מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

ספקטרוסקופיית מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) מספקת פלטפורמה רבת עוצמה למחקרים חיידקיים, המאפשרת להשיג רזולוציה ננומטרית. שניהם, מיפוי של שינויים תת-תאיים (למשל, על חלוקת תאים) כמו גם מחקרים השוואתיים של הרכב כימי (למשל, הנובעים עמידות לתרופות) יכולים להתבצע ברמת תא אחד בחיידקים.

השיטה מאפשרת מחקר ננומטרי של חיידקים. הוא מספק לנו תובנה מפורטת לגבי השינויים הכימיים בעמידות לאנטיביוטיקה. לכן, זה יכול לתרום להבנתנו את ה-AMR ופיתוח תרופות.

גודל ננומטרי של חיידקים מגביל משמעותית את כלי המחקר הזמינים המסוגלים לחקור את הכימיה שלהם. AFM-IR מאפשר לנו לעשות זאת בצורה לא הרסנית, בלתי תלויה בצופה, אפילו ברמה התת-תאית. על ידי מתן תובנה לגבי העמידות האנטי-מיקרוביאלית, השיטה יכולה לעזור לזהות ולבדוק מטרות מולקולריות עבור אנטי-מיקרוביאלים חדשים.

בנוסף לחיידקים, AFM-IR יכול לחקור מגוון תאים, רקמות ואפילו וירוסים. להכנת דגימה להדמיית AFM-IR, לאחר גידול החיידקים המעניינים על המדיום המתאים בתנאי התרבית המתאימים, השתמש בלולאה סטרילית כדי לקטוף בזהירות חיידקים מהחלק העליון של המושבות להעברה לצינור זכוכית. הוסף מיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד לצינור ולמערבולת למשך דקה עד שתיים עד שגלולת החיידקים שנאספה כבר לא נראית בתחתית הצינור.

העריכו את העכירות הגסה של הפתרון על ידי השוואה חזותית בין הפתרון המוכן לתקני McFarland. אם נראה כי העכירות של תרחיף החיידקים נמוכה מאוד, המשך להוסיף עוד חיידקים ומערבולת עד שהעכירות הגסה של התמיסה תהיה דומה לתקני מקפרלנד 0.5 ו-1. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה, ושאבו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.

השעו מחדש את כדור תאי החיידקים במיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד עם מערבולת, ושקעו את החיידקים עם צנטריפוגה נוספת. לאחר שטיפת החיידקים עד שלוש פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה, שאפו את הסופרנטנט ומערבלו את הגלולה למשך שתי דקות לפחות לפני הוספת חמישה מיקרוליטרים של תאים למצע הניסוי. אם העובי הרצוי הוא חד-שכבתי או חיידקים בודדים, מיד לאחר ההפקדה, הוסיפו למצע בין 20 ל -100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד וערבבו בעדינות את התמיסה עם קצה פיפטה.

כאשר הדגימה התייבשה באוויר, השתמש בסרט דבק דו צדדי כדי להרכיב את המצע על דיסק דגימת מתכת AFM. כדי להכין את מכשיר הספקטרוסקופיה AFM-IR לניתוח, לחץ על אתחול לאחר הפעלת התוכנה והלייזר ואשר שתריס הלייזר נמצא במצב פתוח. במהלך תהליך זה, יופיע חלון אתחול הבמה.

בסיום תהליך האתחול, לחץ על אתחול ואישור. במידת האפשר, הפעל את זרימת החנקן כדי לטהר את המכשיר בחנקן והתאם את טיהור החנקן כדי להשיג רמת לחות יציבה. בזהירות, הנח את הדגימה בתא הדגימה מבלי לפגוע בקצה ולחץ על טען בתוכנה. עקוב אחר האשף כדי לטעון את הדגימה, תוך התמקדות בקצה ובדוגמה בכל שלב.

לאחר מכן לחץ על גישה כדי לגשת לדגימה מבלי לעורר מעורבות. לפני הפעלת המדגם, בחר כלים, כיול רקע IR וחדש. בחלון המוקפץ, הגדר את הרזולוציה והטווח הספקטרלי בהתאם למטרת הניתוח והגדר את הממוצעים והרקעים לערכים ממוצעים.

בחר הפוך לזמין. בחלון המוקפץ, הגדר את פרמטרי ההתחלה והסיום ולחץ קבל ורכוש. לאחר קבלת נתוני הרקע, לחץ על שמור.

כדי להפעיל את העצה לדגימה, לחץ על מעורבות. המערכת תתקרב למשטח הדגימה עד לגילוי מגע ישיר. לחץ על סריקה כדי לאסוף תמונת AFM ראשונית גדולה יותר ברזולוציה מרחבית נמוכה כדי להמחיש את פני השטח לפני הזזת הקצה לנקודת מדידה מעניינת.

כדי ליישר את לייזר האינפרא אדום למספר גל שבו הדגימה תספוג, הזן את מספר הגל שבו הדגימה תספוג בשדה מספר גל, ולחץ על התחל IR.At יש לראות לפחות שיא ברור אחד בגרף משרעת לעומת תדר. גרף הסטייה לעומת הזמן אמור להראות צורת גל מחזורית. לחץ על מטב כדי לבחור ספקטרום חיידקי אינפרא אדום קונבנציונאלי כדי לזהות את מיקומי הרצועות, והשתמש בספקטרום כדי למטב את הנקודות החמות בערכי מספרי גלים שונים מאזורים ספקטרליים שונים.

כאשר כתמי האינפרא אדום עבור ערכי מספר גלים נבחרים עברו אופטימיזציה, הגדר את הרזולוציה הספקטרלית ואת הטווח ומספר הממוצעים ולחץ על רכוש כדי לאסוף את ספקטרום AFM-IR. כדי לאסוף תמונת התפלגות עוצמה עבור ערך מספר גל שנבחר, לאחר הקלטת ספקטרום AFM-IR יחיד, הקלט תמונת AFM של אזור הדגימה שנבחר ובחר את ערכי מספר הגל עבור הדמיית AFM-IR. ודא שנקודת ה-IR של הלייזר עברה אופטימיזציה לערכי מספר הגל שנבחרו, והגדר את מספר נקודות הנתונים בכיווני X ו-Y של אזור התמונה.

בחלון כללי, הגדר את עוצמת הלייזר. בחלון AFM Scan, הגדר את קצב הסריקה. לאחר מכן סמן את התיבה IR Imaging Enable ולחץ על סרוק כדי להתחיל בהדמיה.

ה-AFM-IR של עוצמת האות במספר הגל שנבחר ייאסף במקביל לנתוני ה-AFM מאותו אזור. פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מגוון סוגים של הפצת תאי חיידקים על מצע, מתאים בודדים ועד חד-שכבתיים ורב-שכבתיים. הפרוטוקול יכול לשמש לניטור שינויים דינמיים בחיידקים חיים.

לדוגמא, בהיווצרות מחיצה במהלך חלוקת תאי S.aureus. ספקטרום ה-AFM-IR של המחיצה התאפיין בעוצמה יחסית גבוהה יותר של רצועות ב-1, 240 ו-1,090 סנטימטרים בהשוואה לספקטרום AFM-IR שנאסף מאזור התא, מה שמצביע על כך שהמחיצה מורכבת מקבוצות פחמימות ופוספודיאסטר של רכיבי דופן התא. הפרוטוקול יכול לשמש גם לחקר הבדלים בהרכב הכימי הנובעים מהתפתחות עמידות.

כפי שנצפה בניתוח מייצג זה, לא נמדדו הבדלים מורפולוגיים בין עמידות לסירוגין של ונקומיצין לבין תאי S.aureus רגישים לוונקומיצין. עם זאת, הערכת ספקטרום AFM-IR ונגזרותיהם השניות חשפה עלייה ברורה בעוצמה היחסית של הרצועות הקשורות לקבוצות הפחמימות והפוספודיאסטר ממרכיבי דופן התא בזן העמיד בהשוואה למקביל הרגיש. חשוב להכין דגימה נקייה, לכן הקפידו להפחית את התרומה הבינונית מההתחלה ולהסיר אותה לחלוטין מכביסות מרובות.

מכיוון ש-AFM-IR היא טכניקה לא הרסנית, ניתן לחקור את הדגימה מאוחר יותר בטכניקות אחרות, כגון צביעה או ספקטרוסקופיה של יונים קונפוקליים, שיכולות לספק מידע משלים על הכימיה שלהם.