מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג'ין Staphylococcus aureus

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק מתודולוגיה מפורטת לחקר ההעברה האופקית של DNA בסטפילוקוקוס זהוב על ידי התייחסות לשלושת מסלולי ההעברה העיקריים. צימוד, התמרה וטרנספורמציה טבעית. שיטה זו עוסקת בהעברה אופקית של גנים עמידים לאנטיביוטיקה בפתוגן האנושי staph aureus.

היתרון העיקרי של הטכניקות שהוצגו כאן הוא שאנו יכולים לבחון שלושה אופני העברה עיקריים, כולל טרנספורמציה גנטית טבעית שהתגלתה לאחרונה. כדי להתחיל את הניסוי, הכינו חמישה מיליליטר של תרבית לילה של התורם והחיידק המקבל במרק סויה טריפטי. או TSB בינוני עם ובלי 32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול, בהתאמה.

עם רעידות ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, התאם את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה לאחת עם מדיום TSB טרי. מערבבים 0.5 מיליליטר מתרבית התורם עם 0.5 מיליליטר מהתרבית המקבלת.

והוסיפו לתערובת מיליליטר אחד של מי מלח עם פוספט, או PBS. לאחר מכן בעזרת מערכת משאבת ואקום, העבירו את תערובת החיידקים לקרום פילטר של 0.45 מיקרומטר. הניחו את ממברנות המסנן על צלחת אגר דם כבשים.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד. הוצא את קרום המסנן מהצלחת ותלה אותו ב -10 מיליליטר PBS. מערבלים את התערובת למשך כדקה כדי לאסוף את כל החיידקים המחוברים על הממברנה.

בצע דילול סדרתי פי 10 של תרחיף החיידקים עם TSB טרי. צלחת 100 מיקרוליטר מהדגימות המדוללות 0, 10, 4 על אגר TSB. או צלחות TSA בתוספת 32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול ושמונה מיליגרם לליטר טטרציקלין לבחירת טרנסקונגנטים.

צלח 100 מיקרוליטר של המתלה המדולל על לוחות TSA עם שמונה מיליגרם לליטר טטרציקלין בלבד. כדי לספור את המספר הכולל של הנמענים. לאחר הדגירה, נתח מושבות עמידות כפולות לנוכחות הגן CFR על ידי PCR של המושבה ופרופילי הרגישות שלהן.

קבע את האנטיביוגרמה על ידי מדידת הריכוזים המעכבים המינימליים, MICs, של אנטיביוטיקה מתאימה על פי שיטת המיקרו-דילול הסטנדרטית או שיטת דיפוזיה של דיסק. פרופיל הרגישות של הטרנסקונג'וגנטים חייב להיות זהה לנמען. למעט כלורמפניקול ותרכובות אחרות המושפעות מהגן CFR.

לשלול עמידות לטטרציקלין שפותחה על ידי הזן התורם. הכינו תרבית לילה של N315-45 בחמישה מיליליטר מרק תזונתי בתוספת 3.6 מילימולר סידן. הכן תת-תרבויות על ידי דילול תרבית הלילה אחד עד 1,000 בנפח סופי של 10 מיליליטר בבקבוקוני זכוכית של 50 מיליליטר.

מגדלים את החיידקים במשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול, 180 סיבובים לדקה. לאחר מכן הכינו סדרה של פאג' מדולל MR83a במדיום סידן כלורי NB. הוסף 20 מיקרוליטר מהפאג המדולל לתרבית החיידקים.

הכן תרבית בקרה ללא זיהום פאג'ים כדי לשמש כבקרה חיובית לצמיחת תאי חיידקים. לאחר מכן גדלו את התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין ב -100 סיבובים לדקה למשך הלילה. למחרת בחר בקבוקון תרבית אחד או שניים עם הדילול הגבוה ביותר של הפאג' הנוסף.

העבירו את התרבויות לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר. הוסף 250 מיקרוליטר כלורופורם לצינורות וערבב היטב את התרבית על ידי היפוך. צנטריפוגה את התרבות ב 5, 000 פעמים G למשך 20 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

העבירו את הסופרנטנטים לצינורות טריים ואחסנו אותם בחום של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו מרק מזין אגר בינוני ושמרו אותו חם באמבט מים בחום של 55 מעלות צלזיוס. הוסף תמיסת סידן כלוריד 0.5 מולרית אוטוקלאבית למדיום לריכוז סופי של 3.6 מילימולר.

יוצקים אותו לצלחות פטרי של 90 מילימטר NB צלחות סידן כלוריד. הכינו תרבית לילה של N315 בחמישה מיליליטר של סידן כלורי NB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת מוסיפים 10 מיקרוליטר מתרבית הלילה ל-200 מיקרוליטר של סידן כלורי NB ומורחים אותו באופן שווה על צלחת הסידן הכלורי NB.

הפסק להתפשט כאשר פני הצלחת מכוסים בנוזל. לאחר מכן הניחו לצלחת להתייבש במשך חמש דקות. בצע דילול סדרתי של 1 עד 10 של הפאג שהוכן בעבר באמצעות מדיום סידן כלורי NB.

הבחין בשלושה מיקרוליטרים מכל דילול פאג'ים על הצלחת המכוסה בחיידקים. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, ספרו את מספרי הפלאק וחשבו את טיטר הפאג'ים באמצעות המשוואה הבאה.

הכן את תרבית הלילה של N315, COL או MU50, בחמישה מיליליטר של סידן כלורי NB ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-180 סיבובים לדקה. לאחר תרבית לילה, יש לדלל את הפאג' בסידן כלורי NB ל-109 PFU למיליליטר. בבקבוקון זכוכית של 50 מיליליטר, מערבבים 500 מיקרוליטר של תרבית לילה, 500 מיקרוליטר של סידן כלורי NB טרי ומיליליטר אחד של פאג' 109 PFU למיליליטר.

דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין ב -100 סיבובים לדקה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים לתרבויות 50 מיקרוליטר של 20% טריסודיום ציטראט. המשיכו בניעור עדין במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

הכינו את עירוי לב המוח המומס או מדיום אגר BHI ושמרו אותו באמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס, וטפלו במדיום האגר ב -32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול. לאחר מכן העבירו את תערובת הפאג'ים של החיידק לבקבוק של 100 מיליליטר. מוסיפים 50 מיליליטר אגר BHI חם בתוספת 32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול, ומערבבים היטב.

יוצקים את התערובת לצלחות הפטרי של 90 מילימטר. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס. בדוק עוד את המושבות שנוצרו, המתמרים, לעמידות, על ידי העברת המושבות לצלחות אגר BHI חדשות בתוספת 32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול.

אשר את נוכחות הגן CFR על ידי PCR מושבה. תרבית התא הנמען למשך הלילה, בחמישה מיליליטר TSB ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת בבוקר, העבירו 0.5 מיליליטר מתרבית הלילה לצינור של 1.5 מיליליטר.

לזרז את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן השעו את התאים עם 10 מיליליטר מדיום CS2 בצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן מגדלים את החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-180 סיבובים לדקה במשך שמונה שעות עד לשלב האקספוננציאלי המאוחר.

קצור את התאים על ידי צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום CS2 טרי. הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר או DNA גנומי לתרחיף התאים.

לנער את התרבות ב -180 סיבובים לדקה. ואז אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום BHI.

מערבבים את תרחיף התאים עם 90 מיליליטר תוסף אגר BHI מומס עם 32 מיליגרם לליטר כלורמפניקול, וחמישה מיקרוגרם לליטר טטרציקלין בניסוי הבקרה. יוצקים את התערובת לתוך צלחות הפטרי של 90 מילימטר ומצננים במהירות ומניחים לאגר להתמצק. שכפל מושבות באמצעות קיסמים לצלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה כדי לאשר את מאפייני העמידות שלהן.

פרוטוקול ההטיה שימושי להעברה בין מינים שבהם נעשה שימוש בסטפילוקוקוס אפידרמידיס כתורם CFR. וזן הסטפילוקוקוס אוראוס N315 שימש כמקבל. הפרוטוקול המשמש להעברה בין מינים מניב תוצאות דומות תוך שימוש באותו וקטור מצומד בתורמים מצומדים שונים.

זהו המאמר הראשון בו מתוארים פרטי טרנספורמציה טבעית. המתודולוגיה שסופקה תועיל לחוקר לחקור את ההעברה וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה, כמו גם את הגורם העיקרי לפתוגן האנושי staph aureus.