לימוד תהליכים דינמיים של אובייקטים בגודל ננו בנוזל באמצעות מיקרוסקופי אלקטרוני סריקת הילוכים
5 בפברואר 2017
פרוטוקול זה מתאר את הפעולה של בעל דגימת זרימת נוזל עבור מיקרוסקופיית אלקטרוני הילוכים של AuNPs במים, כפי שמוצג על התצפית של תהליכים דינמיים ננומטריים.
המטרה הכוללת של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקת פאזה נוזלית היא לצפות במבנים ותופעות של ננו-חומרים בדגימות ביולוגיות המוטמעות במלואן בשכבה נוזלית בעובי של עד מספר מיקרומטרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי החומרים כגון התנהגות של ננו-חומרים בנוזל וחקר דגימות ביולוגיות בסביבה הנוזלית הטבעית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מורפולוגי בקנה מידה ננומטרי על דגימות בנוזל.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שטעינת מחזיק הדגימה ורכישת התמונה אינם פשוטים כפי שנעשה לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להתחיל בהליך, במנדף זרימה למינרי נקי, יש לנקות שקופית זכוכית מיקרוסקופית קלה עם רקמה נטולת סיבים ואתנול טהור. הניחו את השקופית על טישו בחדר נקי בצלחת פטרי עם מכסה.
כדי לתפעל את שבבי ה-SiN, באמצעות פינצטה מצופה פחמן, תפסו את השבב בחוזקה אך בזהירות בצדדים הארוכים, תוך שמירה על קרום ה-SiN פונה כלפי מעלה בכל עת. באמצעות טכניקה זו, הניחו חמישה שבבים ללא מרווח וחמישה שבבים עם מרווח של 200 ננומטר על מגלשת הזכוכית. סוגרים את צלחת הפטרי ומביאים את השבבים למכסה אדים.
מניחים את השבבים בכוס של אצטון בדרגת HPLC כשצד הממברנה כלפי מעלה. סובבו בעדינות את הכוס למשך שתי דקות כדי להסיר את ציפוי המגן, והקפידו לא להפוך את השבבים. לאחר מכן, העבירו במהירות את השבבים לכוס של אתנול טהור.
מכסים את הכוס בנייר אלומיניום. סובבו בעדינות את הכוס במשך שתי דקות כדי לסיים את הסרת הציפוי והביאו אותה בצלחת פטרי סגורה לקולט האדים הלמינר. הניחו את השבבים על רקמה טרייה בחדר נקי, והקפידו לא להפוך את השבבים כשהם משתחררים מהפינצטה.
הניחו לשבבים להתייבש מספר דקות. ואז הניחו את השבבים על מגלשת הזכוכית בצלחת הפטרי. סוגרים את צלחת הפטרי ומביאים את השבבים למנקה פלזמה.
הנח את מגלשת הזכוכית והשבבים במנקה הפלזמה והפעל תוכנית ניקוי של חמש דקות כדי להסיר פחמימנים מממברנת ה-SiN. בעזרת מיקרוסקופ אור, בדוק את השבבים לאיתור ממברנות קרועות או חלקיקי לכלוך. השלך שבבים פגומים או מלוכלכים.
במכסה המנוע הזרימה הלמינרית, יש לשתק את השבבים בקופסת הובלה נקייה עם משטח פנימי דביק. מרחו טיפת מיקרוליטר אחת של תמיסת ננו-חלקיקי זהב מימית מיוצבת של שלושה ציטראט מולארי על ממברנת ה-SiN של כל שבב ללא מרווח, ואפשרו לתמיסה להתייבש. לאחר מכן, מרחו מיקרוליטר אחד של מים נטולי יונים על הממברנה כדי לשטוף מלח ופעילי שטח.
לאחר 30 שניות, השתמש בנייר סינון כדי לטפוח בזהירות את המים ולאפשר לשבבים להתייבש. הנח את קצה מחזיק ה-TEM של זרימת הנוזל מתחת למיקרוסקופ אור דו-עיני. הסר את מכסה הטיטניום מקצה המחזיק והנח אותו על יריעת נייר אלומיניום.
הגדר משאבת מזרק מיקרופלואידית עם מזרק זכוכית של מיליליטר אחד המכיל 0.5 מיליליטר מים בדרגת HPLC. חבר את המזרק למערכת הזרימה והפעל את המשאבה. כאשר המים נשטפים דרך המערכת, בדוק את הקווים לאיתור נזילות או התכווצויות זרימה.
בסיום השאיבה, הסר את השטיפה מתא תאי הנוזל וייבש את קצה המחזיק בנייר פילטר. בדוק את קצה המחזיק עם מיקרוסקופ האור. יבש את הקצה עם טישו חדר נקי והסר אבק או סיבים בעזרת פינצטה נקייה מצופה PTFE.
בדוק את מכסה קצה המחזיק, את טבעת ה-O ואת הברגים, והסר אבק או סיבים בעזרת פינצטה מצופה PTFE. הנח את טבעת ה- O בקבוצות המחזיקים. הנח את הבורג הראשון וסובב אותו כמה פעמים כך שהוא פשוט יישאר.
בעזרת פינצטה מעוקלת נקייה, הנח את שבב הדגימה בכיס קצה המחזיק כשקרום ה-SiN פונה כלפי מעלה. השתמש במיקרוסקופ האור הדו-עיני כדי לבדוק שהשבב יושב כהלכה. הנח טיפה של 0.3 מיקרוליטר מים מסוננים טהורים על שבב הדגימה.
החזקת השבב במקומו בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הרם שבב מרווח עם פינצטה מעוקלת מוחזקת הפוך. סובב בזהירות את הפינצטה כך שקרום השבב פונה כלפי מטה.
הנח את שבב המרווח על שבב הדגימה. הנח חומר מחזיר אור מתחת לקצה המחזיק ובדוק את יישור השבב מתחת למיקרוסקופ האור המשקפת. השתמש בפינצטה כדי לכוונן בזהירות את השבבים אם חלונות ה-SiN אינם מיושרים.
לאחר מכן, הרם את מכסה תא הדגימה בעזרת פינצטה. הפוך את המכסה הפוך, ומבלי לגעת בשבבים, הנח את הצד האחורי של המכסה על קצה המחזיק. הנח את הבורג הנותר באמצעות פינצטה והדק את שני הברגים בצורה איטרטיבית.
הדק בזהירות עד שהם נתקלים בהתנגדות. חלונות יכולים להישבר בקלות אם ההידוק חזק מדי. התחל זרימת נוזלים של ארבעה מיקרוליטר לדקה דרך המערכת ובדוק אם יש נזילות בקצה המחזיק.
לאחר מכן, הביאו את המחזיק לתחנת משאבת ואקום ובצעו בדיקת נזילות. ודא שהלחץ יגיע לפחות ל-10 ל-mbar החמישי השלילי תוך חמש דקות. הנח את המחזיק במארז שלו.
והביאו את המחזיק למיקרוסקופ האלקטרונים. הגדר את המיקרוסקופ במצב STEM. מדוד את צפיפות הזרם של קרן האלקטרונים עם סרט פחמן דק המצופה בננו-חלקיקי זהב כדגימת ייחוס ללא מים.
התחל את זרימת המים הטהורים בקצב של לא יותר משני מיקרוליטר לדקה. הכנס את מחזיק ה-TEM של זרימת הנוזל למנעול עומס הוואקום והתחל בפינוי. ודא שהלחץ יורד כרגיל.
ולאחר מכן הכנס את מחזיק ה-TEM במלואו למיקרוסקופ. לאחר שהלחץ נמוך מספיק, פתח את שסתום הקורה והכנס את גלאי מזין המסמכים האוטומטי. הגדר את המיקרוסקופ למצב רכישה רציף ותרגם את שלב הדגימה בכיווני X ו-Y כדי למצוא את חלון ה-SiN.
כוונן את הניגודיות והבהירות כך שקצוות החלון יהיו גלויים בבירור. תרגם את הבמה לכיווני X ו-Y כך שפינה של החלון תהיה במרכז שדה הראייה. לאחר מכן אפס את עדשת האובייקטיב.
התאם את המיקום האנכי של שלב הדגימה כדי למקד את הפינה בגסות. הטה את הבמה בחמש מעלות קדימה ואחורה כדי לבדוק שהדגימה נמצאת בגובה האוצנטרי. מרכז את פינת החלון בשדה הראייה ולאחר מכן אחסן את מיקום הבמה בתוכנה.
תרגם את השלב בכיווני X ו-Y עד שננו-חלקיקי הזהב נראים לעין. ואז למקד את עדשת האובייקטיב. שימו לב לצפיפות הנוכחית וחישבו את עובי התא הנוזלי.
תרגם את השלב לכיווני X ו-Y כדי לאתר אזור עם לפחות 20 ננו-חלקיקי זהב. הגדר את הפרמטרים ורכוש תמונה. ננו-חלקיקי זהב אנו משותקים על קרום סיליקון ניטריד ומצולמים עם STEM פאזה נוזלית.
במים טהורים, ננו-חלקיקי הזהב שמרו על צורתם לאורך כל ההדמיה. תוצרי רדיוליזה מהמים יכולים לחמצן אטומי זהב בודדים שיכולים בסופו של דבר לשנות את צורת הננו-חלקיקים. בניסוי אחר, יוני כלוריד אנו מוכנסים לשלב הנוזל.
ננו-חלקיקי הזהב התמוססו לאט במהלך הניסוי כאשר אטומי הזהב המחומצנים יצרו טטרכלואוריאט מסיס. כדי לחקור את תנועותיהם של ננו-חלקיקי זהב במים, בניסוי שלאחר מכן, הננו-חלקיקים לא היו משותקים לחלוטין על קרום הדגימה. ננו-חלקיקי הזהב הצטברו וכאשר הגיעו לגודל צביר קריטי, יצאו משדה הראייה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. יידרשו מספר שבועות של הכשרה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד ברוגע ולבדוק את אטימות הוואקום ועובי הנוזל.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים במדעי החומרים, כימיה וביולוגיה לחקור צמיחה ותנועה של ננו-חלקיקים בנוזל, את המבנה של חומרים ננומטריים בסביבות נוזליות ואת הפונקציונליות של חלבונים בתאי יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה של ננו-חלקיקי זהב המוטבעים בשכבת מים כולל טעינה נכונה של מחזיק הדגימה והתאמת המיקרוסקופ. אל תשכח שעבודה עם נוזל במיקרוסקופ אלקטרונים עלולה לגרום לנזק אם מחזיק הדגימה אינו נטען כהלכה.
לכן חשוב לבדוק אם יש דליפת ואקום לפני הטעינה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את פעולת מחזיק דגימת זרימת נוזלים למיקרוסקופיה אלקטרונית של העברה סורקת של AuNPs במים, המאפשרת את התצפית על תהליכים דינמיים בקנה מידה ננומטרי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוסקופיה אלקטרונית של העברה סורקת
- ננו-חומרים
- הדמיית פאזה נוזלית
רקע
- מיקרוסקופיה אלקטרונית של העברה סורקת בפאזה נוזלית מאפשרת תצפית על ננו-חומרים בסביבה נוזלית.
- טכניקה זו מספקת מידע מורפולוגי בקנה מידה ננומטרי על דגימות.
- היא מועילה במיוחד לחקר דגימות ביולוגיות במצבן הנוזלי הטבעי.
- משתמשים חדשים עשויים למצוא את טעינת הדגימה ואיסוף התמונות מאתגרים.
מטרת המחקר
- לצפות במבנים ותופעות של ננו-חומרים בדגימות ביולוגיות.
- לחקור את התנהגותם של ננו-חומרים בנוזל.
- להעמיק את ההבנה של תהליכים דינמיים בקנה מידה ננומטרי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ניקיון והכנת מיקרו-שבבים של SiN לטעינת דגימה.
- מריחת תמיסת ננו-חלקיקי זהב על המיקרו-שבבים.
- שימוש במחזיק TEM של זרימת נוזלים לצורך הדמיה.
- ביצוע בדיקות דליפה והבטחת יישור נכון של המיקרו-שבבים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מדגים בהצלחה את הכנת והדמיה של AuNPs בסביבה נוזלית.
- הוא מתאר את השלבים להבטחת שלמות הדגימה במהלך התהליך.
- התוצאות מצביעות על יעילות מחזיק זרימת הנוזלים בלכידת תהליכים דינמיים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות חשובות על התנהגותם של ננו-חומרים בנוזל.
- היא משפרת את היכולת של מיקרוסקופיה אלקטרונית לחקר דגימות ביולוגיות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים שונים במדע החומרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
