מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבוני קולטני אור באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי קבלת דגימה של קולטן האור ודילול שלה. השלב השני הוא למרוח את דגימת החלבון על משטח נציץ טרי ונקי למשך כ-30 שניות.

לאחר מכן שוטפים את ה-MICA עם בופר כדי להסיר מולקולות לא קשורות ומחוברות באופן רופף. לאחר מכן, הדגימה מחוברת לתא נוזלי המצויד בבדיקה מתאימה. מכלול זה נטען על הסורק.

לאחר מילוי תא הנוזל בתמיסת חיץ, חבר את הקצה עם הדגימה והתחל לסרוק. בסופו של דבר, מיקרוסקופ כוח אטומי המשלב כוח שיא. מיפוי תכונות ננו-מכניות כמותי משמש לאיסוף תמונות של חלבון קולטן אור יחיד על פני הדגימה.

מיקרוסקופ כוח אטומי המשלב כוח שיא q ו-m יכול לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון מהם המאפיינים המבניים והכימיים החשובים הקובעים את תפקודן של מקרומולקולות פעילות ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הנוכחיות כגון NMR וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן הוא שניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבונים שלמים ומקרומולקולות ביולוגיות אחרות בסביבה רלוונטית מבחינה ביולוגית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו נאבקים מכיוון שכוונון הגשושית והפתרון דורש מספר שלבים, חלקם מורכבים למדי.

עם שיא כוח q ו-m ותוכנה אוטומטית, כמה מהשלבים הללו הופכים לפשוטים יותר, ובכך הופכים את התהליך להרבה יותר קל עבור משתמשים חדשים וסטודנטים לתואר ראשון. ידגימו את ההליך הזה שלושה סטודנטים לתואר ראשון ממעבדת המחקר שלי, מארי קרוגר, בלייר סורנסון וג'סיקה תומאס. סטודנטים אלה ימשיכו ללימודי תואר שני בתחומי המיקרוביולוגיה, ההנדסה הכימית והכימיה בשנה הקרובה.

יש להפעיל פריטים אלה בסדר מסוים. ראשית, המחשב, אחר כך הבקר, ולבסוף, אור הסיב האופטי. המיקרוסקופ צריך לקרוא FM ו-LF fm.

המצלמה חייבת להיות מרוכזת מעל הראש האופטי FM בתוכנה. יש לבחור את הדברים הבאים. קטגוריית הניסוי היא תכונות מכניות.

קבוצת הניסוי היא מיפוי ננו-מכני כמותי, והניסוי הוא כוח שיא q ו-m בנוזל. כאשר ההגדרות נבחרו כהלכה, ניתן לטעון ולהגדיר את הניסוי. יש להגדיר את מיקוד המצלמה באמצעות מטרת Z תחילה, ולאחר מכן להשתמש בפקדי המסלול כדי למקם את הבמה, המטרה היא למקם את צמצם ראש A FM מילימטר אחד לפני משטח הבמה כדי לתפעל את דיסקי הדגימה עם נציץ טרי שסוע יש פינצטה עגולה של אחיזת דיסק

התחל בהרכבת תא הנוזל מחלקים נקיים בתוליים. ראשית, חבר את מתאם הצינור ליציאה בתאי הנוזל הנקיים. לאחר מכן השתמש בפינצטה שטוחה בעדינות רבה, לחץ את טבעת ה- O לתוך הכניסה שלה על תא הנוזל.

לאחר מכן על תפס מחזיק הבדיקה, לחץ קלות על הקפיץ והרחיק אותו מהחריץ. בעזרת אותם פינצטה, אחזו בבדיקה והחליקו אותה לתוך החריץ, כך שהקצה פונה למרכז התא. לאחר מכן אבטח את הגשושית באמצעות הקליפ.

השלב הבא הוא לבדוק את המהדק על FM.It A חייב להיות מושך במלואו. הנח את המכלול כלפי מטה על גבי הדגימה. התקן את המכלול על החתיכים של ה-A FM לייצוב.

הורד את המהדק. כדי לבדוק את טבעת האור, לחץ על המתג למטה במיקרוסקופ עד לראיית האורינג. יש לדחוס אותו היטב בין דיסק התמיכה לתא הנוזל.

ניתן למקד את תא הנוזל באמצעות כפתור הכוונון הגס. לאחר מכן, באמצעות התאמת XY, התמקד בקצה הבדיקה. זה נראה כמו משולש זהב מתכתי.

כעת באמצעות ידית הפיזו למטה, הזז את הקצה קרוב למשטח הדגימה, כוונן את המיקוד על הקצוות, ההשתקפות ופקח על מיקום השלוחה ביחס להשתקפות זו. נכון לעכשיו, הם צריכים להיות מיושרים היטב אך לא חופפים לחלוטין. כעת, הכינו את המזרק.

מלאו אותו במיליליטר אחד של תמיסת חיץ והצמידו את המתאם. לאחר מכן חבר את המזרק לצינור הפליטה והאריך את הבוכנה במלואה. לאחר מכן, חבר את הצינור לתא הנוזל באמצעות מתאם למילוי החדר, לחץ בעדינות על הבוכנה עד שמרכז החדר מלא.

לא אמורות להיות בועות אוויר או נשפכות מתא הנוזל אל המיקרוסקופ. לאחר מכן הנח את המזרק במצב נתמך היטב מעל החדר. לאחר מכן, השתמש בהזנת המצלמה ובכפתורי התרגום XY.

כדי לאתר את הלייזר על המסך, הוא אמור להופיע כנקודה אדומה מפוזרת. לאחר האיתור, השתמש בפקדי הלייזר כדי להעביר אותו לבדיקה. כעת, לבסוף, כוונן את בקרות הלייזר והמראה עד שאות הסכום במיקרוסקופ יגדל למקסימום בין ארבע לשש, התאם את דיודת הרבע.

לאחר מכן, השתמש בכפתורים בראש הסריקה כדי לכוונן את הסטיות האנכיות והאופקיות עד שהערכים במיקרוסקופ יחזרו קרוב ככל האפשר לאפס. הקפד לבחור אפשרויות רכישה מתאימות לפני שתמשיך. הגדר את קצב הסריקה לכ-1 הרץ בחלון הדגימות לשורה.

הזן 256. עבור השליטה האוטומטית בסיוע הסריקה. בחר אדם עבור סיוע הסריקה אוטומטי מגבלת Z בחר כבוי.

מגבלת ה-Z צריכה להיות 500 ננומטר, וגודל הסריקה צריך להיות מיקרון אחד. כאשר ההגדרות מוגדרות כהלכה, מדוד את הבדיקה. שימו לב לשינוי המתח Z pazo כאשר קצה הגשושית מתקרב לפני השטח.

אם הקצה יוצא מחוץ לטווח, נסוג והתקרב מחדש, ייתכן שיהיה צורך להחליף את קצה הבדיקה. אם זה לא עובד, כאשר הקצה מופעל, קווים אמורים להופיע בכל אחד מחלונות הרכישה, וקווים אלה יבנו תמונה. התחל לצלם באופן רציף תמונות של הנציץ.

התקרב לאט כדי להבטיח שמשטח ה-MICA שטוח ונקי כאחד. הכן צלחת פטרי בעלת ארבעה חדרים עם תמיסת חיץ הדמיה בקירור. כל תא זקוק לחמישה מיליליטר לפחות.

לפני שלוקחים מנה של חלבון מדולל, מערבבים אותו בעדינות עם המיקרו פיפטה. לאחר מכן קחו 200 מיקרוליטר ומרחו את החלבון המדולל על פני השטח של MICA. המתן כ -30 שניות עד שהתמיסה תשכון על פני השטח.

לאחר מכן בעזרת תופסי הדיסק, הרם את הדיסק מבלי להטות אותו וטבל אותו מיד במאגר הראשון של תמיסת החיץ. למשך שנייה אחת, ודא שהדיסק נשאר מקביל לספסל. חשוב מאוד לשמור על הדגימה במקביל לצלחת הפטרי בשלב השטיפה.

מולקולות רכות וגמישות אלה יכולות להיות מעוותות על פני השטח על ידי זרמים חזקים של תמיסה מימית. לאחר מכן, טבלו לזמן קצר את הדיסק בכל אחת משלוש הבריכות האחרות למשך שנייה אחת לכל בריכה. לאחר מכן העבירו את הדיסק למטלית יבשה ונטולת אבק.

תן ללחות העודפת לעבור לבד, אך אל תתנו לדיסק להתייבש לחלוטין. אל תאפשר למטלית לגעת בדוגמה הסר בזהירות את הדגימה מהמטלית עם תופסי הדיסק והנח את הדגימה על סורק A FM. הנח את תא הנוזל על גבי הדגימה והמשך בהתקנה ובהדמיה.

לאחר כל הפרמטרים של הגשושית, גודל הקפיץ ורדיוס הקצה מוגדרים כהלכה. מדוד את הגשושית כמו בעת הדמיה. מיכה, התבונן ב-ZP azo כשהקצה מתקרב לפני השטח.

בעת צילום תמונות, אפשר לסורק לצלם את אותו אזור במשך שני מעברים רצופים לפחות. השתמש בצילום רציף כדי לשמור כל תמונה. התאם את גודל התמונה ומיקומה כרצונך.

לאחר שהתוכנה האוטומטית סיימה להתאים את פרמטרי הסריקה לגודל תמונה מסוים. כבה את התוכנה לסדר. כוונן את המיקוד של התמונה, התאם ידנית את קצב הסריקה, מגבלת Z, מספר הקווים ונקודת ההגדרה.

אם התמונה הופכת לא ממוקדת מדי, הפעל שוב את התוכנה כדי לחזור למצב ההתחלה המקורי. תוך כדי התקרבות לחלבון, הפחת את קצב הסריקה והגדל את מספר הקווים באופן פרופורציונלי על מנת להגדיל את הרזולוציה של התמונה. מאוחר יותר. בעת ניתוח התמונות, ראשית, שטח את התמונה על ידי לחיצה על סמל השיטוח.

בחר את סדר האפס ובצע את הפעולה. לפעמים יש צורך להשתמש בהתאמה רגילה כדי להשיג תמונות שטוחות כראוי. בחרו בסמל ההתאמה הרגילה והשתמשו בסמן כדי לצייר מישור מעל אזור שטוח בתמונה.

בצע את ההתאמה הרגילה וחזור על הפעולה לפי הצורך. לאחר מכן, בחר את לשונית חתך הרוחב כדי למדוד את מידות החלבון. צייר קו עם הסמן מעל המולקולה או האזור שיש לנתח.

חזור על תהליך זה בתחומים מרובים. אם רוצים שכבת-על, ניתן לחקור כל מספר של מולקולות ביולוגיות באמצעות FM עבור חלבון קולטן אור במצבו המותאם לאור, מצע נציץ טרי הוא משטח שטוח מתאים לספיגת חלבון. ניתן היה להבחין בדימרים בודדים של חלבון קולטני אור באמצעות מצב QNM בכוח שיא.

החצים מצביעים על דימרים בודדים והכוכבית מציינת צבירת חלבון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. ניתן למדוד חתכים של החלבונים לאחר שיטוח התמונה. נתוני XY תואמים למדידות הגובה.

אלה יכולים לשמש למגוון חישובים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להגדיר ניסוי A FM לאיסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של חלבונים על משטח בסביבה רלוונטית מבחינה ביולוגית. שימוש בכוח שיא q ו-m לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש עד ארבע שעות.

לכן, שיא כוח q ו-m הוא צורה מתאימה של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להציג לסטודנטים לתואר ראשון הרשומים לקורסי מעבדה כגון ניתוח אינסטרומנטלי, ביוכימיה ופיזיקה מודרנית. לאחר פיתוחה, שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום מיקרוסקופ הבדיקה הסורקת לחקור מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים, חומצות גרעין ואפילו תאים חיים במדיה רלוונטית מבחינה ביולוגית.