייד (mobilizer), למצע עם chloramphenicol; ו-DH5α המכיל את פלסמיד קסטת התורם למצע עם Gentamycin. דגרו את שלושת זני ה-E. coli למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C תחת ניעור קבוע. כדי להכין את התאים להליך ההזדווגון, העבירו 1.5 ml מכל אחד מארבעת התרביות למבחנה וסובבו בצנטריפוגה ב-17,000 ×g למשך 30 שניות כדי לאסוף את משקע התאים. שפכו את המצע והשעיקו שוב כל משקע תאים ב-1 ml של 0.85% sodium chloride סטרילי. סובבו את המבחנות שוב בצנטריפוגה, ולאחר השפכת הנוזל העליון, השעיקו כל משקע ב-100 µL של 0.85% sodium chloride סטרילי באמצעות פיפטה. טפטפו בנפרד 10 µL מתרבית שטופה של כל זן על פלטה של TY agar רגילה.

נקודות אלו הן נקודות בקרה. לאחר מכן, העבירו 40 µL מכל זן, למעט e coli DH5α המכיל Pjc2, למבחנה סטרילית וערבבו על ידי פיפוט למעלה ולמטה. טפטפו 120 µL מתערובת זו על מצע TY agar רגיל. נקודה זו מהווה את בקרת השלילה ללא אינטגראז.

לבסוף, הוסף 40 µL מכל אחד מארבעת הזנים לשפרוֹר סטרילי, ערבב וטפטף 160 µL מתערובת זו על אותה צלחת TDY agar. נקודה זו היא נקודת ההזדווגות להחלפת קסאט המתווכת על ידי אינטגראז.

הניחו את הפלטה במכסה זרימה למינרית והמתינו כ-20 דקות לייבוש הנקודות. אטמו את הפלטה והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הלילה, ביום שלאחר ביצוע פרוטוקול ההדבקה (mating protocol streak). העבירו את שתי נקודות הביקורת ואת נקודת ה-IMCE mating אל פלטות TY agar בתוספת streptomycin ו-gentamycin.

זן המקבל S milli נושא מוטציה המקנה עמידות ברמה גבוהה לסטreptomycin לצורך חישוב יעילות ה-IMCE. השעו כרבע מנקודת ההכרעה של ה-IMCE ב-500 µL של 0.85% Sodium chloride סטרילי. בצעו דילולים סדרתיים פי עשרה עד לדילול 10⁻⁷. פזרו דילולים מ-10⁻² עד 10⁻⁵ על מצעי TY agar בתוספת streptomycin, gentamycin ו-xgl כדי לבחור את התרמימיגרנטים (trans immigrants). פזרו דילולים מ-10⁻³ עד 10⁻⁷ על מצעי TY agar בתוספת streptomycin ו-xgl כדי לבחור הן את התרמימיגרנטים והן את המקבלים הפוטנציאליים. סך כל המקבלים (IE total recipients). דגרו את המצעים בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.

הצגו את ה-RFP trans תחת אור ירוק ובאמצעות מסנן אדום. חשבו את אחוז יעילות ה-IMCE כ-CFU של trans immigrants בהשוואה ל-CFU של סך המקבלים. בקירוב, מחצית מה-trans יעברו החלפה אמיתית, מה שיהפוך אותם ללבנים ובלתי רגישים לאחר שלושה ימי דגירה על TY המועשר ב-streptomycin ו-Gentamycin. לא אמורה להיות צמיחה בזני הבקרה הבאים: no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha הכולל P JH one 10 control ו-e coli DH five alpha הכולל PJC two control. לעומת זאת, ב-IMCE streak מנקודת ההכלאה אמורה להיות צמיחה רצופה (confluent) בקו הראשון ומושבות רבות בקו השני. שתי התמונות הבאות מראות תרחיפי resus של דילול 10⁻² של נקודת ההכלאה על מצע TY streptomycin xgl agar, ועל מצע TY streptomycin Gentamycin xgl agar; על מצע TY streptomycin Gentamycin xgl agar.

המושבות הכחולות הן רקומביננטים בודדים. בעוד שהמושבות הלבנות הן אינטגרינים טרנס שעברו חילוף קסטה אמיתי כאשר הם נצפים תחת אור ירוק ובמסננת אדומה, המגמה בדילול השלילי שתיים של תרחיף resus בנקודת ההכלאה על מצע TY strept cin xgl חסרה פלואורסצנציה. לעומת זאת, דילול של 10 למינוס שתיים של תרחיף resus בנקודת ההכלאה על מצע Ty streptomycin Gentamycin Xgl מראה שתי רמות של פלואורסצנציה.

המושבות הבהירות יותר הן המושבות הכחולות ובעלות ביטוי RFP גבוה יותר, ככל הנראה עקב קריאה רציפה (read through) מהפרומוטור LAC בווקטור. המושבות הפחות בהירות הן המושבות הלבנות, שעברו החלפת קסטה אמיתית ומכילות RFP עם הפרומוטור המיידי שלו בלבד, ללא קריאה רציפה מהפרומוטור LAC. מגמות אלו אמורות להיות גם רגישות ל-spectinomycin.

יעילות השילוב של ה-trans, המבוטאת כאחוז המהגרים של ה-trans מתוך סך המקבלים, צריכה להיות בטווח של 0.5%. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השימוש בקונז'וגציה בקטריאלית באמצעות הזנים ההנדסיים שלנו כדי להחדיר מבני DNA לכרומוזום הבקטריאלי.