הדמיה ברזולוציה משנה ננומטר עם מיקרוסקופית כוח אטומי משרעת אפנון בנוזל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג הדמיה ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית בנוזל, באמצעות AFM מסחרי המופעל במצב של אפנון אמפליטודה (amplitude-modulation), הידוע גם כ-"tapping mode". שיטה זו מסייעת לדחף את גבולות התפעול הסטנדרטיים של AFM בנוזל, על ידי שימוש בשילוב המיטבי של פרמטרים לרזולוציה גבוהה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה ברוב מכשירי ה-AFM המסחריים, ולכן היא אינה דורשת ציוד מיוחד.

השיטה המוצגת כאן מיועדת למדענים וטכנאים בעלי ידע בסיסי ב-AFM, המעוניינים להפיק יותר מהטכניקה. שיטה זו אינה מיועדת לסוג דגימה מסוים, וניתן ליישמה באופן רחב על דגימות מתחומי הפיזיקה, הביולוגיה, הכימיה, מדעי החומרים ומדעי השירות. ככלל, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה יתקשו בתחילה, שכן היא דורשת סבלנות כדי למצוא את הפרמטרים האופטימליים עבור דגימה נתונה.

בצע סוניקציה במכשיר רטט (Bath sonicator) למכשרים ולדיסק התומך בתשתית בתוך מים אולטרה-טהורים. לאחר מכן, חזור על הפעולה עם איזופרופנול, ושוב עם מים אולטרה-טהורים, למשך 10 דקות בכל שלב. כאשר שואפים לרזולוציה גבוהה, לכל זיהום עלולות להיות השפעות הרסניות.

יש להרכיב כפפות בכל עת, ולוודא שכל המשטחים או המכשירים הבאים במגע עם הדגימה, הקנטילבר (cantilever) או תא ה-AFM מנוקים ביסודיות. לאחר סוניקציה, יש לייבש כל אחד מהמכשירים ואת דיסק הדגימה תחת זרימת חנקן. השתמשו בדיסק פלדה כתמיכה עבור מיקה, כדי לדמות יוני מתכת בודדים שנספגו.

נקו פיזית את המשטחים שלא ניתן לנקות באמצעות סוניקציה על ידי ניגוב עם נייר סופג בעל סיבים מועטים (low lint) בעל שכבה אחת, שנספג לפי הסדר במים אולטרה-טהורים, איזופרופנול ומים אולטרה-טהורים. הניחו למשטח להתייבש באוויר למשך עד 30 דקות. לאחר מכן, הכינו כמות קטנה של דבק אפוקסי על ידי ערבוב יסודי של הריאגנטים, והניחו כ-10 microliters של האפוקסי על דיסק דגימת הפלדה הנקי.

הניחו את תשת המיקה על האפוקסי, והדביקו אותה לדיסק הפלדה על ידי הפעלת לחץ על התשת. הניחו לאפוקסי להתקשות למשך מספר שעות בטמפרטורה מוגברת בהתאם להנחיות היצרן. לאחר מכן, הצמידו בלחץ פס של סרט דביק ברוחב 2.5 סנטימטר אל התשת, כך שכל הפנים יכוסה, וקלפו את השכבה העליונה בצורה חלקה.

חזור על תהליך זה פעמיים עד שלוש פעמים, עד שהמיקה תיראה חלקה כראי לעין. טבול את שבב הקנטילבר באמבט של isopropanol ולאחר מכן במים אולטרה-טהורים, למשך 60 דקות בכל פעם. לאחר מכן, חשוף את הקצה לאור UV למשך עד חמש דקות כדי לעודד היווצרות של אתרי הידרטציה יציבים.

זמני חשיפה ממושכים מדי עלולים לפגוע בטיפ, או להגדיל את רדיוס העקמומיות שלו. הכנס את הקנטילבר למחזיק הקנטילברים של ה-AFM, וטפטף 25 µL של נוזל הדימוג על הקנטילבר והטיפ כדי להרטיב את הפני השטח מראש. פעולה זו תפחית את הופעתם של בועות אוויר בעת ההתקרבות לדגימה.

המיסו את דיסק הדגימה והמצע על גבי במת הדגימה והוסיפו טיפה של נוזל הדימות לדגימה. לאחר מכן, חברו את מחזיק הקנטילבר ל-AFM. קרבו את הקנטילבר ואת הדגימה זה לזה כך שייווצר גשר קפילרי בין הנוזלים שעל קצה הקנטילבר לאלו שעל הדגימה.

השתמש בתוכנת ה-AFM כדי ליישר את לייזר המדידה קרוב לקצה הטיפ של הקרסול (cantilever). לאחר מכן, מצא את תדר התהודה של הקרסול מהפסגה הראשית בספקטרום התרמי שלו. אם סטיית הקרסול מכוילת, התאמה של פסגת התהודה למודל של תנודה הרמונית פשוטה תניב את קבוע הקפיץ של הקרסול.

לאחר מכן, כוון את הקנטילבר על ידי מציאת תגובת האמפליטודה שלו כאשר הוא מונע חיצונית על פני טווח תדרים הקרוב לתדר התהודה שזוהה בספקטרום התרמי. התאם את אמפליטודת ההנעה כך שאמפליטודת התנודה החופשית תהיה בערך חמישה ננומטרים. ברוב מכשירי ה-AFM, הדבר תואם בדרך כלל ל-0.2-0.8 volts.

לאחר מכן, כוון את נקודת השליטה של האמפליטודה לכ-80% מהאמפליטודה החופשית. לאחר מכן, הגדר את הגברי התגמול (feedback gains) כגבוהים יחסית. לאחר שווידאת שלא מתרחשות חוסר יציבות או תנודות (ringing), הגדר את קצב הסריקה הראשוני לכ-1 hertz, ואת גודל הסריקה ל-10 nanometers.

התחילו את קירוב הראש אל הפני השטח באמצעות תוכנת הבקרה של ה-AFM. העריכו האם הראש הגיע לפני השטח מבלי להתחיל את ההדמיה, על ידי שינוי קל של ערך נקודת הset point. אם הראש נמצא על פני השטח, ההשפעה על התרחבות אזור ה-ZPA תהיה זניחה.

ברגע שהחוד הגיע לפני השטח, הסיגו את אזור ה-ZPA וכווני מחדש את הקנטילבר. תדר התהודה ככל הנראה יעבור לערך נמוך יותר עקב אינטראקציות בין החוד לדגימה. כעת, שנו את נקודת הset point לכ-80% מהאמפליטודה החופשית שכוונת מחדש, והפעילו את הקנטילבר לביצוע סריקה של שטח של 10 על 10 ננומטר רבוע של פני השטח במצב אפנון אמפליטודה (amplitude modulation mode) כדי לוודא שפרמטרי הדמיון מתאימים.

בדקו שפרופילי הסריקה והסריקה ההפוכה חופפים. אם לא, הפחיתו עוד יותר את נקודת הset point, ונסו להעלות את ההגברים (gains). אם התמונה הופכת לרועשת, הפחיתו את ההגברים.

חזור על הפעולה על אזור גדול של 1 עד 5 מיקרומטר רבוע של הדגימה, ככל שהדבר אפשרי. בדגימות רכות או ביולוגיות, הדבר עלול להוביל לזיהום של הראש. הקטן את גודל הסריקה לערך המתאים להדמיית המאפיינים הרלוונטיים.

גודל זה יכול להיות נמוך עד כדי 20 על 20 ננומטרים. לאחר מכן, הפחית את אמפליטוד ההנעה של הקנטיליוור באופן מספיק כדי שלולאת המשוב תסוג אוטומטית מאזור ה-ZPA ותסיר את החוד מהמשטח. בעוד הקנטיליואוור רחוק מהמשטח, כוון את אמפליטוד ההנעה כך שאמפליטוד הקנטיליוור תהיה בין ננומטר אחד לשניים שיאה לשיא (peak to peak).

הפחיתו בהדרגה את נקודת העיגון (set point) בצעדים קטנים, עד ששכבת ה-ZPA תתרחב שוב לכיוון פני השטח והתמונה המקורית תשוחזר. שמרו על אמפליטודת נקודת העיגון בין 75% ל-95% מהאמפליטודה החופשית החדשה. לאחר מכן, כווןו מחדש את ההגברים (gains), שכן ניתן להשתמש בהגברים גבוהים יותר באמפליטודות נמוכות יותר מבלי להחדיר רעש משמעותי.

בצעו אופטימיזציה למערכת כדי למצוא את השילוב הטוב ביותר של אמפליטודה חופשית, נקודת ייחוס (set point) והגבר (gain) עבור רזולוציה גבוהה. תנאי המערכת האופטימליים תלויים בדגימה, בתכונות ההרטבה של הנוזל ובקנטילבר שבו נעשה שימוש. עבור ממשקים סולבופיליים, השתמשו בקנטילברים בעלי קבוע קפיץ של 0.5 עד שני newtons per meter.

באמצעות טכניקה זו, התקבלו תמונות ברזולוציה של תת-ננומטר על פני מגוון רחב של דגימות. הדגימות הרכות המוצגות כאן כוללות שכבה ליפידית דו-שכבתית, ממברנות סגולות מ-halobacterium salinarum, מונו-שכבה המורכבת מ própria-ארגון של די-מולקולות אמפיפיליות, וגבישי אקוואפורין מממברנה של עדשת בקר. בכל מקרה, המאפיינים הרלוונטיים מודגשים.

אמפליטודות התנודה הקטנות ונקודות הייחוס הגבוהות ממזערות את הכוח המופעל על ידי הראש על הדגימה, ובכך מאפשרות הדמיה של התארגנויות עצמיות שבירות של ליפידים בשכבה כפולה, חלבונים בממברנות ביולוגיות טבעיות ומולקולות אמפיפילים בתמיסה ללא גרימת נזק. ניתן להדמין באמצעות גישה זו גם חומרים גבישיים קשיחים יותר, כגון calcite, strontium titanite, silicon carbide ויונים מתכתיים בודדים שנספחו למשטח mica, מכיוון שבכל מקרה, הנוזל הבין-ממשקי הוא זה שמודמגן למעשה, ולא הגביש עצמו. לאחר רכישת מיומנות, טכניקה זו מספקת רזולוציה ברמה מולקולרית או אטומית בנוזל כמעט בכל פעם שהיא מבוצעת בצורה נכונה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הנוזל הבין-פסי (interfacial liquid) הוא זה שמצולם. המשמעות היא שיש להשתמש בתנאי דימוי עדינים. זיהום של הראש, הדגימה או הנוזל הוא בדרך כלל הגורם העיקרי לאי-השגת רזולוציה גבוהה.

במקרה של ספק, לעיתים קרובות מומלץ לנקות את כל המשטחים הבאים במגע עם הנוזל ולהשתמש שוב בתמיסות הדימוי. רעש חיצוני פוגע אף הוא ברזולוציה גבוהה. רצפה בעלת רעידות נמוכות, הרחוקה מפתח אוורור, היא עדיפה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למקם את פרמטרי הדמיון שלכם כדי להשיג רזולוציה גבוהה ב-AFM. כמובן, כפי שקורה בכל טכנולוגיה חדישה, עשויים להידרש מספר ניסיונות כדי להבין מהי הדרך הטובה ביותר להדמיית דגימה, ולכן סבלנות היא המפתח.