השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

Cyanobacteria הם פילום חשוב של מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המוכרים יותר ויותר כפלטפורמות שימושיות עבור ביולוגיה סינתטית ויישומי ביוטכנולוגיה מתחדשת. לכן חשוב לפתח טכניקות חזקות כדי לפשט את התכנון, השיבוט וההכנסת דנ"א ההטרולוגי למינים ציאנובקטריאליים שונים. אז טכניקה זו מדגימה שיטה מבוססת הנקראת הזדווגות או הזדווגות טריפרנטל להחדרת DNA למינים ציאנובקטריאליים שאינם ניתנים לשינוי באופן טבעי.

ההתאגדויות בוצעו בהצלחה במגוון רחב של זנים ציאנובקטריאליים מתא יחיד למינים רב-תאיים. אם אתם מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, אנא הקפיטו לטפל הן בציאנובקטריאלי והן בזני ה- E.coli שלכם בזהירות. לדוגמה, אל תנהל צנטריפוגה מעל הערכים שניתנו בפרוטוקול ואל תבער.

ערבוב חיידקים וציאנובקטריה עשוי להיראות מוזר למשתמשים בפעם הראשונה. אנו מקווים כי על ידי הפגנת תהליך ההתייחדות, נעזור להבהיר זאת. לאחר בניית הרכבות ברמה אחת, בחר וקטור קבלה ברמה T מתאים.

בחר קישור סיום מתאים כדי לייגד את הקצה השלישי של ההרכבה ברמה הסופית 1 לעצם השדרה של רמה T. כדי להרכיב הרכבה אחת או יותר ברמה T, הכינו תערובת תגובה עם PBI1 וקטור קישור הקצה הנדרש. הגדר את תוכנית האופניים התרמיים והמשך בהתאם לכתב היד.

ביום הראשון, לגדול תרבות ציאנובקטריאלי על ידי הקמת תרבות טרייה של Synechocystis PCC 6803 או Synechococcus elongatus UTEX 2973. עם לולאה סטרילית חום, לגרד את התאים מן צלחת אגר BG-11 ציר ולהניח לתוך בקבוק חרוט 100 מיליליטר מלא 50 מיליליטר של טרי BG-11 בינוני לחסן. מניחים את הבקבוק לתוך אינקובטור רועד עם תאורה כדי לגדל את Synechocystis PCC 6803 תרבויות תא ב 30 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד.

עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973, לגדל את תרבות התא ב 40 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד. לאחר יום עד יומיים, צייר מיליליטר אחד מתרבות התאים ולמדוד על ספקטרופוטומטר. הספיגה ב OD 750 מגיע 0.5 כדי 1.5.

ביום השני, לחסן זן עוזר MC1061 E.coli המכיל וקטורים PRK24 ו PRL528 בחמישה מיליליטר של מדיום LB עם אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר וכלוראמפניקול בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד. ואז לחסן חמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם תרבות E.coli נושאת את וקטור מטען T ברמה.

לגדל את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד. ביום השלישי, צנטריפוגה המסייע ואת המטען E.coli תרבויות לילה ב 3, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.

לשטוף את כדורי על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה. תן מחדש את גלולה על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה צנטריפוגה כדי להסיר את supernatant. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה מתרבות הלילה.

לאחר הכביסה האחרונה, לחץ מחדש על גלולת התא במחצית הנפח של LB בינוני של נפח התרבות הראשונית. לאחר מכן לשלב 450 microliters של זן עוזר עם 450 microliters של זן המטען בצינור שני מיליליטר ולהשאיר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין את התרבות cyanobacterial על ידי צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות ציאנובקטריאלי ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

ואז להשליך את supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולת התא. לשטוף את גלולה ארבע פעמים על ידי הוספת טרי BG-11 בינוני של אותו נפח ראשוני. הוסיפו 900 מיקרוליטרים של התרבות הציאנובקטריאלית השטופה ל-900 מיקרוליטרים של זני ה-E.coli המשולבים בצינור של שני מיליליטר.

מערבבים את התרבויות על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עבור Synechocystis PCC 6803 או שעתיים עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973. צנטריפוגה את התערובת ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר 1.6 מיליליטר של supernatant ולתלות מחדש את גלולה על-טבעי הנותרים. מניחים מסנן קרום 0.45 מיקרון אחד על צלחת אגר LB BG-11 ללא אנטיביוטיקה. יש להפיץ בזהירות 200 מיקרוליטרים של תערובת התרבות E.coli/cyanobacterial על הממברנה עם מפזר סטרילי או קצה מעופף סטרילי.

לאטום את הצלחת עם סרט פרפין ולה מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור מואר במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, מעבירים בזהירות את הממברנה באמצעות מדפים מעוקרים להבה לצלחת אגר BG-11 טרייה המכילה אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה עבור וקטור המטען. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין דגירה באותם תנאים כמו קודם לכן עד מושבות להופיע.

מושבות מופיעות בדרך כלל לאחר 7-14 ימים עבור Synechocystis PCC 6803 ו 3-7 ימים עבור Synechococcus elongatus UTEX 2973. כדי לבחור באוב, באמצעות מוט חיטוי סטרילי חום, בחר לפחות שתי מושבות בודדות מן הממברנה פס על צלחת חדשה BG-11 אגר המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. ואז לחסן פס של תרבות ציאנובקטריאלי לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של LB בינוני דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 225 סל"ד באינקובטור רועד.

התרבות הברורה מאשרת את היעדר זיהום אי-קולי. לאחר תקופת צמיחה מספקת של שבעה ימים, בחר מושבות גרזן בודדות כדי להקים תרבויות נוזליות לאחסון קריו לטווח ארוך או לניסויים הבאים. במחקר זה, זרימת עבודה הרכבה שער הזהב הוכח.

בעקבות שינוי תגובת ההרכבה זוהו הרכבות מוצלחות באמצעות סינון כחול לבן סטנדרטי של מושבות אי-קולי. קלטת הביטוי eYFP בווקטור ברמה אחת וקישור הקצה וקטור אחד הורכבו לאחר מכן לווקטור קבלה ברמה T כדי לתת את וקטור cpcBA-eYFP. וקטור cpcBA-eYFP שנאסף אומת על ידי עיכול הגבלה.

העברה התייחדות מוצלחת של cpcBA-eYFP או וקטור pPMQAK1-T הביא לצמיחה של עד כמה מאות מושבות על הממברנה עבור Synechocystis PCC 6803 ו Synechococcus elongatus UTEX 2973. כצפוי עבור מקדם Pcpc560 חזק, הערכים עבור פלואורסצנטיות eYFP מנורמל מקורא הלוחות ו- eYFP פלואורסצנטיות לכל תא מן הציטומטר זרימה היו גבוהים בהשוואה לשליטה השלילית. עם קורא הלוחות וציטומטר הזרימה, ערכי הפלואורסצנטיות היו גבוהים יותר בסינקוקוקוס אילונגטוס UTEX 2973 מאשר ב- Synechocystis PCC 6803.

ודא שאתה דגירה לזמן המינימלי על פי איזה זן אתה מעלה.