מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

מטרת מתודולוגיה זו היא לטפל ברקמות עדינות מצמחים, אומיצטים ופטריות, לצורך תצפית אופטימלית תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או SEM. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות הנוגעות כמעט לכל פטריה, חיידק, מורפור, וכיצד הם מדביקים, מתיישבים ונצמדים לפונדקאי שלהם. הטכניקה במתודולוגיה המשופרת שלנו היא לקיבוע דגימות, למקום שבו המי-טו-מין במערכות אקולוגיות ימיות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להמחיש היבטים מרכזיים של זיהום באמצעות משאבים יקרים וזמינים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהשלבים שונו בפראות מהפרוטוקולים המסורתיים. ושיטות שפורסמו מתארות נהלים כלליים ללא פירוט.

כדי להתחיל, הכינו את הפורמול והאלכוהול האצטי, או קיבוע FAA בארון אדים המצויד במסנן אלדהיד. ב-85 חלקים של 70% אתנול מפוגל, 10 חלקים של תמיסת פורמלדהיד 60% וחמישה חלקים של חומצה אצטית קרחונית מתחת לארון האדים, שפכו את מלאי ה-FAA למיכלים בודדים.

בחר את המריסטמים הפרחוניים או הצמחיים לתיקון, וודא שהם לא ייפגעו מחרקים, פטריות או תנאי מזג אוויר קיצוניים. חותכים את הענפים, מסירים חומר לא רצוי ומפקידים את הדגימה מיד בתמיסת ה-FAA. לאחר 72 עד 96 שעות, שפכו את ה-FAA למיכל פלסטיק לסילוק כימיקלים.

שטפו מיד את הדגימות שלוש פעמים עם אתנול טרי של 70% כדי להסיר שאריות FAA. ניתן לאחסן חומר קבוע ללא הגבלת זמן באתנול 70%. נתחו את הדגימות לצלחת פטרי מכוסה באתנול כדי למנוע את התייבשות הרקמות.

השתמש בצלחת פטרי כשהבסיס מכוסה בסיליקון שחור יבש כדי לראות טוב יותר את הרקמה הלבנה המנוגדת. העבירו את הרקמה למיכלים נפרדים ולאחר מכן טבלו אותם בצלחת פטרי עם 70% אתנול. הניחו את המכסים על המיכלים והפקידו אותם בצינור צנטריפוגה מפלסטיק עם הרבה אתנול 70%.

העבירו את החומר המנותח דרך סדרת אתנול בצנצנות הרמטיות או בצינורות צנטריפוגה. השאירו את הדגימות בכל תמיסה למשך שעה לפחות. לאחר מכן שמור את הדגימות למשך הלילה בתמיסת אתנול של 100%.

לאחר סדרת האתנול, העבירו את המיכלים עם החומר ל-CPD. כתבו את מספר זיהוי המדגם מתחת למחזיקי הדגימה של SEM. לאחר מכן מכסים את החלק העליון של הדודים בסרט דו צדדי.

הנח את הדודים לתוך מחזיק דגימה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, פתח בזהירות את המיכלים הנושאים את הדגימות הצעירות והעדינות שכבר יובשו ב- CPD. זכור כי לאחר הטיפול ב- CPD, הדגימות הופכות קלות יותר ורגישות לאלקטרוסטטיקה.

סגור את המיכלים לאחר הוצאת הדגימות כדי למנוע אבק או זיהומים. הניחו את הדגימות על המשטח הדביק של הדודים, ותכננו מראש את המיקום הרצוי. ברגע שהדגימות נוגעות במשטח, קשה מאוד להסיר אותן.

אל תנסה לבצע דיסקציה גדולה בשלב זה. פשוט הסר את הרקמה הלא רצויה שקל להרים. למחקרים פלינולוגיים, נתחו את האנתרים ופתחו אותם כדי לחשוף את האבקה על הבדלים.

שמור את הדגימות מוגנות למשך הלילה במיכל הרמטי עם סיליקה ג'ל כדי למנוע התייבשות מחודשת. צפו את הדגימות באמצעות ציפוי הספוטר והעבירו אותן ל-SEM כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבדוק את הצמיחה הדיפרנציאלית של עמודי השדרה של הציסטות על צלחות פטרי נפרדות, הניחו 0.5 מיליליטר מתרחיף הציסטה המשני על משטחים שונים.

משטחים יכולים לכלול רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת פחמן, זהב ונחושת. בעבר, סלמון מולבן וקשקשי דג הייק וכיסוי זכוכית. דגרו את הציסטות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 70 דקות, מה שמעדיף את הצמדת הציסטות לפני השטח.

הסר את הנוזל והוסף 0.5 מיליליטר של 2% גלוטרלדהיד לכל משטח לקיבוע הציסטות. שמור את הדגימות בטמפרטורת החדר מתחת לארון אדים למשך שעה. הסר את הגלוטרלדהיד וייבש את הדגימות באמצעות סדרת אתנול, והוסף חמישה מיליליטר מכל אחת מתמיסות האתנול למשך 15 דקות.

לאחר תמיסת 100% אתנול האחרונה, ניתן לאחסן את הדגימה עד חודש בצלחת פטרי אטומה. העבירו בזהירות את הרשתות והמאזניים מצלחת הפטרי למחזיק המתאים ל-CPD השומר על הדגימות מופרדות זו מזו, כגון מחזיק רשת CPD, או מחזיק דגימת ערימה. קח את הרשת והקשקשים בעזרת פינצטה, תוך התחשבות בכך שהציסטות צריכות להיות פונות כלפי מעלה על הרשתות בכל עת.

המשך לייבש את החומר באמצעות ה-CPD לפני ביצוע הכנת דגימת SEM של הביציות כדי לצפות בהתנהגותן על משטחים שונים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עטפו כל דגימה בזהירות בנייר פילטר היוצרים מעטפות עיפרון בגודל של כ-0.5 עד סנטימטר רבוע אחד. הקפד לא לרסק את הדגימות.

אטום את נייר הסינון בעזרת מהדקי נייר. לאחר מכן העבירו את הדגימות הארוזות לצלחת פטרי וטבלו אותן ב-10 מיליליטר מים כדי להחזיר לחות לרקמה סביב הנבגים. הכניסו מיד את הדגימות למיקרוגל.

הסר את החומר ברגע שהמים מתחילים להתאדות ואפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו את הדגימה דרך סדרת אתנול. בהתאם לכמות הדגימה, השתמש בכוס או בצינור צנטריפוגה לשלב זה.

השאירו את הדגימות למשך 15 דקות בכל תמיסה. לאחר מכן, הנח את הדגימות ב-CPD כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להרכיב את הנבגים לתצפית SEM, פתח את המעטפות.

לאחר מכן אוספים את הנבגים עם המשטח הדביק של הבדלים, מקפידים לא לרסק אותם. לבסוף, בצע ציפוי זהב של הדגימות ותצפית SEM כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן ניצנים פרחוניים של anacyclus clavatus שטופלו באוסמיום טטרוקסיד והוכנו באמצעות פרוטוקול FAA CPD המודגם בסרטון זה.

כמו כן מוצגות דגימות מיובשות של Phellorinia herculanea ללא כל טיפול, כמו גם נבגי פטריות שטופלו כפי שמודגם בסרטון זה. נתון זה ממחיש את התפתחות הפרחים המוקדמת, האמצעית והמאוחרת שנלכדה תחת ה-SEM. תמונה זו היא של מבט עליון של רה-צ'ים צעיר.

מוצג כאן ניצן פרחוני במהלך התמיינות גינזיום ופרח באנתזה. מבנים מסוימים יכולים להיות קשים לתיקון ולשימור לצורך הדמיה תחת ה-SEM. דוגמאות כוללות כאלה המגיעים מסביבות רטובות, כמו גם כאלה עם קישוטים, וכאלה עם אינדומנטה.

מוצגים כאן דפוסי גדילה דיפרנציאליים של הקוצים של saprolegnia parasitica על קשקשי זכוכית, פחמן, נחושת, זהב, קשקשי הייק וקשקשי סלמון. זהו סרטון המציג את מחזור החיים הא-מיני של saprolegnia parasitica. מחזור החיים הא-מיני חשוב לפיזור האורגניזמים הללו בסביבתם המימית או הלחה.

יתר על כן, דורבי גן החיות המיוצרים בשלב זה מייצגים את יחידת ההדבקה העיקרית במינים טפיליים מסדר saprolegnials. בעוד ששליטה בטכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלושה עד חמישה ימים, היא מבוצעת כראוי. השתמשנו בכסף כדי להשלים את טיפולי ה- SEM המסופקים לשימוש חיצוני במסגרת זמן זו בגן הבוטני המלכותי במדריד.

לאחר צפייה בסרטון זה, החוקרים יידעו כיצד לאסוף ולתקן ביעילות חומר ביולוגי עדין לתצפית SEM. ניתן להתגבר בקלות על הרס תאים, עיוות איברים או שימור גרוע של דגימות מסביבות רטובות באמצעות הליך זה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתצפית באמצעות SEM מוגבלת למחקר בהגדלה גבוהה של משטחים.

כמו כן, לפני טיפול CPD, יש לשמור על האטמים מפני שינויים מזעזעים ומגע ישיר עם האוויר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיטולוגיה לחקור את מבנה הנבגים במהלך התהליך הזיהומי, במיוחד במינים המעניינים דיג. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ שידור או מדיטציה טרנסנדנטלית על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כיצד המבנה הפנימי של הרכב התא נמצא באיברים או תאים ספציפיים, או אבקה.

אל תשכח שמניפולציה של פורמלין וגלוטרלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו עבודה מתחת לארון אדים ושימוש במסכות, מעילי מעבדה וכפפות, בזמן ביצוע הליך זה.